本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的涉及一種快速制備海洋小型魚(yú)類(lèi)或仔稚魚(yú)中期分裂相染色體的方法。

背景技術(shù)：
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染色體是遺傳物質(zhì)的載體，對(duì)魚(yú)類(lèi)染色體的研究，不僅可以探討其分類(lèi)地位和系統(tǒng)演化，也有助于近緣物種的鑒定和群落分析，對(duì)資源的開(kāi)發(fā)利用和遺傳育種都有重要的意義。全世界現(xiàn)存魚(yú)類(lèi)有22000多種，是脊椎動(dòng)物中分布最廣、種類(lèi)最多的類(lèi)群，體現(xiàn)多種多樣的生物學(xué)特性，具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但在脊椎動(dòng)物中，魚(yú)類(lèi)的染色體較小，數(shù)目偏多，有關(guān)染色體研究的進(jìn)展較緩慢，至2005年前后，已有染色體核型報(bào)道的魚(yú)類(lèi)只有2100種左右，約占總數(shù)的10％，這些有染色體記載的魚(yú)類(lèi)主要集中在鯉形目和鱸形目，且大多數(shù)為淡水魚(yú)類(lèi)(高文，魚(yú)類(lèi)染色體研究進(jìn)展，寧德師專(zhuān)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005,17(1)：15-17)，有關(guān)海水魚(yú)類(lèi)染色體記載的報(bào)道還不多，這與海水魚(yú)類(lèi)增養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展不符。

自1966年Ojima等(Ojima Y S，Hitotsumachi S,Makino.Cytogentic studies in lower vertebrates.Proc Jap Acad,1966,42(1):62-66)首次采用低滲處理和空氣干燥法制片，進(jìn)行魚(yú)類(lèi)染色體研究取得成功后，目前的魚(yú)類(lèi)染色體制片都采用這種方法，但采用這種方法要制得大量中期分裂相且染色體圖像清晰的片子較難，不能滿(mǎn)足染色體相關(guān)分析的要求。人們普遍認(rèn)為魚(yú)類(lèi)細(xì)胞分裂指數(shù)低，需要輔助使用PHA(植物血球凝集素)(Yamamoto K,Ojima Y.A PHA-culture method for cells from tissue of teleosts.Japan J Genet,1973,48(3):235-238)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞分裂，以期獲得更多的良好的分裂相，然而這種染色體制備方法因多了PHA處理的程序，對(duì)魚(yú)體多造成一次傷害，而且注射PHA和秋水仙素的方法所需時(shí)間較長(zhǎng)，有些長(zhǎng)達(dá)30多個(gè)小時(shí)，常因試驗(yàn)魚(yú)死亡而告失敗。不同魚(yú)類(lèi)的不同組織細(xì)胞分裂相指數(shù)不盡相同，在大多數(shù)魚(yú)類(lèi)中，造血器官是腎臟(頭腎)，尤其淡水魚(yú)類(lèi)在制作染色體制片時(shí)都采用腎臟組織。按照習(xí)慣用腎臟組織制片，有的魚(yú)類(lèi)的腎臟組織卻不是很發(fā)達(dá)，得不到足夠的分裂相(毛連菊，李雅娟.5種海水魚(yú)類(lèi)染色體的組型分析，大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002,17(2)：108-113)。也有取魚(yú)類(lèi)鰓組織和脾臟來(lái)制作染色體制片的，但染色體分裂相數(shù)目因魚(yú)而異，成功報(bào)道也只有絨杜父魚(yú)和綿鳚的脾臟，而脾臟只在高等類(lèi)群的魚(yú)類(lèi)中才比較發(fā)達(dá)。對(duì)于小型魚(yú)類(lèi)和仔稚魚(yú)而言，要解剖出它們的腎臟、脾臟并用于制備染色體絕非易事。

染色體制備需充分考慮實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮囼?yàn)材料本身的特性，海洋魚(yú)類(lèi)從兩極到赤道，從海岸到大洋，從表層到萬(wàn)米左右的深淵都有分布。生活環(huán)境的多樣性，促成了海洋魚(yú)類(lèi)的多樣性。但由于生活方式相同，千姿百態(tài)的海洋魚(yú)類(lèi)有一系列的共同特點(diǎn)：具有呼吸水中溶解氧的鰓，鰭狀的便于水中運(yùn)動(dòng)的肢體，能分泌粘液以減少水中運(yùn)動(dòng)阻力的皮膚。海洋環(huán)境又是處處暗藏危機(jī)的，直接接觸水體的魚(yú)體需要不斷地適應(yīng)水體中的各種刺激，所以體表組織細(xì)胞一般都處于旺盛的分裂增生的狀態(tài)。要制備大量分裂相染色體，必須保證試驗(yàn)魚(yú)的所取組織細(xì)胞大量處于分裂增生的狀態(tài)。

