本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及一種刺五加注射液的成分檢驗方法，更具體涉及對刺五加注射液中12種主要成份的含量測定方法。
背景技術(shù)：
：刺五加注射液為刺五加經(jīng)提取加工而制成的滅菌水溶液，有平補(bǔ)肝腎，益精壯骨之功能，主治肝腎不足所致的短暫性腦缺血發(fā)作，腦動脈硬化，腦血栓形成，腦栓塞等。刺五加的化學(xué)成分主要包括苯丙酸類、香豆素類、木脂素類、含氮堿基類、糖、氨基酸等。由于刺五加注射液中成分種類較多，其中主要化學(xué)成分包括苯丙素類、三萜類、黃酮類、含氮化合物、糖類等。目前還沒有一種檢測分析方法能夠較為全面、快速、準(zhǔn)確地檢測刺五加注射液中的主要成分及含量。通常是對其中的各類成分進(jìn)行單獨(dú)檢驗。例如，現(xiàn)有對刺五加注射液中總苷類物質(zhì)的含量測定方法為：以紫丁香苷為對照品，依照分光光度法在265nm波長處測定吸收度，計算刺五加注射液中總苷的含量。而對總苷類中的具體成分，則是分別采用不同方法測定。例如，中國專利申請201210049755公開了紫丁香苷和刺五加苷E含量的檢測方法，采用超高效液相色譜法，應(yīng)用ACQUITYUPLCBEHC18色譜柱，柱溫為40℃，流速為每分鐘0.3mL，檢測波長為220nm，理論板數(shù)按紫丁香苷峰計算應(yīng)不低于30000，刺五加苷E峰的分離度應(yīng)達(dá)到1.5，梯度洗脫程序如下：0分鐘時，流動相為5％的乙腈和95％的體積比為0.1％的磷酸溶液；3.2分鐘時，流動相為9.2％的乙腈和90.8％的體積比為0.1％的磷酸溶液；10.0分鐘時，流動相為22％的乙腈和78％的體積比為0.1％的磷酸溶液；12.0分鐘時，流動相為100％的乙腈；15.0分鐘時，流動相為5％的乙腈和95％的體積比為0.1％的磷酸溶液。又例如，現(xiàn)有對刺五加注射液中總糖類物質(zhì)的測定方法為以葡萄糖為對照品，依照分光光度法在490nm波長處測定吸收度，計算刺五加注射液中總糖的含量。上述方法雖然能夠快速獲得刺五加注射液中的某類成分的含量，但是無法對該類物質(zhì)所包含的具體成分進(jìn)行定量分析，需要分別針對各個成分進(jìn)行含量測定，分析測定過程相對較為繁復(fù)，耗時較長。另一方面，中國專利申請200410044162公開了一種刺五加指紋圖譜檢測方法。該方法雖然高效液相色譜的方法實現(xiàn)了一次檢測識別出刺五加中的14個成分峰。然而上述方法的分離度較低，多個成分峰之間存在明顯重疊；準(zhǔn)確性較低，基線不平穩(wěn)，背景干擾嚴(yán)重；除紫丁香苷以外，沒有識別出其他刺五加苷類物質(zhì)、核苷類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)以及綠原酸等化合物，也沒有提供標(biāo)準(zhǔn)參照；沒有提供各個成分的濃度計算的線性回歸方程，也就無法直觀快速的進(jìn)行各成分濃度的計算；重復(fù)性和準(zhǔn)確性相對較低。中藥注射液由于其成分相對較為復(fù)雜，因此質(zhì)量控制的難度也相對較大。就刺五加注射液而言，含有多種活性成分，如何能夠一次將其中的主要活性成分檢測出并進(jìn)行定量，對其生產(chǎn)制造以及臨床使用中的質(zhì)量監(jiān)控非常重要，然而現(xiàn)有技術(shù)并未很好地解決這一問題。綜上所述，提供一種刺五加注射液的成分檢驗方法，能夠快速高效地對其中的主要活性成分進(jìn)行檢測定量，是其生產(chǎn)制造和臨床應(yīng)用中亟待解決的重要問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明中涉及的超高效液相色譜簡稱為UPLC；高效液相色譜簡稱為HPLC。如未特別說明，本發(fā)明中涉及的百分含量，例如“2％的甲醇溶液”指體積百分比，即“2％的甲醇溶液”指100mL溶液里含有2mL甲醇。如未特別說明，本發(fā)明中涉及的某溶液，例如“甲醇溶液”指其水溶液，即“甲醇溶液”指以水為溶劑的甲醇溶液。如未特別說明，本發(fā)明中涉及的水指超純水。本發(fā)明的目的是提供一種刺五加注射液的成分檢驗方法。所述的刺五加注射液的成分檢驗方法包括能同時檢測胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷、5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、新綠原酸、綠原酸、刺五加苷B、隱綠原酸、異嗪皮啶和刺五加苷E，12個主要成分的UPLC含量測定方法。所述的UPLC含量測定方法包括以下步驟：(1)、供試品溶液的制備：量取待測刺五加注射液，加入甲醇溶液，搖勻后使用0.22μm的微孔濾膜過濾，收集濾液，即為供試品溶液；(2)、UPLC檢測：將步驟(1)得到的供試品溶液進(jìn)行UPLC檢測，應(yīng)用WatersACQUITYUPLCHSST3(2.1×100mm,1.8μm)色譜柱，柱溫為25-40℃，采用體積濃度為0.1-0.6％的甲酸和40％的乙腈水溶液作為流動相A，體積濃度為0.1-0.6％的甲酸水溶液作為流動相B，進(jìn)行梯度洗脫，流速為每分鐘0.25-0.4mL，洗脫液經(jīng)紫外檢測器采集60分鐘之內(nèi)的數(shù)據(jù)。