本發(fā)明涉及一種治療慢性前列腺炎的中成藥癃閉欣通顆粒質(zhì)量檢測(cè)方法，屬于中藥制劑分析領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

慢性前列腺炎(chronic prostatitis，CP)是泌尿男科常見病、疑難病，好發(fā)于青壯年男性。其病因病機(jī)復(fù)雜，具有病程長、遷延反復(fù)、癥狀繁多等特點(diǎn)，臨床主要表現(xiàn)為排尿異常，骨盆區(qū)域疼痛或不適，甚或伴有性功能障礙等。慢性前列腺炎雖不危及患者生命，但嚴(yán)重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量，降低生活幸福指數(shù)，尤其是高昂的治療費(fèi)用更給患者家庭帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)本病的病因、病理變化均未完全闡明，治療上也缺乏特效的方法，仍然依靠抗生素、物理療法等，治療效果亦不十分滿意。與此相比，中醫(yī)學(xué)運(yùn)用整體觀念，辯證論治的特點(diǎn)，結(jié)合患者的體質(zhì)、情志、外界環(huán)境等多方面因素有針對(duì)性進(jìn)行個(gè)體化的遣方用藥，以多層次，多靶點(diǎn)進(jìn)行治療，從而在緩解癥狀、改善生活質(zhì)量方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，取得了顯著的療效。中醫(yī)藥治療慢性前列腺炎已成為治療CP過程中不可缺少的手段。

中國專利CN1745808公開了一種治療慢性前列腺炎的中藥組合物及其制備方法，目前該產(chǎn)品現(xiàn)已獲完成Ⅲ期臨床試驗(yàn)，正在申報(bào)生產(chǎn)批件，名稱為癃閉欣通顆粒。該產(chǎn)品由黃柏、苦參、紫花地丁、粉萆薢、瞿麥、玄參、肉桂、澤蘭、蒲黃、桃仁、刺猬皮(炙)、荔枝草、川牛膝十三味中藥組方，經(jīng)提取加工制成的復(fù)方中藥制劑，可針對(duì)性治療功慢性前列腺炎。癃閉欣通顆粒通過多種中藥有機(jī)配伍，標(biāo)本兼治，即可針對(duì)病因治療，又可針對(duì)癥狀迅速緩解患者病痛，比單純的化藥和生物制劑更具優(yōu)勢(shì)。且中藥為天然藥物，毒副作用小，臨床用藥更加安全。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是在中國專利CN1745808的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究制劑的質(zhì)量檢測(cè)方法。為了對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行全面、有效地控制，本發(fā)明人經(jīng)過大量的試驗(yàn)，優(yōu)化升級(jí)了制劑中藥材及藥材有效成分的定性定量檢測(cè)方法，建立了中藥癃閉欣通顆粒新的質(zhì)量檢測(cè)方法。

本發(fā)明的目的是提供一種治療慢性前列腺炎的中成藥癃閉欣通顆粒的質(zhì)量檢測(cè)方法，所述癃閉欣通顆粒是由黃柏、苦參、紫花地丁、粉萆薢、瞿麥、玄參、肉桂、澤蘭、蒲黃、桃仁、刺猬皮(炙)、荔枝草、川牛膝十三味中藥組方，經(jīng)提取加工制成的。該質(zhì)量檢測(cè)方法是以薄層色譜法鑒別制劑中肉桂、紫花地丁、玄參、黃柏、苦參、粉萆薢和川牛膝，同時(shí)采用HPLC測(cè)定制劑中黃柏的鹽酸小檗堿含量和桃仁中的苦杏仁苷含量，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)癃閉欣通顆粒質(zhì)量進(jìn)行全面地評(píng)價(jià)和控制，為癃閉欣通顆粒的真?zhèn)舞b別和內(nèi)在質(zhì)量檢測(cè)提供全面、可靠的依據(jù)，保證了產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性及臨床用藥的安全性、有效性。

本發(fā)明技術(shù)方案以薄層色譜鑒別癃閉欣通顆粒中肉桂、紫花地丁、玄參、黃柏、苦參、粉萆薢和川牛膝，具體包括下列步驟：

1、肉桂鑒別

1)供試品溶液的制備：取本品10g，研細(xì)，加甲醇50mL，超聲提取30分鐘，時(shí)加振搖，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，用稀鹽酸調(diào)pH值至1-2，用乙醚提取2次，每次20mL，合并乙醚液，低溫?fù)]干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液；

