本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種紙基雙極性電極電化學(xué)發(fā)光分子開關(guān)系統(tǒng)用于快速靈敏基因檢測(cè)致病菌的方法。

背景技術(shù)：

基因檢測(cè)是檢測(cè)致病菌非常重要的一種方法。各種策略和技術(shù)，如實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)，和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)法等，已開發(fā)用以檢測(cè)目標(biāo)病原體的特征基因，并已被用作中央研究實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)方法。然而，這些傳統(tǒng)的方法通常費(fèi)力和耗時(shí)。隨著生物傳感技術(shù)的發(fā)展，某些光學(xué)分析方法，包括比色法，熒光光譜法，化學(xué)發(fā)光法和電化學(xué)發(fā)光(ECL)的發(fā)展已被開發(fā)來解決這些問題。電化學(xué)發(fā)光(ECL)是結(jié)合電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光為一體的方法，它作為最靈敏的光學(xué)分析技術(shù)之一，因?yàn)槠滹@著的優(yōu)點(diǎn)，其中包括高信噪比(SNR)，高靈敏度和空間可控性，吸引了研究者相當(dāng)大的興趣。我們的團(tuán)隊(duì)近十年來一直利用ECL進(jìn)行基因檢測(cè)。不幸的是，我們發(fā)現(xiàn)，這樣的方法通常需要復(fù)雜的探針設(shè)計(jì)和有線電源，這限制了它在資源極其有限的環(huán)境中的床旁診斷(POCT)應(yīng)用。

雙極性電極作為一種導(dǎo)體，一般置于溶液的微管道中，當(dāng)微管道兩端施加電壓時(shí)，溶液和雙極性電極之間電勢(shì)的差別，使其一端成陽極，另一端為陰極，若外加電場(chǎng)足夠大，電活性物質(zhì)會(huì)分別在陽極和陰極發(fā)生氧化和還原反應(yīng)。在過去的十年中，雙極性電極無需導(dǎo)線連接的性質(zhì)使得它與ECL相結(jié)合，已經(jīng)催生了一個(gè)有前途的只需要用一個(gè)直流電源控制的新的檢測(cè)方法。一個(gè)典型的雙極型電極電化學(xué)發(fā)光(BPE-ECL)檢測(cè)系統(tǒng)通常使用三聯(lián)吡啶釕作為ECL發(fā)光體和三丙胺(TPrA)作為共反應(yīng)劑。在這種策略中，其陽極發(fā)生氧化并發(fā)出較強(qiáng)的ECL信號(hào)，同時(shí)氧氣或其他電活性物質(zhì)在陰極發(fā)生還原。與由一個(gè)工作電極，輔助電極，和參考電極構(gòu)成的傳統(tǒng)的三電極ECL結(jié)構(gòu)相比，BPE-ECL系統(tǒng)已被證明是靈敏度高，并且雙極性電極和外加電源之間無需導(dǎo)線相連，故該檢測(cè)裝置的構(gòu)建更簡(jiǎn)便。此外，該系統(tǒng)可以提供一種潛在適于小型化應(yīng)用的方法。

然而，傳統(tǒng)的BPE-ECL檢測(cè)系統(tǒng)通常使用復(fù)雜和相當(dāng)昂貴的微流控技術(shù)，將檢測(cè)腔室集成為微流控芯片。此外，這些技術(shù)需要昂貴的儀器或熟練的技術(shù)人員，這限制了它在床旁診斷中的應(yīng)用。

紙基微流控分析裝置(μPADs)滿足床旁診斷的ASSURED的標(biāo)準(zhǔn)(即，價(jià)格便宜，靈敏度高，特異性好，人性化，快速穩(wěn)定，不需要昂貴的設(shè)備和終端用戶使用方便)，作為強(qiáng)大的工具在最近幾年受到了越來越多的關(guān)注。μPADs利用紙張?zhí)峁┑拿?xì)作用達(dá)到定量和空間控制生物流體的目的，而不需要外部開關(guān)或泵，并且可以使用噴墨打印，蠟印或絲網(wǎng)印刷技術(shù)制作μPADs。簡(jiǎn)單地說，紙基微流控裝置可以被視為常規(guī)微流控芯片的變種或經(jīng)典側(cè)向流動(dòng)試紙條的升級(jí)版本。

