本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于研究RNA與蛋白相互作用的RNA pulldown方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
RNA結(jié)合蛋白(RBPs)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達起著重要的作用，具體的作用包括mRNA前體的剪接、多腺苷化和穩(wěn)定性的維持，mRNA從細胞核向細胞質(zhì)的運輸，mRNA的定位和翻譯等。RBPs在這些過程中的調(diào)節(jié)作用是通過結(jié)合新合成的或者成熟后的轉(zhuǎn)錄物的特定序列實現(xiàn)的。于此同時，有很多RBPs能夠識別RNA中的特定核苷酸序列。為了研究RNA與蛋白的相互作用建立了很多方法，這些方法包括EMSA、SELEX技術(shù)、RNA footprinting、RNA免疫沉淀(RIP)和RNA pulldown技術(shù)。
RNA pulldown技術(shù)利用脫末端標記的RNA高效富集及鑒定RNA結(jié)合蛋白(RBPs)。此方法避免了抗體的使用，大大延伸了使用范圍。隨著RNA pulldown技術(shù)的不斷完善，其在生命科學研究及醫(yī)學領(lǐng)域中扮演的角色愈加重要。
Hirofumi等通過RNA pulldown技術(shù)從線蟲的極少量的感覺神經(jīng)元中分離出mRNA，隨后通過芯片分析鑒定出了感覺神經(jīng)元的基因表達譜。(KUNITOMO H,UESUGI H,KOHARA Y,et al.2005.Identification of ciliated sensory neuron-expressed genes in Caenorhabditis elegans using targeted pull-down of poly(A)tails.Genome Biol[J],6:R17.)
現(xiàn)如今的研究中，RNA pulldown研究的探針主要是合成生物素標記的單鏈探針，拓展了RNA的研究范圍。Tsai等通過改進的RNA pulldown技術(shù)分析了長鏈非編碼RNA(lincRNA)調(diào)節(jié)染色體狀態(tài)和表觀遺傳。他們發(fā)現(xiàn)lincRNA HOTAIR作為至少兩個組蛋白修飾復合體的腳手架。HOTAIR的5’端結(jié)合多梳抑制復合體2(PRC2)，3’端結(jié)合LSD1/CoREST/REST復合體，完成RNA介 導的RPC2和LSD1復合體的組裝從而完成H3K27和H3K4兩個位點的甲基化。(TSAI M C,MANOR O,WAN Y,et al.2010.Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes.Science[J],329:689-693.)
上述RNA pulldown方法具有較明顯的缺點：(1)實驗中使用到的珠子(瓊脂糖珠子或磁珠)與蛋白的非特異結(jié)合，容易造成實驗結(jié)果的假陽性；(2)RNA探針與蛋白結(jié)合的特異性不高；(3)實驗過程還會受到核酸酶污染的影響。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
有鑒于此，有必要針對上述的問題，提供一種RNA pulldown方法及試劑盒。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種RNA pulldown方法，包含以下步驟：
S1、磁珠預處理：使用BSA(牛血清白蛋白)和寡核苷酸隨機引物封閉鏈霉親和素標記的磁珠；
S2、制備探針-磁珠復合物：將步驟S1預處理的磁珠與生物素標記的RNA探針結(jié)合；
S3、提取并預處理細胞全蛋白：向提取的細胞全蛋白中加入脫氧核糖核酸酶孵育，再加入未預處理的磁珠孵育，收集上清；
S4、pulldown：將步驟S3收集的上清加入到步驟S2制備的探針-磁珠復合物中，加入含脫氧核糖核酸酶抑制劑和核糖核酸酶抑制劑孵育，收集磁珠，用含核糖核酸酶抑制劑的NT2buffer洗滌磁珠，得到蛋白-探針-磁珠復合物；