2)對(duì)照品溶液的制備：取桂皮醛對(duì)照品加乙醇制成每1mL含1μL的溶液，作為對(duì)照品溶液；

3)點(diǎn)樣、展開：吸取供試品溶液2-5μL，對(duì)照品溶液2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以60-90℃石油醚：乙酸乙酯＝17：3為展開劑，展開，取出，晾干，噴以二硝基苯肼乙醇試液；供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2、紫花地丁鑒別

1)供試品溶液的制備：取本品10g，研細(xì)，加甲醇50mL，超聲提取30分鐘，時(shí)加振搖，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，用稀鹽酸調(diào)pH值至1-2，用乙醚提取2次，每次20mL，合并乙醚液，低溫?fù)]干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液；

2)對(duì)照藥材溶液的制備：另取紫花地丁對(duì)照藥材2g，加甲醇20mL，超聲提取20分鐘，濾過，蒸干，殘?jiān)訜崴?0mL使溶解，濾過，用稀鹽酸調(diào)pH值至1-2，用乙醚提取2次，每次20mL，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液；

3)點(diǎn)樣、展開：吸取上述兩種溶液各2-5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷：丙酮：甲酸＝25：20：4為展開劑，展開，取出，晾干，置365nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)。

3、玄參鑒別

1)供試品溶液的制備：取本品10g，研細(xì)，加甲醇50mL，超聲提取30分鐘，時(shí)加振搖，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，用稀鹽酸調(diào)pH值至1-2，用乙醚提取2次，每次20mL，提取后的水液用乙酸乙酯提取3次，每次20mL，合并乙酸乙酯溶液，蒸干，殘?jiān)蒙倭?0％甲醇溶解，加在100-200目中性氧化鋁柱上，用50％甲醇30mL洗脫，洗脫液蒸干，殘?jiān)蛹状?.5mL使溶解，作為供試品溶液；

2)對(duì)照品溶液的制備：取玄參對(duì)照藥材1g，加甲醇20mL，超聲提取30分鐘，濾過，蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，用乙酸乙酯提取2次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液；

3)點(diǎn)樣、展開：吸取供試品溶液5-10μL，對(duì)照藥材溶液4μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷：甲醇：水：甲酸＝12：4：1：1的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5％香草醛硫酸溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰；供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

4、黃柏鑒別

1)供試品溶液的制備：取本品10g，研細(xì)，加甲醇50mL，超聲提取30分鐘，時(shí)加振搖，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，用稀鹽酸調(diào)pH值至1-2，用乙醚提取2次，每次20mL，提取后的水液用乙酸乙酯提取3次，每次20mL，提取后的水液用氨試液調(diào)pH值至10-11，用三氯甲烷20mL提取1次，三氯甲烷液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液；

2)對(duì)照品溶液的制備：取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；

3)點(diǎn)樣、展開：吸取上述兩種溶液各1-2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇：冰醋酸：水＝7：1：2為展開劑，展開，取出，晾干，置365nm紫外燈下檢視；供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

5、苦參鑒別

1)供試品溶液的制備：取本品10g，研細(xì)，加甲醇50mL，超聲提取30分鐘，時(shí)加振搖，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，用稀鹽酸調(diào)pH值至1-2，用乙醚提取2次，每次20mL，提取后的水液用乙酸乙酯提取3次，每次20mL，提取后的水液用氨試液調(diào)pH值至10-11，用三氯甲烷20mL提取1次，三氯甲烷液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液；

2)對(duì)照品溶液的制備：取苦參堿對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；

3)點(diǎn)樣、展開：吸取供試品溶液2-5μL，對(duì)照品溶液5μL，分別點(diǎn)于同一用硅膠G薄層板上，以三氯甲烷：甲醇：氨水＝5：0.6：0.2的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以改良碘化鉍鉀試液；供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

6、粉萆薢鑒別

1)供試品溶液的制備：取本品10g，研細(xì)，加甲醇50mL，超聲提取30分鐘，時(shí)加振搖，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，用稀鹽酸調(diào)pH值至1-2，用乙醚提取2次，每次20mL，提取后的水液用乙酸乙酯提取3次，每次20mL，提取后的水液用氨試液調(diào)pH值至10-11，用三氯甲烷20mL提取1次，取提取后的水液10mL，用乙酸乙酯提取2次，每次10mL，棄去乙酸乙酯液，水液用水飽和的正丁醇提取2次，每次10mL，合并正丁醇層，用氨試液20mL洗滌1次，棄去氨水層，正丁醇層水浴蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液；