所述的UPLC含量測定方法的步驟(1)中加入的甲醇溶液的濃度為5-15％；優(yōu)選為5-10％；進(jìn)一步優(yōu)選為5-8％。所述的UPLC含量測定方法的步驟(1)中加入的甲醇溶液的體積為刺五加注射液的2-5倍體積；優(yōu)選為2-4倍體積；進(jìn)一步優(yōu)選為3-4倍體積。所述的UPLC含量測定方法的步驟(2)中的柱溫優(yōu)選為25-35℃，進(jìn)一步優(yōu)選為30-35℃。所述的UPLC含量測定方法的步驟(2)中的流動相A優(yōu)選為體積濃度為0.2-0.4％的甲酸和40％的乙腈水溶液；進(jìn)一步優(yōu)選為0.3-0.4％的甲酸和40％的乙腈水溶液。所述的UPLC含量測定方法的步驟(2)中的流動相B優(yōu)選為體積濃度為0.2-0.4％的甲酸水溶液；進(jìn)一步優(yōu)選為0.3-0.4％的甲酸水溶液。所述的UPLC含量測定方法的步驟(2)中的流速優(yōu)選為每分鐘0.3-0.4mL；進(jìn)一步優(yōu)選為每分鐘0.35-0.4mL。所述的UPLC含量測定方法的步驟(2)中的紫外檢測的波長為：胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷、5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、刺五加苷B、刺五加苷E為270nm，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異嗪皮啶為325nm。所述的UPLC含量測定方法的步驟(2)中的梯度洗脫程序為：在開始時，也就是0分鐘時，流動相B為100％；到8分鐘時，流動相A為6％，流動相B為94％；到13分鐘時，流動相A為13％，流動相B為87％；到19分鐘時，流動相A為19％，流動相B為81％；到25分鐘時，流動相A為25％，流動相B為75％；到40分鐘時，流動相A為27％，流動相B為78％；到50分鐘時，流動相A為36％，流動相B為64％；到60分鐘時，流動相A為70％，流動相B為30％。根據(jù)本發(fā)明所述的UPLC含量測定方法，利用上述12個成分的標(biāo)準(zhǔn)品，以濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，所述的12個主要成分的UPLC含量測定方法還包括用于計算上述12個成分的濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，如下所示：成分標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程胞苷Y＝16733.3X+8977.3尿苷Y＝12495.4X+12446.0腺苷Y＝13318.9X+7687.8鳥苷Y＝11027.1X+5539.15-羥甲基糠醛Y＝30937.5X+11744.5原兒茶酸Y＝13940.5X+16545.3新綠原酸Y＝18262.6X+95195.1綠原酸Y＝18472.6X+54605.3刺五加苷BY＝12510.4X+198389.6隱綠原酸Y＝16938.3X+63615.7異嗪皮啶Y＝15791.8X+10735.4刺五加苷EY＝900.2X+2199.1所述的一種刺五加注射液的成分檢驗方法還包括刺五加注射液中4種糖類成分的含量測定方法。所述的4種糖指果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖。所述的刺五加注射液中4種糖含量測定方法是使用高效液相色譜法進(jìn)行測定，包括以下步驟：(1)、供試品溶液的制備：量取待測刺五加注射液，加入乙腈溶液，搖勻后使用0.22μm的微孔濾膜過濾，收集濾液，即為供試品溶液；(2)、將步驟(1)得到的供試品溶液進(jìn)行HPLC檢測：應(yīng)用PrevailCarbohydrateES(4.6×250mm，5μm)色譜柱，柱溫為30-40℃，采用乙腈作為流動相A，水作為流動相B，進(jìn)行梯度洗脫，流速為每分鐘0.6-1.2mL，洗脫液經(jīng)蒸發(fā)光散射檢測器采集55分鐘之內(nèi)的數(shù)據(jù)，檢測器漂移管溫度為90℃，N2霧化氣流速為1L/min；梯度洗脫程序為：在開始時，也就是0分鐘時，流動相A為85％流動相B為15％；到30分鐘時，流動相A為75％，流動相B為25％；到40分鐘時，流動相A為50％，流動相B為50％；到45分鐘時，流動相A為50％，流動相B為50％；到46分鐘時，流動相A為85％，流動相B為15％；到55分鐘時，流動相A為85％，流動相B為15％。所述的刺五加注射液中4種糖含量測定方法的步驟(1)中的加入的乙腈溶液的體積為刺五加注射液的5-12倍；優(yōu)選為5-10倍；進(jìn)一步優(yōu)選為6-10倍。