魚(yú)類(lèi)育種工作有不少種類(lèi)涉及到染色體組操作，如雌核發(fā)育和多倍體誘導(dǎo)等。育種初期獲得的試驗(yàn)魚(yú)都非常珍貴，科研人員想檢測(cè)他們的染色體組成卻又不舍得殺死試驗(yàn)魚(yú)。小型魚(yú)類(lèi)和魚(yú)苗更是無(wú)法采用傳統(tǒng)的方法來(lái)制備染色體，傳統(tǒng)的魚(yú)類(lèi)染色體制備方法不僅耗時(shí)長(zhǎng)，還必須處死試驗(yàn)魚(yú)，代價(jià)極其慘重。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種快速制備海洋小型魚(yú)類(lèi)或仔稚魚(yú)中期分裂相染色體的方法，所述方法通過(guò)對(duì)現(xiàn)有海水魚(yú)類(lèi)染色體制備方法的改進(jìn)，以最少量的實(shí)驗(yàn)用魚(yú)體表組織制備出大量的分散較好的中期分裂相染色體，以滿(mǎn)足各種海洋小型魚(yú)類(lèi)或仔稚魚(yú)種質(zhì)鑒定、染色體倍性分析、染色體熒光原位雜交分析、性別控制等研究的需求。本發(fā)明方法能克服試驗(yàn)魚(yú)數(shù)量少、個(gè)體小的限制，從處理試驗(yàn)魚(yú)開(kāi)始，6～9小時(shí)即可觀察到結(jié)果，操作簡(jiǎn)單便捷，可靈活調(diào)整制備步驟和處理強(qiáng)度，可在養(yǎng)殖育苗基地或生產(chǎn)單位隨時(shí)開(kāi)展，制備染色體后基本保證試驗(yàn)魚(yú)存活下來(lái)。

本發(fā)明是按照以下操作方法完成的：

一種快速制備海洋小型魚(yú)類(lèi)或仔稚魚(yú)中期分裂相染色體的方法，所述方法包括：1)充分了解試驗(yàn)魚(yú)的生物學(xué)特性及玻片的清洗；2)把小型試驗(yàn)魚(yú)類(lèi)或仔稚魚(yú)放入秋水仙素溶液中游泳；3)取試驗(yàn)魚(yú)的鰓組織或鰭條組織進(jìn)行染色體制備。

所述的充分了解試驗(yàn)魚(yú)的生物學(xué)特性及玻片的清洗：了解試驗(yàn)魚(yú)的體型特征、營(yíng)養(yǎng)組成、游泳活動(dòng)方式和生活方式，以確定取樣部位和試驗(yàn)方案，確定取樣部位及試驗(yàn)方案的標(biāo)準(zhǔn)如下：鰭條短小者在鰭條游離末端取樣，鰭條如蟬翼透明革質(zhì)或角質(zhì)則不適合取樣，改取鰓絲，鰭條脂肪含量高的應(yīng)加大低滲力度，選用0.0375M或0.05M KCl低滲液，鰓蓋開(kāi)口度大的取鰓絲游離端，運(yùn)動(dòng)激烈的試驗(yàn)魚(yú)游泳水體要求1.5L以上，靜止不動(dòng)的試驗(yàn)魚(yú)魚(yú)游泳水體要求100-200ml；染色體制片的載玻片要求干凈無(wú)油污，不掛水，在染色體制備前清洗干凈。

所述的把小型試驗(yàn)魚(yú)類(lèi)或仔稚魚(yú)放入秋水仙素溶液中游泳：配制含0.005％或0.01％(g/ml)秋水仙素的海水，讓試驗(yàn)魚(yú)在其中游泳4-6小時(shí)，游泳水體的水溫較原暫養(yǎng)水溫提高或降低2-3℃，以刺激增強(qiáng)試驗(yàn)魚(yú)體表組織分裂增生的能力；