2)對(duì)照品溶液的制備：取粉萆薢對(duì)照藥材0.5g，加水30mL，煮沸10分鐘，放冷，濾過，濾液用水飽和的正丁醇提取2次，每次20mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液；

3)點(diǎn)樣、展開：吸取上述兩種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷：甲醇：水＝13：7：2的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光和365nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn)。

7、川牛膝鑒別

1)供試品溶液的制備：取本品16g，研細(xì)，加甲醇50mL超聲處理30分鐘，時(shí)加振搖，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，用乙醚提取兩次，每次30mL，棄去乙醚液，水液用稀鹽酸調(diào)pH值至1-2，用乙酸乙酯提取兩次，每次20mL，乙酸乙酯液蒸干，殘?jiān)眉状迹阂宜嵋阴ィ?：1適量溶解，加于100-200目中性氧化鋁柱上，用甲醇：乙酸乙酯＝1：1的溶液40mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液；

2)對(duì)照品溶液的制備：另取川牛膝對(duì)照藥材2g，加甲醇50mL，加熱回流1小時(shí)，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，用乙醚提取兩次，每次30mL，棄去乙醚液，水液用稀鹽酸調(diào)pH值至1-2，用乙酸乙酯提取兩次，每次20mL，乙酸乙酯液蒸干，殘?jiān)眉状迹阂宜嵋阴ィ?：1適量溶解，加于100-200目中性氧化鋁柱上，用甲醇：乙酸乙酯＝1：1的溶液40mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為對(duì)照品溶液；

3)點(diǎn)樣、展開：吸取上述兩種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷：甲醇：甲酸＝10：1.5：2為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置365nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

本發(fā)明同時(shí)采用高效液相色譜法測(cè)定癃閉欣通顆粒中黃柏的鹽酸小檗堿含量和桃仁的苦杏仁苷的含量，包括下列步驟：

1、黃柏的鹽酸小檗堿含量測(cè)定

1)供試品溶液的制備：取癃閉欣通顆粒適量，研細(xì)，取2g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入鹽酸：甲醇＝1：100的溶液50mL，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，稱定重量，用鹽酸：甲醇＝1：100溶液補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液3mL，加在100-200目中性氧化鋁柱上，用甲醇50mL洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ萦?0mL容量瓶中，搖勻，濾過，即得；

2)對(duì)照品溶液的制備：稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含0.03mg的溶液，搖勻，即得；

3)HPLC色譜條件：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈：0.05mol/L磷酸二氫鈉溶液＝30：70為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為346nm，理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于4000；

4)測(cè)定方法：分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液10uL，注入高效液相色譜儀，按照步驟3)所述色譜條件測(cè)定，即得。

2、桃仁的苦杏仁苷含量測(cè)定

1)供試品溶液的制備：取癃閉欣通顆粒適量，研細(xì)，取5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水50mL，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，精密吸取上清液10mL置分液漏斗中，用乙酸乙酯提取2次，每次20mL，棄去乙酸乙酯液，水液置蒸發(fā)皿中，用少量水洗滌分液漏斗，一并合并于蒸發(fā)皿中，水浴揮至無乙酸乙酯味，放冷，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，定容，搖勻，即得；

2)對(duì)照品溶液的制備：稱取苦杏仁苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液，搖勻，即得；

3)HPLC色譜條件：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇：水＝18：82為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為210nm，理論板數(shù)按苦杏仁苷計(jì)算應(yīng)不低于4000；

4)測(cè)定方法：分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液5uL，注入高效液相色譜儀，按照步驟3)所述色譜條件測(cè)定，即得。

本發(fā)明在癃閉欣通原質(zhì)量檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，經(jīng)過優(yōu)化和升級(jí)，建立了癃閉欣通顆粒質(zhì)量檢測(cè)的新方法。該方法采用薄層色譜法分別對(duì)制劑中肉桂、紫花地丁、玄參、黃柏、苦參、粉萆薢和川牛膝進(jìn)行定性鑒別，達(dá)到多成分聯(lián)合控制，同時(shí)利用HPLC定量測(cè)定制劑中黃柏的鹽酸小檗堿含量和桃仁的苦杏仁苷的含量，能夠進(jìn)一步有效控制癃閉欣通顆粒的質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)對(duì)制劑質(zhì)量進(jìn)行全面地評(píng)價(jià)，從而最大限度地保證了產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性及臨床用藥的安全性、有效性。本發(fā)明所采用的檢測(cè)方法科學(xué)合理，條件可控，專屬性強(qiáng)，穩(wěn)定性高，具有很強(qiáng)的實(shí)用性；本質(zhì)量檢測(cè)方法的應(yīng)用，可確保癃閉欣通顆粒的臨床療效，更好地滿足醫(yī)療和市場(chǎng)的需要。

