本發(fā)明涉及快速檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種原位高通量檢測(cè)芯片的制備方法。

背景技術(shù)：

隨著人類活動(dòng)對(duì)自然環(huán)境的不斷擷取，冶金、采礦和燃煤等工業(yè)的發(fā)展以及含重金屬農(nóng)藥的運(yùn)用，大量的重金屬被釋放到環(huán)境中，造成了局部地區(qū)的高濃度重金屬環(huán)境污染現(xiàn)象。目前，環(huán)境中的重金屬含量變化的檢測(cè)缺少原位、高效的監(jiān)測(cè)手段，成為一個(gè)亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

局部表面等離子共振(LSPR)光譜技術(shù)作為一種和納米技術(shù)相結(jié)合，用于化學(xué)和生物檢測(cè)的新型手段而受到廣泛關(guān)注。作為一種新型檢測(cè)方法，LSPR檢測(cè)相對(duì)于生物檢測(cè)中傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法具有諸多優(yōu)點(diǎn)：比如免標(biāo)記，成本低，響應(yīng)速度快，操作、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，便于存儲(chǔ)和攜帶，并且可以實(shí)現(xiàn)原位、高通量檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種操作簡(jiǎn)單、成本低、穩(wěn)定性好、靈敏度高的原位高通量檢測(cè)芯片的制備方法。

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明所述的一種原位高通量檢測(cè)芯片的制備方法，包括以下步驟：

⑴制備三角形的Ag@Au核殼納米粒子：

①制備銀三角納米顆粒溶液：

將0.05~3mmol/L的AgNO₃溶液和0.05~10mmol/L的檸檬酸鈉溶液按照體積比49：1~30：20的比例混合，使其總體積為50mL；然后加入0.1~1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%~50%的H₂O₂溶液，最后，在攪拌條件下迅速加入新制冰冷的50~200mmol/L的NaBH₄溶液0.1~1mL，反應(yīng)結(jié)束后，即得銀三角納米顆粒溶液；

②合成Ag@Au核殼納米顆粒的水溶液：

在所述銀三角納米顆粒溶液中加入0.1~2mmol/L的PVP溶液1~10mL，然后依次加入0.1~1mmol/L二乙胺溶液0.1~3mL、0.1~1mmol/L的抗壞血酸溶液0.1~3mL，混合均勻后在攪拌條件下加入0.01%~1%的HAuCl₄溶液0.1~10mL，反應(yīng)結(jié)束后，即得Ag@Au核殼納米顆粒的水溶液；

⑵基于Ag@Au三角納米粒子的芯片的制備：

a. 制備處理后的玻璃基片：

將雙面都沒(méi)有磨砂的標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡用玻璃基片裁成片狀，清洗干凈后依次浸入食人魚(yú)酸洗液、質(zhì)量濃度為10~50%的氨水中進(jìn)行超聲處理，使其表面羥基化，然后依次經(jīng)超純水清洗、氬氣吹干后，在APTES混合液中浸泡進(jìn)行表面氨基化處理，6~36h后得到表面已氨基化的玻璃基片，該表面已氨基化的玻璃基片在體積濃度為60~95%的乙醇中超聲處理后依次經(jīng)超純水清洗、氬氣吹干，最后在溫度為60~80℃的條件下烘干至恒重，即得處理后的玻璃基片；

b. 玻璃基片表面Ag@Au核殼納米粒子的組裝：

將所述處理后的玻璃基片放入表面皿中，倒入所述Ag@Au核殼納米顆粒的水溶液，并使該Ag@Au核殼納米顆粒的水溶液沒(méi)過(guò)所述處理后的玻璃基片，組裝6~72h后，取出所述處理后的玻璃基片，并依次經(jīng)超純水清洗、氬氣吹干，即得Ag@Au三角納米粒子芯片。

所述步驟a.中片狀尺寸為1cm×1cm。

所述步驟a.中APTES混合液是指3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)與無(wú)水乙醇按1：15的體積比混合而成的溶液。