S5、RNP(蛋白-探針復合物)的收集：將步驟S4制得的蛋白-探針-磁珠復合物加入Urea CHAPS buffer孵育，收集上清即得RNP。
優(yōu)選地，所述步驟S1磁珠預處理的方法為：用1mL 1×TES洗滌80μL鏈霉親和素標記的磁珠，去除TES洗滌液，再向磁珠中加入1mL含BSA和寡核苷酸隨機引物的1×TES，室溫孵育30min后去除TES溶液。
優(yōu)選地，所述TES中BSA的濃度為0.05-0.5wt％，寡核苷酸隨機引物的濃度為10-20μmol/L。
優(yōu)選地，所述步驟S1中寡核苷酸隨機引物為20bp以內(nèi)的DNA序列。
優(yōu)選地，所述步驟S2制備探針-磁珠復合物的方法為：將含2-5μg生物素標記RNA探針的溶液在90℃放置2min，立即置于冰上2min，加入50μL RNA structure buffer和20μL DEPC水，室溫放置20min制備得到二級結(jié)構(gòu)的RNA探針；將其加入預處理的磁珠中，并加入100μL 2×TES，25℃溫和旋轉(zhuǎn)混合30-60min，去上清；用1×TES洗滌磁珠兩次，去除TES。
優(yōu)選地，所述步驟S3中預處理細胞全蛋白的方法為：向1.5×107個細胞提取獲得的細胞全蛋白提取物中加入10μL DNase和3.2μL DNase Buffer，室溫溫和孵育1h；再加入40μL未預處理的磁珠，4℃溫和旋轉(zhuǎn)30min；收集上清液為預處理的細胞全蛋白。
優(yōu)選地，所述步驟S3提取細胞全蛋白的方法為：用PBS洗滌1.5×107個細胞一次；加入975μL RIP Buffer、10μL PMSF溶液、10μL protease inhibitor cocktail和5μL DTT溶液，勻漿器勻漿15-20次；4℃、1500g離心15min，收集上清即為細胞全蛋白提取物。
優(yōu)選地，所述步驟S4pulldown的具體方法為：將步驟S3制備的細胞全蛋白加入到探針-磁珠復合物中，并加入5μL RNase inhibitor、15μg poly(dI·dC)、5μL0.5M EDTA(乙二胺四乙酸)溶液和2.5μL 0.5M EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)溶液；室溫溫和旋轉(zhuǎn)孵育2h，收集磁珠；加入974μL NT2buffer、10μL PMSF溶液、10μL protease inhibitor cocktail、5μL DTT溶液和1μL RNase inhibitor，洗滌磁珠，再重復洗滌四次。本發(fā)明中選用EDTA作為脫氧核糖核酸酶的抑制劑。
優(yōu)選地，所述步驟S5中RNP的收集方法為：向蛋白-探針-磁珠復合物中加入40μL Urea CHAPS buffer，4℃孵育5-10h，收集上清即為探針-蛋白復合物。
優(yōu)選地，所述DTT溶液的濃度為100mM，所述PMSF溶液的濃度為10mg/mL。
一種RNA pulldown試劑盒，包含下述試劑：
磁珠及其處理試劑：2×TES溶液，鏈霉親和素標記的磁珠，寡核苷酸隨機引物；所述寡核苷酸隨機引物的濃度為10-20μmol/L；
RNA處理試劑：DNase，DNase Buffer，RNase inhibitor；
蛋白提取及處理試劑：RIP buffer，Urea CHAPS buffer，protease inhibitor cocktail、DTT溶液、PMSF溶液；所述DTT溶液的濃度為100mM，所述PMSF 溶液的濃度為10mg/mL；
探針及結(jié)合處理試劑：RNA structure buffer，NT2buffer，poly(dI·dC)。
本發(fā)明針對目標區(qū)域設計特異性RNA探針，探針經(jīng)過脫硫生物素標記；鏈霉親和素偶聯(lián)在磁珠上，并和脫硫生物素親和結(jié)合；細胞全蛋白與磁珠-探針復合物孵育，作用蛋白分子可以和RNA探針特異性結(jié)合；經(jīng)過洗滌可以將非特異性結(jié)合蛋白分子去除；最后，在洗脫液(針對鏈霉親和素)進行洗脫，得到目的探針-蛋白復合物，再經(jīng)過Western Blot或質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)類型。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