但是，在紙上標(biāo)記探針面臨一些挑戰(zhàn)，如需要昂貴探針標(biāo)記物和難以去除非特異性結(jié)合的探針，從而導(dǎo)致相對(duì)高的背景信號(hào)。此外，大多數(shù)紙基檢測(cè)通?；诒壬?，而當(dāng)分析物的濃度較低，所使用的定量或半定量分析達(dá)不到高靈敏度檢測(cè)的要求。由于這些原因，紙基ECL基因檢測(cè)方法的應(yīng)用較少。為了克服這些挑戰(zhàn)，必須開發(fā)一種更靈敏的，便宜的，定量和無標(biāo)記的基因檢測(cè)致病微生物的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種紙基雙極性電極電化學(xué)發(fā)光分子開關(guān)系統(tǒng)用于快速靈敏基因檢測(cè)致病菌的方法。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種紙基雙極性電極電化學(xué)發(fā)光分子開關(guān)系統(tǒng)用于快速靈敏基因檢測(cè)致病菌的方法，包括如下步驟：

將致病細(xì)菌的靶毒力基因的DNA分子片段與含有“光開關(guān)”分子和TPrA的PBS溶液進(jìn)行混合，得到混合液；然后將混合液滴到紙基雙極性電極(pBPE)上；將pBPE正面朝向光電倍增管(PMT)，然后將該pBPE放置到暗盒里；最后，將pBPE的一對(duì)驅(qū)動(dòng)電極連接到一個(gè)直流電源上，施加驅(qū)動(dòng)電壓；在pBPE的陽極獲得一個(gè)ECL信號(hào)，將在10s內(nèi)觀察到的最大的可再現(xiàn)的發(fā)光信號(hào)作為有效的信號(hào)值，即可實(shí)現(xiàn)快速靈敏基因檢測(cè)致病菌的目的。

所述的致病細(xì)菌優(yōu)選為致病性李斯特菌、致病性大腸桿菌、致病性沙門氏菌、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)、志賀氏桿菌(Shigella)、空腸彎曲菌(campylobacter jejuni)或金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)(CMCC 26003)。

所述的致病性李斯特菌優(yōu)選為單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)(CMCC 54007)；

所述的致病性大腸桿菌優(yōu)選為大腸桿菌O157：H7(Escherichia coli O157:H7)(GW1.0202)；

所述的致病性沙門氏菌優(yōu)選為鼠傷寒沙門氏菌(salmonella typhimurium)(CMCC 54007)；

所述的單增李斯特菌的靶毒力基因hlyA特異性的引物如下：

上游引物：5'-AGGAATGACTAATCAAGACAAT-3'；

下游引物：5'-GGAAGGTCTTGTAGGTTCAT-3'。

所述的“光開關(guān)”分子為[Ru(bpy)₂dppz]²⁺或[Ru(phen)₂dppz]²⁺，濃度優(yōu)選為30μM～0.1mM；更優(yōu)選為0.1mM；

所述的TPrA的濃度優(yōu)選為10mM～50mM。更優(yōu)選為50mM；

所述的PBS溶液為pH＝6.9、0.1M的PBS溶液；

所述的驅(qū)動(dòng)電壓設(shè)定為850V。

所述的紙基雙極性電極電化學(xué)發(fā)光分子開關(guān)系統(tǒng)用于快速靈敏基因檢測(cè)致病菌的方法，具體包括如下步驟：

(1)細(xì)菌DNA提取和PCR擴(kuò)增

將1mL菌種置于10mL LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)12h，然后按照TIANamp細(xì)菌DNA試劑盒的試劑和說明書的方法提取細(xì)菌DNA，最后重懸在50μL的TE緩沖液中備用；取1μL提取的細(xì)菌DNA和一對(duì)單增李斯特菌靶毒力基因hlyA特異性的引物加入反應(yīng)體積為25μL的PCR擴(kuò)增體系中，按照設(shè)定的PCR擴(kuò)增程序，在熱循環(huán)PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的產(chǎn)物的長(zhǎng)度為179bp；PCR產(chǎn)物最后用pBPE-ECL系統(tǒng)進(jìn)行分析。