所述步驟a.中超聲處理?xiàng)l件是指超聲波的頻率為25kHz、功率為100~400W，處理時(shí)間為5~120min。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明所制得的Ag@Au核殼納米顆粒的靈敏度對(duì)介質(zhì)環(huán)境折光率的靈敏度可以達(dá)到570 nm/RIU如圖1所示，明顯的大于以前報(bào)道過(guò)的三角形的銀納米顆粒，球形的金、銀納米顆粒的靈敏度。

2、原則上講，Ag納米粒子由于更強(qiáng)和更窄的等離子體共振峰，可以被廣泛的應(yīng)用在化學(xué)和生物傳感以及成像和催化方面，但是銀納米粒子的結(jié)構(gòu)易在鹽溶液，鹵素，氧化劑，加熱以及紫外燈照射等條件下發(fā)生改變，這就很大程度上限制了銀納米粒子在很多實(shí)際方面的應(yīng)用。而當(dāng)往銀三角的表面鍍上一層均勻且和很薄的金膜時(shí)，可以大大提高銀三角的穩(wěn)定性，從而提升銀納米粒子的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明所制備的銀三角納米顆粒以及Ag@Au核殼結(jié)構(gòu)納米粒子的透射電鏡照片如圖2、3、4所示，可以看出銀三角的表面鍍上一層均勻且和很薄的金膜。

將Ag@Au核殼納米顆粒分別浸入超純水及PBS緩沖液(10 mM, pH= 7.4)中一段時(shí)間，經(jīng)測(cè)定，其最大吸收波長(zhǎng)未發(fā)生偏移，如圖5、6所示，證明本發(fā)明所制備的Ag@Au核殼納米顆粒具有很好的穩(wěn)定性。

3、金納米粒子具有易修飾以及很好的生物相容性的性質(zhì)，所以本發(fā)明在銀納米粒子表面上沉積一層金膜，不僅有效地保護(hù)了銀納米粒子不受外界環(huán)境的干擾，還有效提高了銀納米顆粒的物理和化學(xué)性質(zhì)。

將Ag@Au核殼結(jié)構(gòu)的納米顆粒分別浸入CH3OH (n = 1.3301), H2O (n = 1.333), CH3CN (n = 1.343), C2H5OH (n = 1.362), CH3(OH)CH3CH (n = 1.3776), HOCH2CH2OH (n = 1.4318)六種不同的溶劑中，測(cè)定紫外-近紅外消光光譜的最大吸收光波如圖7所示，并且將Ag@Au核殼納米粒子的LSPR λmax的位移值與溶劑的折光率(n)進(jìn)行線性回歸，其線性關(guān)系較好（R²=0.992）如圖8所示，證明本發(fā)明所制備的Ag@Au核殼納米顆粒具有很好的靈敏度。

4、本發(fā)明針對(duì)環(huán)境水體中砷的檢測(cè)缺少原位、高效手段這一難題，制作LSPR檢測(cè)芯片監(jiān)測(cè)水體中砷含量變化，具有方便、迅速、靈敏、高通量的檢測(cè)的特性及廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

5、本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，成本低，穩(wěn)定性好，靈敏度高。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。