①本發(fā)明通過預先使用BSA封閉磁珠，降低了磁珠與蛋白的非特異性結(jié)合；本發(fā)明通過預先使用寡核苷酸隨機引物封閉磁珠，降低了磁珠與基因組RNA的非特異性結(jié)合。BSA和寡核苷酸隨機引物的大小正合適，既能封閉磁珠增強實驗的特異性，又不會過大而影響探針與蛋白的結(jié)合。
②本發(fā)明采用脫氧核糖核酸酶預處理蛋白樣品，采用未預處理的磁珠對蛋白樣品進行預洗滌，除去蛋白樣品內(nèi)的體內(nèi)DNA，防止其纏繞磁珠從而影響耦連在磁珠上的RNA探針與蛋白質(zhì)的結(jié)合，再采用脫氧核糖核酸酶抑制劑滅活脫氧核糖核酸酶。本發(fā)明通過系統(tǒng)性核酸酶防護，防止核酸酶的污染，增加了實驗的穩(wěn)定性和可靠性，重復性好，簡化了實驗流程。
③本發(fā)明中磁珠首先與探針孵育，去除多余探針后再與蛋白孵育，較傳統(tǒng)探針先與蛋白孵育再與磁珠孵育或探針、蛋白和珠子同時孵育極大的節(jié)約了磁珠的使用量，節(jié)約實驗成本。本發(fā)明采用磁珠取代了瓊脂糖珠，省掉離心的步驟，節(jié)約試驗時間。同時，采用磁珠法洗滌取代了瓊脂糖珠離心的步驟，可以使上清液去除的更加徹底，提高反應的特異性。
附圖說明
圖1為不同方法pulldown效果圖。
具體實施方式
為了更好的說明本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和具體實施方式做進一步說明。本 發(fā)明中所用試劑或儀器均可由市場購得，使用的檢測方法等都是本領(lǐng)域所熟知的，在此不再贅述。
實施例1
以lincRNA HOTAIR探針對LSD1蛋白的pulldown效果為例來說明本發(fā)明，，探針經(jīng)過脫硫生物素8-oxoG標記。探針的設計和標記方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，在此不再贅述。鏈霉親和素偶聯(lián)在磁珠(BeaverBeadsTMStreptavidin，海貍生物科技有限公司)上，并和脫硫生物素親和結(jié)合；細胞全蛋白與磁珠-RNA探針孵育，作用蛋白分子可以和探針特異性結(jié)合；經(jīng)過洗滌可以將非特異性結(jié)合蛋白分子去除；最后，再用洗脫液(針對鏈霉親和素)進行洗脫，得到目的探針-蛋白復合物，再經(jīng)過Western Blot鑒定蛋白質(zhì)類型。具體步驟如下：
S1、磁珠預處理
①取80μL含鏈霉親和素的磁珠置于無RNase EP管中，加入1mL 1×TES洗滌磁珠；
②置于磁力架上去除TES洗滌液，向磁珠加入1mL含0.5％BSA和10μmol/L寡核苷酸隨機引物的1×TES，室溫孵育30min后置于磁力架上去除TES溶液。所述寡核苷酸隨機引物為20bp以內(nèi)的DNA序列。
S2、制備探針-磁珠復合物
①將2-5μg大小300-1000bp的DNA探針用30μL DEPC水溶解，在90℃放置2min，立即置于冰上2min，加入50μLRNA structure buffer和20μL DEPC水，室溫放置20min制備得到二級結(jié)構(gòu)的RNA探針；
②將二級結(jié)構(gòu)的RNA探針加入預處理的磁珠中，并加入100μL 2×TES，25℃旋轉(zhuǎn)溫和混合30min，置于磁力架上去上清；
③加入0.35mL 1×TES，25℃溫和旋轉(zhuǎn)洗滌磁珠5min，置于磁力架上去除洗滌液；
④重復步驟③一次。
S3、提取并預處理細胞全蛋白
S31、提取細胞全蛋白
①用PBS洗滌1.5×107個Hela細胞一次；
加入975μL RIP Buffer、10μL PMSF溶液、10μL protease inhibitor cocktail和5μL DTT溶液，勻漿器勻漿15-20次；4℃、1500g離心15min，收集上清即為細胞全蛋白提取物；所述DTT溶液的濃度為100mM，所述PMSF溶液的濃度為10mg/mL；。
S32、預處理細胞全蛋白
①向上述制備的細胞全蛋白提取物中加入10μL DNase、3.2μL DNase Buffer，室溫25℃溫和孵育1h；
②向蛋白樣品中加入40μL未預處理的磁珠，4℃溫和旋轉(zhuǎn)30min；
③磁力架上收集磁珠，將上清液預處理的細胞全蛋白轉(zhuǎn)移到新的EP管中。