(2)紙基雙極性電極的制作

絲網(wǎng)印刷的網(wǎng)板的圖案形狀用Adobe Illustrator CS6設(shè)計(jì)，然后制作成網(wǎng)板(鋁框200目尼龍網(wǎng)板)；網(wǎng)板的開口產(chǎn)生紙的疏水區(qū)域，而具有交聯(lián)光敏材料的部分，則得到親水性的區(qū)域；用蠟印的方法產(chǎn)生親水的通道，然后用絲網(wǎng)印刷的方法將導(dǎo)電碳油墨在紙通道上制作雙極性電極和驅(qū)動(dòng)電極；紙基雙極性電極的制作過程如下：首先，將濾紙裁剪成合適的尺寸(100毫米×80毫米)，并在紙張上通過網(wǎng)板絲網(wǎng)印刷上碳電極，然后置于100℃的烘箱8分鐘，并將其冷卻到室溫；然后，將紙基電極置于紙張通道絲網(wǎng)膜的下方，將固體蠟通過絲網(wǎng)膜擦到紙張上；為了讓更多的固體蠟印到紙上，用光滑的勺狀的金屬器具進(jìn)一步按壓絲網(wǎng)膜；紙被蠟印之后，和網(wǎng)板一起置于加熱板上，并加熱至80℃，約10秒，以將蠟熔化進(jìn)紙，以形成疏水屏障。

(3)pBPE-ECL檢測(cè)

紙基雙極性電極制作完成后，將步驟(1)中的PCR產(chǎn)物進(jìn)行pBPE-ECL檢測(cè)；首先，將所制備的pBPE裁剪成單個(gè)，置于一個(gè)3D打印的一對(duì)塑料襯底中組裝成芯片；然后，將含有5μL上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的溶液與在0.1M的PBS(pH為6.9)中制備的含有[Ru(phen)₂dppz]²⁺和TPrA的混合液定容至25μL，將混合液滴到pBPE的中心。將滴加溶液后的pBPE翻轉(zhuǎn)，確保pBPE正面朝向PMT，然后將該pBPE芯片放置到暗盒里。最后，將芯片的一對(duì)驅(qū)動(dòng)電極連接到一個(gè)直流電源上通電之前，需要等待30～60s，以確保整個(gè)紙基芯片的通道被溶液浸潤(rùn)。接著，施加適當(dāng)?shù)尿?qū)動(dòng)電壓。之后約5s，在pBPE的陽極可以獲得一個(gè)ECL信號(hào)。

(4)數(shù)據(jù)采集和分析

由光電倍增管收集的pBPE陽極的ECL信號(hào)被PMT放大，模擬信號(hào)被晶體管-晶體管邏輯(TTL)識(shí)別，并使用由LabView軟件程序控制的多功能采集卡(PCI-1751，研華，臺(tái)灣)進(jìn)行采集，最終用基于Labview的光子計(jì)數(shù)的計(jì)算機(jī)程序記錄，并用于進(jìn)一步的分析；在實(shí)驗(yàn)中觀察到的ECL信號(hào)不是一個(gè)穩(wěn)定的數(shù)值，實(shí)際上隨著時(shí)間衰減，這種現(xiàn)象可是由于發(fā)光體的不可逆的分解造成的；實(shí)驗(yàn)中，我們將在10s內(nèi)觀察到的最大的可再現(xiàn)的發(fā)光信號(hào)作為有效的信號(hào)值。

步驟(1)中所述的PCR擴(kuò)增體系包含：終濃度0.2U/μL的Taq DNA聚合酶，不同濃度的靶DNA(10⁶copies/μL，10⁵copies/μL，10⁴copies/μL，10³copies/μL，10²copies/μL和10copies/μL)，0.2mM的dNTP，1×PCR緩沖液，和40nM的每種引物(即上游引物和下游引物)?？瞻讓?duì)照則不包含DNA模板。

步驟(1)中所述的序列如下：

上游引物：5'-AGGAATGACTAATCAAGACAAT-3'；

下游引物：5'-GGAAGGTCTTGTAGGTTCAT-3'。

步驟(1)中所述的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋菏紫?5℃下變性5分鐘；循環(huán)條件如下：變性95℃30秒，退火56℃30秒，和72℃延伸40秒，上述程序總共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后延伸8分鐘。