本發(fā)明方法優(yōu)化升級(jí)了癃閉欣通顆粒原檢測(cè)方法各項(xiàng)鑒別，減少了有害試劑的使用，并增加了粉萆薢和川牛膝的鑒別。與原有質(zhì)量檢測(cè)方法相比，本發(fā)明癃閉欣通顆粒質(zhì)量檢測(cè)方法具有以下顯著地進(jìn)步：

1)肉桂原薄層鑒別方法使用乙醚回流提取，由于肉桂揮發(fā)油采用環(huán)糊精包合，提取效率不高，本次修訂采用甲醇提取后再用乙醚提取，提取率較高，按原色譜條件展開，顯色，陰性無干擾，方法專屬性好；

2)紫花地丁原薄層鑒別方法繁瑣，新方法以甲醇提取后，再用乙醚提取，按原色譜條件展開，分離良好，陰性無干擾；

3)玄參原薄層鑒別方法用75％乙醇提取，得到的樣品雜質(zhì)太多，后續(xù)處理較麻煩，展開后雜質(zhì)干擾玄參的分離，方法無法重現(xiàn)。本次修訂用甲醇提取，乙醚除雜，乙酸乙酯提取后再用氧化鋁除去雜質(zhì)，方法簡(jiǎn)單。用原展開劑展開仍無法有效分離，更換藥典玄參藥材的展開劑后，上方的小檗堿拖尾影響玄參的分離，在展開劑中加入適量甲酸后，分離良好，陰性無干擾；

4)黃柏、苦參經(jīng)過甲醇提取后，用乙醚、乙酸乙酯脫脂后，再用氯仿提取，較原方法得到的色譜更干凈，陰性無干擾；

5)粉萆薢主要成分為皂苷類成分，經(jīng)甲醇提取后，用乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷反復(fù)除雜后，再用正丁醇提取后氨試液洗滌，選用藥典的色譜條件以三氯甲烷-甲醇-水的下層溶液為展開劑展開，硫酸乙醇溶液顯色，斑點(diǎn)清晰，分離良好，陰性無干擾；

6)川牛膝用甲醇提取后，乙醚除雜，經(jīng)氧化鋁凈化后，按藥典色譜條件展開，上方的小檗堿拖尾干擾川牛膝的分離，調(diào)整展開劑比例，并添加少量甲酸后，上方小檗堿斑點(diǎn)圓整無拖尾，不干擾川牛膝的分離。由于川牛膝中的杯莧甾酮含量較低，且工藝采用水提，取樣量調(diào)整為16g，相當(dāng)于川牛膝藥材9.6g，鑒別明顯，陰性無干擾。