所述的刺五加注射液中4種糖含量測定方法的步驟(1)中的加入的乙腈溶液的溶度為40-80％；優(yōu)選為45-70％；進(jìn)一步優(yōu)選為50-65％。所述的刺五加注射液中4種糖含量測定方法的步驟(2)中的柱溫優(yōu)選為30-36℃；進(jìn)一步優(yōu)選為30-34℃。所述的刺五加注射液中4種糖含量測定方法的步驟(2)中的流速優(yōu)選為每分鐘0.6-1.0mL；進(jìn)一步優(yōu)選為每分鐘0.6-0.8mL。所述的果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的含量測定方法還包括用于計算果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，如下所示，其中濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)：成分標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程果糖Y＝1.51X+6.08葡萄糖Y＝1.55X+4.68蔗糖Y＝1.46X+6.41麥芽糖Y＝1.44X+5.33和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：(1)、本發(fā)明提供的一種刺五加注射液的成分檢驗方法能夠在一管檢測中實現(xiàn)對其中12個主要活性的成分的同時檢測，而常規(guī)方法則是通過對大類成分總量進(jìn)行定量，或針對其中的某種成分采用不同的方法逐個定量。因此本發(fā)明相較常規(guī)方法更加便捷省時，在面對大批量檢驗時，能夠在較短時間內(nèi)獲得可靠的檢驗結(jié)果。(2)、本發(fā)明提供的UPLC檢驗方法獲得的圖譜中成分峰之間分離度高，無重疊，極大程度地保障了檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。(3)、本發(fā)明提供的UPLC檢驗方法獲得的檢測結(jié)果背景干擾小，基線平穩(wěn)，能夠避免雜質(zhì)峰對檢測結(jié)果的影響，使得檢驗結(jié)果更加精確。(4)、本發(fā)明提供的一種刺五加注射液的成分檢驗方法還提供了對上述12個成分進(jìn)行濃度計算的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，可根據(jù)檢測的峰面積計算供試溶液中該成分的濃度，檢測數(shù)據(jù)可直接換算成成分濃度，使得檢測結(jié)果更加直觀。方程的線性范圍較廣，實用性更強(qiáng)，并且相關(guān)系數(shù)均在0.999以上，準(zhǔn)確性高。(5)、本發(fā)明提供的一種刺五加注射液的成分檢驗方法中還包括了對其中4中糖類成分的檢測方法，使得對刺五加注射液的檢測更加全面，能夠獲知其中多種成分的含量。(6)、本發(fā)明提供的一種刺五加注射液的成分檢驗方法靈敏度高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)。綜上所述，本發(fā)明提供的一種刺五加注射液的成分檢驗方法更加方便、高效、穩(wěn)定、準(zhǔn)確，適用性更強(qiáng)，為刺五加注射液的生產(chǎn)質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用安全提供了可靠保障。附圖說明圖1為刺五加注射液中12種主要成分的UPLC圖譜。圖2為刺五加注射液中4種糖類成分的HPLC圖譜。具體實施方式以下實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。對所公開的實施例的下述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例中，而是可以應(yīng)用于符合與本文所公開的原理和新穎特點(diǎn)相一致的更寬的范圍。除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員通常理解的相同意義。術(shù)語：超高效液相色譜(UltraPerformanceLiquidChromatography)在本發(fā)明中簡稱UPLC；高效液相色譜(HighPerformanceLiquidChromatography)在本發(fā)明中簡稱HPLC。ACQUITYUPLC超高效液相色譜儀，配脫氣機(jī)、二元梯度泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器，購自Waters公司；Mill-Q超純水器購自Millipore公司；MettlerXS105型電子天平購自Mettler公司；Minispin離心機(jī)，購自eppendorf公司。乙腈、甲醇為色譜純，購自Merck公司；甲酸為色譜純購自ROCScientific公司及Merck公司；其余試劑均為分析純，購自西格瑪奧德里奇公司；水為Milli-Q超純水。