步驟(3)中所述的[Ru(phen)₂dppz]²⁺和TPrA的濃度分別優(yōu)選為30μM～0.1mM和10mM～50mM。

步驟(4)中所述的光電倍增管的電壓設(shè)定為850V。

本發(fā)明的基本原理如圖1所示：

在這項(xiàng)研究中，我們首次利用紙質(zhì)雙極性電極電化學(xué)發(fā)光(pBPE-ECL)結(jié)合“光開關(guān)”分子[Ru(phen)₂dppz]²⁺(phen＝1,10-菲咯啉；dppz＝dipyridophenazine)開發(fā)了一種低成本，無線，靈敏度高和無標(biāo)記的致病細(xì)菌DNA分析方法。[Ru(phen)₂dppz]²⁺已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以以高親和力插入DNA的堿基對(duì)中，并通過三聯(lián)體金屬配體電荷轉(zhuǎn)換(MLCT)的三重激發(fā)態(tài)產(chǎn)生一個(gè)ECL信號(hào)。該方法的檢測(cè)原理是基于[Ru(phen)₂dppz]²⁺同時(shí)具備“分子光開光”和能發(fā)生電化學(xué)發(fā)光的兩個(gè)性質(zhì)，它在在溶液狀態(tài)下，水分子通過氫鍵與嵌入配位體的吩嗪氮原子連接，使得吩嗪氮原子質(zhì)子化，導(dǎo)致三聯(lián)體金屬配體電荷轉(zhuǎn)換(triplet metal-to-ligand charge transfer，MLCT)激發(fā)態(tài)失活，從而使得[Ru(phen)₂dppz]²⁺不發(fā)生電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；然而當(dāng)將DNA加入到該復(fù)合物的溶液中以后，平面的配位體嵌入雙螺旋DNA分子“大溝”部位的堿基對(duì)之間，使吩嗪氮原子受到了保護(hù)，三聯(lián)體金屬配體處于激發(fā)態(tài)，可以和三丙胺(TPrA)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，并釋放出光子，從而可以觀察到顯著的電化學(xué)發(fā)光。這種pBPE-ECL裝置通過蠟印制作親水通道，通過絲網(wǎng)印刷制作碳墨BPE作為電子導(dǎo)體加上另外兩個(gè)碳墨電極作為驅(qū)動(dòng)電極。一對(duì)李斯特菌特異性靶向hlyA毒力基因的引物被用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，以產(chǎn)生雙鏈DNA(dsDNA)的擴(kuò)增產(chǎn)物?！肮忾_關(guān)”分子[Ru(phen)₂dppz]²⁺被用來以插入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雙鏈DNA的堿基對(duì)中，然后將其直接滴加到pBPE-ECL上進(jìn)行ECL檢測(cè)。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，低至10copies/μL單增李斯特菌的基因組DNA的可以被檢測(cè)出來。該裝置也被用來從鼠傷寒沙門氏菌，大腸桿菌O157：H7和金黃色葡萄球菌中特異性區(qū)分單增李斯特菌。因?yàn)樵撛O(shè)備構(gòu)造簡(jiǎn)單，一次性的，快速，低成本，無標(biāo)記并具有靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，如果將來以電池作為電源和智能手機(jī)作為信號(hào)讀出，這種pBPE-ECL分子開關(guān)系統(tǒng)具有在發(fā)展中國家或者在資源有限的偏遠(yuǎn)地區(qū)用于床旁基因檢測(cè)病原菌的巨大潛力。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

(1)該方法利用分子開關(guān)的性質(zhì)，可以達(dá)到非標(biāo)記檢測(cè)的目的；

(2)該紙基雙極性電極電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)靈敏度高；

(3)該紙基雙極性電極為一次性可拋棄芯片，成本低；

(4)雙極性電極和外加電源之間無需導(dǎo)線相連，故該檢測(cè)裝置的構(gòu)建更簡(jiǎn)便。

附圖說明

圖1是紙基雙極性電極電化學(xué)發(fā)光分子開關(guān)系統(tǒng)的檢測(cè)原理；

圖2是紙基雙極性電極的尺寸；

圖3是紙基雙極性電極的制作過程示意圖；

圖4是紙基雙極性電極電化學(xué)發(fā)光分子開關(guān)系統(tǒng)的靈敏度分析；

圖5是紙基雙極性電極電化學(xué)發(fā)光分子開關(guān)系統(tǒng)的特異性分析。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