附圖說明

圖1為癃閉欣通顆粒黃柏鹽酸小檗堿的高效液相色譜圖，從上往下依次是為鹽酸小檗堿對(duì)照品、陰性對(duì)照色譜圖、供試品色譜圖；

圖2為癃閉欣通顆粒桃仁苦杏仁苷的高效液相色譜圖，從上往下依次為苦杏仁苷對(duì)照品、陰性對(duì)照色譜圖、供試品色譜圖；

圖3為癃閉欣通顆粒中肉桂的薄層色譜圖，按從左到右的順序，其中1、4是桂皮醛對(duì)照品，2是樣品，3是缺肉桂的陰性制劑樣品；

圖4為癃閉欣通顆粒中紫花地丁的薄層色譜圖，按從左到右的順序，其中1、4是紫花地丁對(duì)照藥材，2是樣品，3是缺肉桂的陰性制劑樣品；

圖5為癃閉欣通顆粒中玄參的薄層色譜圖，按從左到右的順序，其中1、4是玄參對(duì)照藥材，2是缺玄參的陰性制劑樣品，3是樣品；

圖6為癃閉欣通顆粒中黃柏的薄層色譜圖，按從左到右的順序，其中1、4鹽酸小檗堿對(duì)照品，2是樣品，3是缺黃柏的陰性制劑樣品；

圖7為癃閉欣通顆粒中苦參的薄層色譜圖，按從左到右的順序，其中1、4是苦參堿對(duì)照品，2是樣品，3是樣品是缺苦參的陰性制劑樣品；

圖8為癃閉欣通顆粒中粉萆薢的薄層色譜圖(日光下檢視)，按從左到右的順序，其中1、4是粉萆薢對(duì)照藥材，2是樣品，3是缺粉萆薢的陰性制劑樣品；

圖9為癃閉欣通顆粒中粉萆薢的薄層色譜圖(365nm紫外光燈下檢視)，其中1、4是粉萆薢對(duì)照藥材，2是樣品，3是缺粉萆薢的陰性制劑樣品；

圖10為癃閉欣通顆粒中川牛膝的薄層色譜圖，按從左到右的順序，其中1、4是川牛膝對(duì)照藥材，2是缺川牛膝的陰性制劑樣品，3是樣品。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1鹽酸小檗堿的HPLC方法學(xué)研究

1)儀器與試劑：Agilent 1100高效液相色譜儀，VWD檢測(cè)器。乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸餾水。

2)色譜條件：Kromasil C₁₈色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈：0.05mol/L磷酸二氫鈉(內(nèi)含0.5％的三乙胺，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0)＝30：70；檢測(cè)波長為346nm；流速1mL/min。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

3)供試品溶液的制備：取裝量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸：甲醇＝1：100溶液50mL，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，用鹽酸：甲醇＝1：100溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液5mL，加于中性氧化鋁柱(100-200目，6g，內(nèi)徑1.2cm，干法裝柱，用30mL甲醇預(yù)洗)上，用甲醇50mL洗脫，洗脫液蒸干，參照用甲醇溶解，并定容于10mL量瓶中，搖勻，濾過，即得。

4)對(duì)照品溶液的制備：精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含0.05mg的溶液，即得。

5)陰性對(duì)照溶液的制備：取不含黃柏藥材的陰性對(duì)照，照供試品溶液的制備項(xiàng)下同法操作，制成陰性對(duì)照溶液，從色譜圖可以看出，在鹽酸小檗堿位置處無干擾。見圖1。

6)線性關(guān)系考察：精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加甲醇配成0.0554mg/mL的溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，分別進(jìn)樣1μL、2μL、4μL、6μL、8μL、10μL，測(cè)定峰面積，如表1。以測(cè)得峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y＝4299.632X-21.704，r＝0.99991，鹽酸小檗堿進(jìn)樣量在0.0554～0.554μg范圍內(nèi)線性良好。

表1線性關(guān)系考察結(jié)果

7)精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次5μL，峰面積RSD＝0.397％，表明儀器精密度良好。結(jié)果見表2。

表2精密度試驗(yàn)結(jié)果

8)穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一樣品溶液，分別于配制后0h，2h，4h，6h，8h，測(cè)定，結(jié)果表明樣品在8h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見表3。

表3穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

9)重復(fù)性試驗(yàn)：分別取同一批號(hào)的樣品6份，照“樣品測(cè)定”項(xiàng)下的樣品制備方法操作，分別測(cè)定，計(jì)算含量，RSD為0.96％。結(jié)果見表4。

表4重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

10)回收率試驗(yàn)：精密稱定已知含量的樣品6份，分別加入對(duì)照品適量，同“供試品溶液的制備”項(xiàng)下的制備方法測(cè)定，得鹽酸小檗堿平均回收率為％，RSD為0.594％。結(jié)果見表5。

表5回收率試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)施例2苦杏仁苷HPLC方法學(xué)研究

1)儀器與試劑：Agilent 1100高效液相色譜儀，VWD檢測(cè)器。甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸餾水。

2)色譜條件：Kromasil C₁₈色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相為甲醇：水＝18：82；檢測(cè)波長為210nm；流速0.8mL/min。理論板數(shù)按苦杏仁苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

3)供試品溶液的制備：取裝量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水50mL，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，精密量取上清液25mL置分液漏斗中，用乙酸乙酯提取2次，每次30mL，棄去乙酸乙酯，水液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，分液漏斗再用少量水洗滌，合并至蒸發(fā)皿中，，蒸至無乙酸乙酯味，將水液轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中，再用少量水洗滌蒸發(fā)皿，合并至50mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

4)對(duì)照品溶液的制備：精密稱取苦杏仁苷對(duì)照品適量，加50％甲醇制成每1mL含0.05mg的溶液，即得。

5)陰性對(duì)照溶液的制備：取不含桃仁藥材的陰性對(duì)照，照供試品溶液的制備項(xiàng)下同法操作，制成陰性對(duì)照溶液，從色譜圖可以看出，在苦杏仁苷位置處無干擾。見圖2。