所述的取試驗(yàn)魚(yú)少量鰓組織或鰭條組織進(jìn)行染色體制備：取1-8mm³鰓組織或鰭條組織，立即放入0.0375M、0.05M或0.075M KCl溶液中低滲50min，再轉(zhuǎn)移至新鮮配制預(yù)冷的卡諾氏固定液中固定，每一步驟過(guò)程中都需要輕輕搖晃處理樣品的試管，使作用更充分；然后采用熱滴片法制片。

進(jìn)一步，所述的卡諾氏固定液為甲醇與冰醋酸的體積比為3:1的混合液。

進(jìn)一步，所述的在卡諾氏固定液中的固定方法為更換固定液3次，每次固定15分鐘。

本發(fā)明與已有技術(shù)相比的有益效果：

1.本發(fā)明制備小型魚(yú)中期分裂相染色體的方法簡(jiǎn)單快捷，便于操作，制備染色體后基本保證試驗(yàn)魚(yú)存活下來(lái)，可重復(fù)多次制備，所需實(shí)驗(yàn)用魚(yú)可少至1條，適用于各種海洋魚(yú)類(lèi)。只需了解試驗(yàn)魚(yú)的生理和生活特性，確定樣品部位為鰓還是鰭即可。

2.采用本方法可保證實(shí)驗(yàn)樣品新鮮，細(xì)胞活性好，制備的中期分裂相染色體形態(tài)好，分散度好，便于觀察和計(jì)數(shù)。

附圖說(shuō)明

圖1銀鯧幼魚(yú)中期分裂相染色體：a、第一尾幼魚(yú)染色體，b、第二尾幼魚(yú)染色體。

圖2石斑魚(yú)幼魚(yú)中期分裂相染色體：a、體色發(fā)黑幼魚(yú)染色體，b、體色發(fā)白幼魚(yú)染色體。

具體實(shí)施方式：

下面通過(guò)具體實(shí)施例結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，以下是最佳實(shí)施例具體操作工藝過(guò)程，本發(fā)明的保護(hù)范圍不受實(shí)施例任何形式上的限制。

實(shí)施例1：

快速制備銀鯧中期分裂相染色體的方法，其步驟包括：1)充分了解銀鯧的生物學(xué)特性及玻片的清洗；2)銀鯧幼魚(yú)秋水仙素溶液中游泳；3)取魚(yú)體少量鰓組織進(jìn)行染色體制備。完成上述操作過(guò)程具體操作如下：

2016年7月8日，取1齡鯧魚(yú)2尾，體長(zhǎng)5-6cm，飼以特制的“鯧魚(yú)奶膏”于20L過(guò)濾海水中，銀鯧魚(yú)生性活潑，不停游泳，易受驚嚇而跳出水面。其鰭條質(zhì)如蟬翼，細(xì)胞不易解離。因此決定取鰓作為制備染色體的材料。染色體制片的載玻片要求干凈無(wú)油污，不掛水，在染色體制備前清洗干凈。載玻片先用中濃度重鉻酸鉀洗液(濃硫酸200ml，蒸餾水200ml，重鉻酸鉀20g)浸泡24小時(shí)，純凈水反復(fù)沖洗至洗液完全沖盡后控干水分，浸泡到無(wú)水乙醇中12小時(shí)，取出后酒精燈燒制，冷卻后裝盒備用，切勿用手碰觸載玻片表面造成油漬污染。

將配置的質(zhì)量比為0.4％的秋水仙素母液用過(guò)濾海水稀釋至秋水仙素終濃度為0.01％的工作液2L，工作液水溫較銀鯧原養(yǎng)殖水體溫度提高2-3℃，也可以降低2-3℃，讓幼鯧魚(yú)在工作液中游泳5小時(shí)，由于銀鯧生性膽小，易受驚嚇跳出水面或腹部脹氣打挺，驚嚇過(guò)度會(huì)導(dǎo)致死亡，因此游泳期間，容器上方需遮擋，容器周?chē)M量保證安靜和減少人影晃動(dòng)。取少量鰓組織，用0.075mol/L的KCL溶液低滲50分鐘，再用預(yù)冷的新鮮配制的卡諾氏(Carnoy)液(甲醇：冰醋酸＝3:1)充分固定，更換固定液3次，每次固定15分鐘。然后采用熱滴片法制片，制片時(shí)先用50％的冰醋酸溶液解離鰓組織成細(xì)胞懸液，通過(guò)彈壁或吸管吹打的方式，使細(xì)胞從組織團(tuán)塊中解離出來(lái)，放在4℃冰箱中預(yù)冷，載玻片放在光滑石板上或金屬面上預(yù)熱，石板或金屬面可用電爐加熱至55-60℃，吸取解離的細(xì)胞懸液，從80cm的高處滴2-3滴至預(yù)熱的載玻片上，用剪成的3層濾紙碎片的尖角快速吸干滴液，并把滴片移至旁邊晾干。市售吉姆薩工作液染色30分鐘，自來(lái)水流水沖洗載玻片表面多余的染色液約10秒鐘，晾干后即可鏡檢，觀察染色體形態(tài)。中期分裂相多，染色體形態(tài)和分散度均很好，見(jiàn)圖1。