1.細(xì)菌DNA提取和PCR擴(kuò)增

鼠傷寒沙門氏菌(CMCC 50040)，大腸桿菌(O157：H7GW1.0202)，單增李斯特菌(CMCC 54007)和金黃色葡萄球菌(CMCC 26003)購自微生物學(xué)(中國，廣州)廣州研究所。引物由上海生工(上海，中國)合成。PCR擴(kuò)增試劑，包括10×PCR緩沖液(加Mg²⁺)，三磷酸脫氧核苷酸(的dNTP)混合物和Taq DNA聚合酶均從寶生物工程有限公司(大連，中國)購買。SYBR Green I染料從賽百盛基因有限責(zé)任公司(中國，北京)購買。DS^TM 2000 DNA marker，其中包含2000-，1000-，750-，500-，250-和100bp的DNA片段，是由東勝生物科技有限公司(中國，廣州)提供。按照TIANamp細(xì)菌DNA試劑盒的試劑和說明書的方法提取細(xì)菌DNA，然后重懸在50μL的TE緩沖液。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體積為25μL體系，包含：終濃度0.2U/μL的Taq DNA聚合酶，不同濃度的靶DNA(10⁶copies/μL，10⁵copies/μL，10⁴copies/μL，10³copies/μL，10²copies/μL和10copies/μL)，0.2mM的dNTP，1×PCR緩沖液，和40nM的每種引物(即，上游引物和下游引物)?？瞻讓?duì)照則不包含DNA模板。李斯特菌靶毒力基因hlyA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為179堿基對(duì)。所述序列如下：

上游引物：5'-AGGAATGACTAATCAAGACAAT-3'；

下游引物：5'-GGAAGGTCTTGTAGGTTCAT-3'。

PCR反應(yīng)在熱循環(huán)PCR儀中進(jìn)行，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋菏紫?5℃下變性5分鐘。循環(huán)條件如下：變性95℃30秒，退火56℃30秒，和72℃延伸40秒。上述程序總共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。最后延伸8分鐘。PCR產(chǎn)物最后用pBPE-ECL系統(tǒng)進(jìn)行分析。

2.pBPE的制作

濾紙(Ф＝125.0毫米，纖維素濾紙)從杭州沃華濾紙有限公司(中國浙江)購買，適當(dāng)裁剪以后使用。導(dǎo)電碳油墨購自徐州博匯新材料科技有限公司(中國徐州)(型號(hào)CNB-7，<60Ω/cm²)，將其用于驅(qū)動(dòng)電極的制作材料)。固體蠟和光滑匙狀的金屬器皿購自當(dāng)?shù)匕儇浌尽Ｓ孟炗〉姆椒óa(chǎn)生親水的通道，然后用絲網(wǎng)印刷的方法將導(dǎo)電碳油墨在紙通道上制作雙極性電極和驅(qū)動(dòng)電極。絲網(wǎng)印刷的圖案形狀用Adobe Illustrator CS6設(shè)計(jì)，然后交付給廣州聯(lián)昌印刷器材店制作網(wǎng)板(鋁框200目尼龍網(wǎng)板)。網(wǎng)板的開口產(chǎn)生紙的疏水區(qū)域，而具有交聯(lián)光敏材料的部分，則得到親水性的區(qū)域。pBPE芯片的制作過程(見圖3所示)如下：首先，將濾紙裁剪成合適的尺寸(100毫米×80毫米)，并在紙張上通過網(wǎng)板絲網(wǎng)印刷上碳電極，然后置于100℃的烘箱8分鐘，并將其冷卻到室溫。然后，將紙基電極置于紙張通道絲網(wǎng)膜的下方，將固體蠟通過絲網(wǎng)膜擦到紙張上。為了讓更多的固體蠟印到紙上，用光滑的勺狀的金屬器具進(jìn)一步按壓絲網(wǎng)膜。紙被蠟印之后，和網(wǎng)板一起置于加熱板上，并加熱至80℃，約10s，以將蠟熔化進(jìn)紙，以形成疏水屏障；得到紙質(zhì)雙極性電極。所述的紙質(zhì)雙極性電極的尺寸見圖2所示。

3.pBPE-ECL檢測(cè)