6)線性關(guān)系考察：精密稱取苦杏仁苷對(duì)照品適量，加10％甲醇配成0.1085mg/mL的溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，分別進(jìn)樣1μL、2μL、4μL、6μL、8μL、10μL，測(cè)定峰面積，如表6。以測(cè)得峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y＝1254.987X-7.566，r＝0.99994，丹皮酚進(jìn)樣量在0.1085～1.085μg范圍內(nèi)線性良好。

表6線性關(guān)系考察結(jié)果

7)精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次5μL，峰面積RSD＝1.319％,表明儀器精密度良好。結(jié)果見表7。

表7精密度試驗(yàn)結(jié)果

8)穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一樣品溶液，分別于配制后0h，2h，4h，6h，8h，測(cè)定，結(jié)果表明樣品在8h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見表8。

表8穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

9)重復(fù)性試驗(yàn)：分別取同一批號(hào)的樣品6份，照“樣品測(cè)定”項(xiàng)下的樣品制備方法操作，分別測(cè)定，計(jì)算含量，RSD為0.922％。結(jié)果見表9。

表9重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

10)回收率試驗(yàn)：精密稱定已知含量的樣品6份，分別加入對(duì)照品適量，同“供試品溶液的制備”項(xiàng)下的制備方法測(cè)定，得苦杏仁苷平均回收率為99.09％，RSD為0.522％。結(jié)果見表10。

表10回收率試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)施例3癃閉欣通顆粒中肉桂薄層色譜鑒別

1)供試品溶液的制備：取本品10g，研細(xì)，加甲醇50mL，超聲提取30分鐘，時(shí)加振搖，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，用稀鹽酸調(diào)pH值至1-2，用乙醚提取2次，每次20mL，合并乙醚液，低溫?fù)]干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液；

2)對(duì)照品溶液的制備：取桂皮醛對(duì)照品加乙醇制成每1mL含1μL的溶液，作為對(duì)照品溶液；

3)點(diǎn)樣、展開：吸取供試品溶液2-5μL，對(duì)照品溶液2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以60-90℃石油醚：乙酸乙酯＝17：3為展開劑，展開，取出，晾干，噴以二硝基苯肼乙醇試液；供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

4)結(jié)果：圖3為癃閉欣通顆粒中肉桂的薄層色譜圖，結(jié)果表明：含有肉桂的樣品在與桂皮醛對(duì)照品色譜對(duì)應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。色譜分離良好，肉桂的特征斑點(diǎn)突出，建立的TLC方法可以作為癃閉欣通顆粒中肉桂的質(zhì)量檢測(cè)方法。

實(shí)施例4癃閉欣通顆粒中紫花地丁薄層色譜鑒別

1)供試品溶液的制備：取本品10g，研細(xì)，加甲醇50mL，超聲提取30分鐘，時(shí)加振搖，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，用稀鹽酸調(diào)pH值至1-2，用乙醚提取2次，每次20mL，合并乙醚液，低溫?fù)]干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液；

2)對(duì)照藥材溶液的制備：另取紫花地丁對(duì)照藥材2g，加甲醇20mL，超聲提取20分鐘，濾過，蒸干，殘?jiān)訜崴?0mL使溶解，濾過，用稀鹽酸調(diào)pH值至1-2，用乙醚提取2次，每次20mL，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液；

3)點(diǎn)樣、展開：吸取上述兩種溶液各2-5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷：丙酮：甲酸＝25：20：4為展開劑，展開，取出，晾干，置365nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)。

4)結(jié)果：圖4為癃閉欣通顆粒中紫花地丁的薄層色譜圖，結(jié)果表明：含有紫花地丁的樣品在與紫花地丁對(duì)照藥材色譜對(duì)應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。色譜分離良好，紫花地丁的特征斑點(diǎn)突出，建立的TLC方法可以作為癃閉欣通顆粒中紫花地丁的質(zhì)量檢測(cè)方法。

實(shí)施例5癃閉欣通顆粒中玄參薄層色譜鑒別

1)供試品溶液的制備：取本品10g，研細(xì)，加甲醇50mL，超聲提取30分鐘，時(shí)加振搖，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，用稀鹽酸調(diào)pH值至1-2，用乙醚提取2次，每次20mL，提取后的水液用乙酸乙酯提取3次，每次20mL，合并乙酸乙酯溶液，蒸干，殘?jiān)蒙倭?0％甲醇溶解，加在100-200目中性氧化鋁柱上，用50％甲醇30mL洗脫，洗脫液蒸干，殘?jiān)蛹状?.5mL使溶解，作為供試品溶液；