S4、pulldown
①將制備的細胞全蛋白加入到探針-磁珠復合物中，并加入472.5μL NT2buffer、5μL RNase inhibitor、15μg poly(dI·dC)、5μL 0.5M EDTA和2.5μL 0.5M EGTA；
②室溫溫和旋轉(zhuǎn)孵育2h；
③磁力架上收集磁珠，去除上清液；
④加入974μL NT2buffer、10μL PMSF溶液、10μL protease inhibitor cocktail、5μL DTT溶液和1μL RNase inhibitor，洗滌磁珠，去除非特異性結(jié)合的蛋白，再重復洗滌四次，得到蛋白-探針-磁珠復合物；所述DTT溶液的濃度為100mM，所述PMSF溶液的濃度為10mg/mL；。
S5、RNP收集
①向蛋白-探針-磁珠復合物中加入40μL Urea CHAPS buffer，4℃孵育5-10h。
②磁力架上收集磁珠，上清即為探針-蛋白復合物，將上清RNP轉(zhuǎn)移到新的EP管中。
③產(chǎn)物置于-80℃保存，供進一步Western Blot分析。
為了更好的說明本發(fā)明的效果，發(fā)明人還進行了兩組對比實驗。
對比例1使用PierceTMMagnetic RNA-Protein Pull-Down Kit方法，具體參見該試劑盒說明書。
對比例2使用Tsai等人報道的方法(TSAI M C,MANOR O,WAN Y,et al. 2010.Long noncoding RNA as modular scaffold of histone modification complexes.Science[J],329:689-693.)，具體步驟為：
(1)通過T7RNA聚合酶(Promega)利用生物素標記的RNA混合物(Roche)體外轉(zhuǎn)錄獲得生物素標記的RNAs，通過不含RNase的DNase I(Promega)，RNeasy Mini Kit(QIAGEN)對RNA產(chǎn)物進行分離純化。取3μg生物素化RNA，90℃加熱2min，放在冰上2min，換成RNA結(jié)構(gòu)緩沖液(10mM Tris pH 7,0.1M KCl,10mM MgCl2)，然后置于室溫20min使其形成正確的二級結(jié)構(gòu)。
(2)107個HeLa細胞通過2mL PBS重懸，加入2mL細胞核分離緩沖液(1.28M sucrose；40mM Tris-HCl pH 7.5；20mM MgCl2；4％Triton X-100)和6mL的水置于冰上20min，期間經(jīng)?；靹?。細胞核可以通過2,500g離心15min獲得。細胞核沉淀重懸在1mLRIP緩沖液(150mM KCl,25mM Tris pH 7.4,0.5mM DTT,0.5％NP40,1mM PMSF and protease Inhibitor(Roche Complete Protease InhibitorCocktail Tablets)中。重懸的細胞核通過組織勻漿器進行15-20次機械勻漿，核膜和碎片通過13,000轉(zhuǎn)，離心10min進行分離。
(3)將折疊的RNA和1mg Hela細胞核提取物在RIP中混勻，在室溫中孵育1h，取洗過的生物素化的瓊脂糖珠子(Invitrogen)加入每個結(jié)合反應的體系中，在室溫中進一步孵育1h。珠子在Handee spin柱子中洗5次，加入SDS緩沖液煮沸和Western Blot檢測。
使用本發(fā)明實施例和對比例的方法分別驗證lincRNA HOTAIR探針對LSD1蛋白的pulldown效果。泳道1為10％input組；泳道2為LacZ組，使用LacZ RNA探針作為陰性對照；泳道3為pulldown組，使用實驗組RNA探針。圖1A為本發(fā)明方法pulldown效果圖；圖1B為按照對比例1所述方法pulldown效果圖；圖1C為按照對比例2所述方法pulldown效果圖?？梢姳景l(fā)明相對于對比例1方法具有更高的蛋白富集效率，相對于對比例2所述的方法的Western Blot的條帶拖尾現(xiàn)象更少，條帶更亮，說明本試劑盒蛋白富集效率更高，靈敏度高。
以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權(quán)利要求為準。