實(shí)施例2：

快速制備石斑魚(yú)中期分裂相染色體的方法，其步驟包括：1)充分了解石斑魚(yú)苗的生物學(xué)特性及玻片的清洗；2)石斑魚(yú)幼魚(yú)秋水仙素溶液中游泳；3)取魚(yú)體少量鰭條組織進(jìn)行染色體制備。完成上述操作過(guò)程具體操作如下：

2011年10月份，取6月齡石斑魚(yú)苗2尾，分別為培育的新種質(zhì)，一尾體長(zhǎng)5cm，體色發(fā)黑，一尾體長(zhǎng)7cm，體色發(fā)白，精心飼養(yǎng)于20L過(guò)濾海水中。石斑魚(yú)幼魚(yú)喜游泳，但活動(dòng)不劇烈，尾鰭和背鰭發(fā)達(dá)，細(xì)胞易解離，因此決定取背鰭或尾鰭組織作為制備染色體的材料。染色體制片的載玻片要求干凈無(wú)油污，不掛水，在染色體制備前清洗干凈。載玻片先用中濃度重鉻酸鉀洗液浸泡24小時(shí)，所述的重鉻酸鉀洗液的配制方法為400ml溶液中由200ml的濃硫酸、200ml的蒸餾水、20g重鉻酸鉀組成，純凈水反復(fù)沖洗至洗液完全沖盡后控干水分，浸泡到無(wú)水乙醇中12小時(shí)，取出后酒精燈燒制，冷卻后裝盒備用，切勿用手碰觸載玻片表面造成油漬污染。

將配置的質(zhì)量比為0.4％的秋水仙素母液用過(guò)濾海水稀釋至秋水仙素終濃度為0.005％的工作液1L，工作液水溫較石斑魚(yú)原養(yǎng)殖水體溫度提高2-3℃，也可以降低2-3℃，讓幼石斑魚(yú)在工作液中游泳4小時(shí)，由于作用水體偏小，為保證幼魚(yú)活性，游泳期間宜以小氣石充氣。取少量鰭組織，用0.0375mol/L的KCL溶液低滲50分鐘，再用預(yù)冷的新鮮配制的卡諾氏(Carnoy)液(甲醇與冰醋酸的體積比為3:1混合)充分固定，更換固定液3次，每次固定15分鐘。然后采用熱滴片法制片，制片時(shí)先用50％的冰醋酸溶液解離鰭組織成細(xì)胞懸液，通過(guò)彈壁或吸管吹打的方式，使細(xì)胞從組織團(tuán)塊中解離出來(lái)，放在4℃冰箱中預(yù)冷，載玻片放在光滑石板上或金屬面上預(yù)熱，石板或金屬面可用電爐加熱至55-60℃，吸取解離的細(xì)胞懸液，從70cm的高處滴2-3滴至預(yù)熱的載玻片上，用剪成的2-4層濾紙碎片的尖角快速吸干滴液，并把滴片移至旁邊晾干。市售吉姆薩工作液染色30分鐘，自來(lái)水流水沖洗載玻片表面多余的染色液約10秒鐘，晾干后即可鏡檢，觀察染色體形態(tài)。兩條魚(yú)的中期分裂相都很多，染色體形態(tài)和分散度均很好，見(jiàn)圖2。

通過(guò)我們發(fā)明的這種快速制備海洋魚(yú)類(lèi)中期分裂相染色體的方法，還制備了半滑舌鰨、大菱鲆和漠斑牙鲆等魚(yú)類(lèi)的中期分裂相染色體，為這些海洋魚(yú)類(lèi)的種質(zhì)鑒定、遺傳育種、性別控制等研究提供了遺傳依據(jù)。