TPrA(≥98％，編號(hào)：102-69-2)從Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，密蘇里州，美國)購買。芯片制作完成后，進(jìn)行pBPE-ECL檢測(cè)。首先，將所制備的pBPE裁剪成單個(gè)，置于一個(gè)3D打印的一對(duì)塑料襯底中組裝成芯片，然后將芯片的一對(duì)驅(qū)動(dòng)電極連接到一個(gè)直流電源上。最后，將含有5μL上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的溶液與在0.1M的PBS(pH為6.9)中制備的含有0.1mM[Ru(phen)₂dppz]²⁺和50mM TPrA的混合液定容至25μL，將混合液滴到pBPE的中心。將滴加溶液后的pBPE翻轉(zhuǎn)，確保pBPE正面朝向PMT，然后將該pBPE芯片放置到暗盒里。通電之前，需要等待30～60s，以確保整個(gè)紙基芯片的通道被溶液浸潤(rùn)。接著，施加適當(dāng)?shù)尿?qū)動(dòng)電壓。之后約5s，在pBPE的陽極可以獲得一個(gè)ECL信號(hào)。

4.數(shù)據(jù)采集和分析

直流電源(型號(hào)LW-K605D)從龍威儀表儀器有限公司(中國香港)購買。光電倍增管的電壓(PMT；MP-962型，Perkin Elmer公司，威斯巴登，德國)設(shè)定為850V。由光電倍增管收集的ECL信號(hào)被PMT放大，模擬信號(hào)被晶體管-晶體管邏輯(TTL)識(shí)別，并使用由LabView軟件程序控制的多功能采集卡(PCI-1751，研華，臺(tái)灣)進(jìn)行采集，最終用基于Labview的光子計(jì)數(shù)的計(jì)算機(jī)程序記錄，并用于進(jìn)一步的分析。在實(shí)驗(yàn)中觀察到的ECL信號(hào)不是一個(gè)穩(wěn)定的數(shù)值，實(shí)際上隨著時(shí)間衰減，這種現(xiàn)象可是由于發(fā)光體的不可逆的分解造成的。實(shí)驗(yàn)中，我們將在10s內(nèi)觀察到的最大的可再現(xiàn)的發(fā)光信號(hào)作為有效的信號(hào)值。

為了驗(yàn)證我們的新開發(fā)的pBPE-ECL檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度，將不同濃度的李斯特菌DNA(10⁶copies/μL，10⁵copies/μL，10⁴copies/μL，10³copies/μL，10²copies/μL和10copies/μL)分別加入PCR擴(kuò)增體系中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物然后分別用0.1mM的[Ru(phen)₂dppz]²⁺和50mM TPrA孵育，來評(píng)估pBPE-ECL檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度。如圖4所示，ECL強(qiáng)度隨著DNA濃度從10copies/μL到10⁶copies/μL的增加而呈線性增加的趨勢(shì)。不同濃度靶DNA和陰性對(duì)照的最大ECL發(fā)光信號(hào)如圖所示。這表明該系統(tǒng)能夠高靈敏度地檢測(cè)單增李斯特菌。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證pBPE-ECL檢測(cè)系統(tǒng)的特異性，將從單增李斯特菌，鼠傷寒沙門氏菌，大腸桿菌O157：H7和金黃色葡萄球菌中提取的10⁶copies/μL靶DNA與之前使用的單增李斯特菌相同的特異性引物分別加入PCR擴(kuò)增體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后的DNA產(chǎn)物然后分別用0.1mM的[Ru(phen)₂dppz]²⁺和50mM TPrA孵育，來評(píng)估pBPE-ECL檢測(cè)系統(tǒng)的特異性。如圖5所示，只有單增李斯特菌特異性擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物結(jié)合[Ru(phen)₂dppz]²⁺以后表現(xiàn)出顯著的ECL信號(hào)。鼠傷寒沙門氏菌，大腸桿菌O157：H7，金黃色葡萄球菌和對(duì)照組表示沒有雙鏈PCR產(chǎn)物產(chǎn)生，所以ECL信號(hào)較低。這些結(jié)果證實(shí)，所設(shè)計(jì)的pBPE-ECL檢測(cè)系統(tǒng)可以在鼠傷寒沙門氏菌，大腸桿菌O157：H7，金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌中特異性區(qū)分出單增李斯特菌。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。