胞苷，批號：36641，HPLC純度：99.0％；尿苷，批號31313，純度：99.5％；腺苷，批號D1303032，純度：99.5％；和鳥苷，批號32979，純度：99.5％購自上海晶純實業(yè)有限公司；5-羥甲基糠醛，批號：130607，HPLC純度：99.64％；原兒茶酸，批號：130509，HPLC純度：99.34％；新綠原酸，批號：130426，HPLC純度：99.20％；綠原酸，批號130602，HPLC純度：99.53％；刺五加苷B，批號：130504，HPLC純度：99.25％；隱綠原酸，批號：130405，HPLC純度：99.37％；異嗪皮啶，批號：130427，HPLC純度：99.69％；和刺五加苷E，批號：130623，HPLC純度：99.42％均購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司。實施例1一種刺五加注射液的成分檢驗方法供試樣品：共28個不同批次的刺五加注射液，由哈爾濱珍寶制藥有限公司生產(chǎn)，批號分別為BS20120801、AS20121101、BS20120803、AS20121102、AS20121103、AS20121104、A20120907、A20120908、A20120909、A20120910、C20120503、C20120507、C20120511、C20120515、C20120521、20120402、20120405、20120411、201306181、201306191、201306201、201308211、201310241、20131031S、20131101S、20131102S、20130513S2、20130513S1。1、胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷、5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、異嗪皮啶、刺五加苷B、刺五加苷E的含量測定方法：照高效液相色譜法測定：(1)、供試品溶液的制備：量取待測刺五加注射液，加入4倍體積的6％甲醇溶液，搖勻后使用0.22μm的微孔濾膜過濾，收集濾液，即為供試品溶液；(2)、UPLC檢測：將步驟(1)得到的供試品溶液進(jìn)行UPLC檢測，色譜條件為：色譜柱：WatersACQUITYUPLCHSST3，2.1×100mm，1.8μm；柱溫：32℃；流速：每分鐘0.3mL檢測波長：胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷、5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、刺五加苷B、刺五加苷E為270nm，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異嗪皮啶為325nm；流動相及梯度洗脫程序：采用體積濃度為0.3％的甲酸和40％的乙腈水溶液作為流動相A，體積濃度為0.3％的甲酸水溶液作為流動相B，在開始時，也就是0分鐘時，流動相B為100％；到8分鐘時，流動相A為6％，流動相B為94％；到13分鐘時，流動相A為13％，流動相B為87％；到19分鐘時，流動相A為19％，流動相B為81％；到25分鐘時，流動相A為25％，流動相B為75％；到40分鐘時，流動相A為27％，流動相B為78％；到50分鐘時，流動相A為36％，流動相B為64％；到60分鐘時，流動相A為70％，流動相B為30％。數(shù)據(jù)采集時間為：60分鐘。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程的制作：取胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷、5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、異嗪皮啶、刺五加苷B、刺五加苷E對照品適量，精密稱定，分別加10％甲醇溶液超聲溶解定容，必要時適當(dāng)加熱助溶，制成濃度分別為胞苷80.00μg/mL、尿苷149.4μg/mL、腺苷91.92μg/mL、鳥苷84.16μg/mL、5-羥甲基糠醛60.48μg/mL、原兒茶酸224.6μg/mL、新綠原酸448.8μg/mL、綠原酸377.9μg/mL、刺五加苷B1057μg/mL、隱綠原酸452.4μg/mL、異嗪皮啶147.4μg/mL和刺五加苷E374.3μg/mL的混合對照品儲備溶液。于4℃保存。精密量取混合對照品儲備液適量，用6％甲醇溶液稀釋制成1/1、4/5、2/5、1/5、1/10、1/20、1/40儲備液濃度的混合對照品溶液。按本實施例1-(2)的方法進(jìn)行UPLC檢測，以濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到12種成分的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。