2)對(duì)照品溶液的制備：取玄參對(duì)照藥材1g，加甲醇20mL，超聲提取30分鐘，濾過，蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，用乙酸乙酯提取2次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液；

3)點(diǎn)樣、展開：吸取供試品溶液5-10μL，對(duì)照藥材溶液4μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷：甲醇：水：甲酸＝12：4：1：1的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5％香草醛硫酸溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰；供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

4)結(jié)果：圖5為癃閉欣通顆粒中玄參的薄層色譜圖，結(jié)果表明：含有玄參的樣品在與玄參對(duì)照藥材色譜對(duì)應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。色譜分離良好，玄參的特征斑點(diǎn)突出，建立的TLC方法可以作為癃閉欣通顆粒中玄參的質(zhì)量檢測(cè)方法。

實(shí)施例6癃閉欣通顆粒中黃柏薄層色譜鑒別

1)供試品溶液的制備：取本品10g，研細(xì)，加甲醇50mL，超聲提取30分鐘，時(shí)加振搖，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，用稀鹽酸調(diào)pH值至1-2，用乙醚提取2次，每次20mL，提取后的水液用乙酸乙酯提取3次，每次20mL，提取后的水液用氨試液調(diào)pH值至10-11，用三氯甲烷20mL提取1次，三氯甲烷液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液；

2)對(duì)照品溶液的制備：取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；

3)點(diǎn)樣、展開：吸取上述兩種溶液各1-2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇：冰醋酸：水＝7：1：2為展開劑，展開，取出，晾干，置365nm紫外燈下檢視；供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

4)結(jié)果：圖6為癃閉欣通顆粒中黃柏的薄層色譜圖，結(jié)果表明：含有黃柏的樣品在與鹽酸小檗堿對(duì)照品色譜對(duì)應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。色譜分離良好，黃柏的特征斑點(diǎn)突出，建立的TLC方法可以作為癃閉欣通顆粒中黃柏的質(zhì)量檢測(cè)方法。

實(shí)施例7癃閉欣通顆粒中苦參薄層色譜鑒別

1)供試品溶液的制備：取本品10g，研細(xì)，加甲醇50mL，超聲提取30分鐘，時(shí)加振搖，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，用稀鹽酸調(diào)pH值至1-2，用乙醚提取2次，每次20mL，提取后的水液用乙酸乙酯提取3次，每次20mL，提取后的水液用氨試液調(diào)pH值至10-11，用三氯甲烷20mL提取1次，三氯甲烷液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液；

2)對(duì)照品溶液的制備：取苦參堿對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；

3)點(diǎn)樣、展開：吸取供試品溶液2-5μL，對(duì)照品溶液5μL，分別點(diǎn)于同一用硅膠G薄層板上，以三氯甲烷：甲醇：氨水＝5：0.6：0.2的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以改良碘化鉍鉀試液；供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

4)結(jié)果：圖7為癃閉欣通顆粒中苦參的薄層色譜圖，結(jié)果表明：含有苦參的樣品在苦參堿對(duì)照品色譜對(duì)應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。色譜分離良好，苦參的特征斑點(diǎn)突出，建立的TLC方法可以作為癃閉欣通顆粒中苦參的質(zhì)量檢測(cè)方法。

實(shí)施例8癃閉欣通顆粒中粉萆薢薄層色譜鑒別

1)供試品溶液的制備：取本品10g，研細(xì)，加甲醇50mL，超聲提取30分鐘，時(shí)加振搖，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，用稀鹽酸調(diào)pH值至1-2，用乙醚提取2次，每次20mL，提取后的水液用乙酸乙酯提取3次，每次20mL，提取后的水液用氨試液調(diào)pH值至10-11，用三氯甲烷20mL提取1次，取提取后的水液10mL，用乙酸乙酯提取2次，每次10mL，棄去乙酸乙酯液，水液用水飽和的正丁醇提取2次，每次10mL，合并正丁醇層，用氨試液20mL洗滌1次，棄去氨水層，正丁醇層水浴蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液；

2)對(duì)照品溶液的制備：取粉萆薢對(duì)照藥材0.5g，加水30mL，煮沸10分鐘，放冷，濾過，濾液用水飽和的正丁醇提取2次，每次20mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液；