測定結(jié)果：線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)結(jié)果如下，可見線性關(guān)系良好(R≥0.999)，可直接根據(jù)檢測出的峰面積計算相應(yīng)供試品中各個成分的濃度，且線性范圍寬，方便高效、適用性強(qiáng)。成分標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程線性范圍(μg/mL)相關(guān)系數(shù)R胞苷Y＝16733.3X+8977.32.000-80.000.9997尿苷Y＝12495.4X+12446.03.736-149.40.9997腺苷Y＝13318.9X+7687.82.298-91.920.9996鳥苷Y＝11027.1X+5539.12.104-84.160.99975-羥甲基糠醛Y＝30937.5X+11744.51.512-60.480.9997原兒茶酸Y＝13940.5X+16545.35.615-224.60.9997新綠原酸Y＝18262.6X+95195.111.22-448.80.9994綠原酸Y＝18472.6X+54605.39.447-377.90.9996刺五加苷BY＝12510.4X+198389.626.42-10570.9990隱綠原酸Y＝16938.3X+63615.711.31-452.40.9995異嗪皮啶Y＝15791.8X+10735.43.684-147.40.9997刺五加苷EY＝900.2X+2199.19.357-374.30.9996刺五加注射液中12種主要成分的UPLC圖譜如圖1所示，其中A為標(biāo)準(zhǔn)品圖譜，B為供試刺五加注射液圖譜，峰圖上數(shù)字含義為：1為胞苷、2為尿苷、3為腺苷、4為鳥苷、5為5-羥甲基糠醛、6為原兒茶酸、7為新綠原酸、8為綠原酸、9為刺五加苷B、10為隱綠原酸、11為異嗪皮啶、12為刺五加苷E。由圖1可知本發(fā)明提供的檢驗方法獲得峰圖中的特征峰的保留時間和標(biāo)準(zhǔn)品一致，準(zhǔn)確性高，且峰圖中背景干擾小，幾乎沒有雜峰，基線平穩(wěn)，特征峰明確，且分離度高，檢驗結(jié)果相較于現(xiàn)有技術(shù)更加準(zhǔn)確。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各批次刺五加注射液中12種主要成分的平均含量為：胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷、5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、新綠原酸、綠原酸、刺五加苷B、隱綠原酸、異嗪皮啶和刺五加苷E的平均含量分別為43.44μg/mL、102.1μg/mL、42.75μg/mL、22.18μg/mL、19.16μg/mL、142.9μg/mL、421.5μg/mL、339.0μg/mL、749.9μg/mL、342.0μg/mL、22.88μg/mL和407.1μg/mL。2、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的含量測定方法：照高效液相色譜法測定：(1)、供試品溶液的制備：量取待測刺五加注射液，加入10倍體積60％的乙腈溶液，搖勻后使用0.22μm的微孔濾膜過濾，收集濾液，即為供試品溶液；(2)、將步驟(1)得到的供試品溶液進(jìn)行HPLC檢測：色譜條件為：色譜柱：PrevailCarbohydrateES，4.6×250mm，5μm色譜柱；柱溫：30℃；流速：每分鐘0.8mL；檢測條件：蒸發(fā)光散射檢測器采集55分鐘之內(nèi)的數(shù)據(jù)，檢測器漂移管溫度為90℃，N2霧化氣流速為1L/min；流動相及梯度洗脫程序：采用乙腈作為流動相A，水作為流動相B，進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序為：在開始時，也就是0分鐘時，流動相A為85，％流動相B為15％；到30分鐘時，流動相A為75％，流動相B為25％；到40分鐘時，流動相A為50％，流動相B為50％；到45分鐘時，流動相A為50％，流動相B為50％；到46分鐘時，流動相A為85％，流動相B為15％；到55分鐘時，流動相A為85％，流動相B為15％。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程的制作：分別精密稱取果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖對照品適量于同一量瓶中，加60％乙腈溶液超聲溶解定容，制成濃度分別為果糖2040μg/mL、葡萄糖1685μg/mL、蔗糖1460μg/mL、麥芽糖1690μg/mL的混合對照品儲備液，于4℃保存。精密量取混合對照品儲備液適量，用60％乙腈溶液稀釋制成1/2、2/5、3/10、1/5、1/10、1/20儲備液濃度的混合對照品溶液。