3)點(diǎn)樣、展開：吸取上述兩種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷：甲醇：水＝13：7：2的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光和365nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn)。

4)結(jié)果：圖8、圖9分別為癃閉欣通顆粒中粉萆薢置日光下檢視薄層色譜圖和置365nm紫外光燈下檢視薄層色譜圖，結(jié)果表明：含有粉萆薢的樣品在與粉萆薢對(duì)照藥材色譜對(duì)應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。色譜分離良好，粉萆薢的特征斑點(diǎn)突出，建立的TLC方法可以作為癃閉欣通顆粒中粉萆薢的質(zhì)量檢測(cè)方法。

實(shí)施例9癃閉欣通顆粒中川牛膝薄層色譜鑒別

1)供試品溶液的制備：取本品16g，研細(xì)，加甲醇50mL超聲處理30分鐘，時(shí)加振搖，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，用乙醚提取兩次，每次30mL，棄去乙醚液，水液用稀鹽酸調(diào)pH值至1-2，用乙酸乙酯提取兩次，每次20mL，乙酸乙酯液蒸干，殘?jiān)眉状迹阂宜嵋阴ィ?：1適量溶解，加于100-200目中性氧化鋁柱上，用甲醇：乙酸乙酯＝1：1的溶液40mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液；

2)對(duì)照品溶液的制備：另取川牛膝對(duì)照藥材2g，加甲醇50mL，加熱回流1小時(shí)，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，用乙醚提取兩次，每次30mL，棄去乙醚液，水液用稀鹽酸調(diào)pH值至1-2，用乙酸乙酯提取兩次，每次20mL，乙酸乙酯液蒸干，殘?jiān)眉状迹阂宜嵋阴ィ?：1適量溶解，加于100-200目中性氧化鋁柱上，用甲醇：乙酸乙酯＝1：1的溶液40mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為對(duì)照品溶液；

3)點(diǎn)樣、展開：吸取上述兩種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷：甲醇：甲酸＝10：1.5：2為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置365nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

4)結(jié)果：圖10為癃閉欣通顆粒中川牛膝的薄層色譜圖，結(jié)果表明：含有川牛膝的樣品在與川牛膝對(duì)照藥材色譜對(duì)應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。色譜分離良好，川牛膝的特征斑點(diǎn)突出，建立的TLC方法可以作為癃閉欣通顆粒中川牛膝的質(zhì)量檢測(cè)方法。

實(shí)施例10高效液相色譜法測(cè)定癃閉欣通顆粒中黃柏的鹽酸小檗堿

1)供試品溶液的制備：取癃閉欣通顆粒適量，研細(xì)，取2g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入鹽酸：甲醇＝1：100的溶液50mL，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，稱定重量，用鹽酸：甲醇＝1：100的溶液補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液3mL，加在100-200目中性氧化鋁柱上，用甲醇50mL洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ萦?0mL容量瓶中，搖勻，濾過，即得；

2)對(duì)照品溶液的制備：稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含0.03mg的溶液，搖勻，即得；

3)HPLC色譜條件：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈：0.05mol/L磷酸二氫鈉溶液＝30：70為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為346nm，理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于4000；

4)測(cè)定方法：分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液10uL，注入高效液相色譜儀，按照步驟3)所述色譜條件測(cè)定，即得。

實(shí)施例11高效液相色譜法測(cè)定癃閉欣通顆粒中桃仁的苦杏仁苷

1)供試品溶液的制備：取癃閉欣通顆粒適量，研細(xì)，取5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水50mL，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心，精密吸取上清液10mL置分液漏斗中，用乙酸乙酯提取2次，每次20mL，棄去乙酸乙酯液，水液置蒸發(fā)皿中，用少量水洗滌分液漏斗，一并合并于蒸發(fā)皿中，水浴揮至無乙酸乙酯味，放冷，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，定容，搖勻，即得；

2)對(duì)照品溶液的制備：稱取苦杏仁苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液，搖勻，即得；

3)HPLC色譜條件：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇：水＝18：82為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為210nm，理論板數(shù)按苦杏仁苷計(jì)算應(yīng)不低于4000；

4)測(cè)定方法：分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液5uL，注入高效液相色譜儀，按照步驟3)所述色譜條件測(cè)定，即得。

以上實(shí)施例僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理及構(gòu)思的前提下，還可以做出若干修飾和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。