按2.3項下色譜條件分別進(jìn)樣分析，以濃度的對數(shù)(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積對數(shù)(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到4種糖的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。測定結(jié)果：線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)結(jié)果如下，可見線性關(guān)系良好(R≥0.997)，可直接根據(jù)檢測出的峰面積計算相應(yīng)供試品中各個成分的濃度，且線性范圍寬，方便高效、適用性強(qiáng)。成分標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程線性范圍(μg/mL)相關(guān)系數(shù)R果糖Y＝1.51X+6.08102.0～10200.9979葡萄糖Y＝1.55X+4.6884.25～842.50.9999蔗糖Y＝1.46X+6.4173.00～730.00.9996麥芽糖Y＝1.44X+5.3384.51～845.10.9999刺五加注射液中4種糖類成分的HPLC圖譜如圖2所示，其中A為標(biāo)準(zhǔn)品圖譜，B為供試刺五加注射液圖譜，峰圖上數(shù)字含義為：1為果糖、2為葡萄糖、3為蔗糖、4為麥芽糖。由圖2可知本發(fā)明提供的檢驗方法獲得峰圖中的特征峰的保留時間和標(biāo)準(zhǔn)品一致，準(zhǔn)確性高，且峰圖中背景干擾小，幾乎沒有雜峰，基線平穩(wěn)，特征峰明確，且分離度高，檢驗結(jié)果相較于現(xiàn)有技術(shù)更加準(zhǔn)確。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各批次刺五加注射液中4種糖類成分的平均含量為：果糖7.72mg/mL、葡萄糖6.65mg/mL、蔗糖4.01mg/mL、麥芽糖4.45mg/mL。試驗例1方法專屬性試驗取刺五加注射液供試品溶液，本發(fā)明實施例1中的色譜條件進(jìn)樣分析，聯(lián)用二極管陣列檢測器(波長掃描范圍：190～400nm)。分析各成分峰純度，結(jié)果各成分峰純度良好，證明本發(fā)明提供的檢驗方法具專屬性。試驗例2儀器精密度試驗取刺五加注射液供試品溶液，按實施例1的檢驗方法重復(fù)檢驗6次，結(jié)果如下：12種主要成分的UPLC圖譜中，各成分保留時間的RSD均小于1.0％，峰面積RSD均小于2.9％；4種糖類成分的HPLC圖譜中，各成分峰面積RSD均小于1.9％，表明儀器精密度良好。試驗例3方法重復(fù)性試驗取同一批次刺五加注射液(批號：AS20121102)6份，分別按照實施例1中的檢驗方法進(jìn)行檢驗計算胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷、5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、新綠原酸、綠原酸、刺五加苷B、隱綠原酸、異嗪皮啶和刺五加苷E的含量和果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的含量，結(jié)果刺五加注射液中12種主要成分的含量RSD小于1.9％，4種糖類成分的RSD小于3.2％。表明本發(fā)明的方法具有良好重復(fù)性。試驗例4方法回收率試驗取9份已知各成分含量的刺五加注射液各1.25mL于5mL量瓶中，分別精密加入相當(dāng)于制劑含量80％、100％、120％量的對照品溶液，按照實施例1的檢驗方法進(jìn)行檢驗分析，計算含量和加樣回收率，結(jié)果表明：測得胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷、5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、新綠原酸、綠原酸、刺五加苷B、隱綠原酸、異嗪皮啶、刺五加苷E的平均加樣回收率(n＝9)分別為(99.09±2.03)％、(101.3±2.03)％、(99.47±2.45)％、(98.83±2.78)％、(96.22±3.07)％、(99.62±3.30)％、(99.96±2.30)％、(99.79±2.26)％、(98.60±2.52)％、(99.95±2.30)％、(102.1±1.97)％、(97.04±2.89)％；測得果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的平均加樣回收率分別為(98.40±3.32)％、(100.8±4.41)％、(101.2±3.34)％和(96.89±4.16)％，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度良好，符合方法學(xué)驗證要求。以上所述僅為本發(fā)明的部分對比例和部分較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3