圖1為本發(fā)明制備的銀三角納米顆粒以及Ag@Au核殼結(jié)構(gòu)納米粒子的紫外-可見(jiàn)消光光譜圖。

圖2為本發(fā)明制備的銀三角納米顆粒以及Ag@Au核殼結(jié)構(gòu)納米粒子的透射電鏡照片（20nm）。

圖3為本發(fā)明制備的銀三角納米顆粒以及Ag@Au核殼結(jié)構(gòu)納米粒子的透射電鏡照片（5nm）。

圖4為本發(fā)明Ag@Au核殼結(jié)構(gòu)納米粒子的掃描電鏡照片。

圖5為本發(fā)明Ag@Au核殼納米粒子在超純水中儲(chǔ)存一定時(shí)間的紫外-可見(jiàn)消光光譜。

圖6為本發(fā)明Ag@Au核殼納米粒子在PBS緩沖液(10 mM, pH= 7.4)中儲(chǔ)存一定時(shí)間的紫外-可見(jiàn)消光光譜。

圖7為本發(fā)明Ag@Au核殼結(jié)構(gòu)的納米顆粒在六種不同的溶劑中紫外-近紅外消光光譜，從左至右: CH₃OH (n = 1.3301), H₂O (n = 1.333), CH₃CN (n = 1.343), C₂H₅OH (n = 1.362), CH₃(OH)CH₃CH (n = 1.3776), HOCH₂CH₂OH (n = 1.4318)。

圖8為本發(fā)明Ag@Au核殼納米粒子的LSPR λ_max的位移值與溶劑的折光率(n)的關(guān)系。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 一種原位高通量檢測(cè)芯片的制備方法，包括以下步驟：

⑴制備三角形的Ag@Au核殼納米粒子：

①制備銀三角納米顆粒溶液：

將0.05mmol/L的AgNO₃溶液和0.05mmol/L的檸檬酸鈉溶液按照體積比49：1的比例混合，使其總體積為50mL；然后加入0.1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的H₂O₂溶液，最后，在攪拌條件下迅速加入新制冰冷的50mmol/L的NaBH₄溶液0.1mL，反應(yīng)結(jié)束后，即得銀三角納米顆粒溶液。

②合成Ag@Au核殼納米顆粒的水溶液：

在銀三角納米顆粒溶液中加入0.1mmol/L的PVP溶液1mL，然后依次加入0.1mmol/L二乙胺溶液0.1mL、0.1mmol/L的抗壞血酸溶液0.1mL，混合均勻后在攪拌條件下加入0.01%的HAuCl₄溶液0.1mL，反應(yīng)結(jié)束后，即得Ag@Au核殼納米顆粒的水溶液。

⑵基于Ag@Au三角納米粒子的芯片的制備：

a. 制備處理后的玻璃基片：

將雙面都沒(méi)有磨砂的標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡用玻璃基片裁成片狀，清洗干凈后依次浸入食人魚(yú)酸洗液、質(zhì)量濃度為10%的氨水中進(jìn)行超聲處理，使其表面羥基化，然后依次經(jīng)超純水清洗、氬氣吹干后，在APTES混合液中浸泡進(jìn)行表面氨基化處理，6h后得到表面已氨基化的玻璃基片，該表面已氨基化的玻璃基片在體積濃度為60%的乙醇中超聲處理后依次經(jīng)超純水清洗、氬氣吹干，最后在溫度為60℃的條件下烘干至恒重，即得處理后的玻璃基片。

其中：片狀尺寸為1cm×1cm。

APTES混合液是指3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)與無(wú)水乙醇按1：15的體積比（mL/ mL）混合而成的溶液。

超聲處理?xiàng)l件是指超聲波的頻率為25kHz、功率為100W，處理時(shí)間為120min。

b. 玻璃基片表面Ag@Au核殼納米粒子的組裝：

將處理后的玻璃基片放入表面皿中，倒入Ag@Au核殼納米顆粒的水溶液，并使該Ag@Au核殼納米顆粒的水溶液沒(méi)過(guò)處理后的玻璃基片，組裝6h后，取出處理后的玻璃基片，并依次經(jīng)超純水清洗、氬氣吹干，即得Ag@Au三角納米粒子芯片。

實(shí)施例2 一種原位高通量檢測(cè)芯片的制備方法，包括以下步驟：

⑴制備三角形的Ag@Au核殼納米粒子：

①制備銀三角納米顆粒溶液：

將3mmol/L的AgNO₃溶液和10mmol/L的檸檬酸鈉溶液按照體積比30：20的比例混合，使其總體積為50mL；然后加入1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的H₂O₂溶液，最后，在攪拌條件下迅速加入新制冰冷的200mmol/L的NaBH₄溶液1mL，反應(yīng)結(jié)束后，即得銀三角納米顆粒溶液。

②合成Ag@Au核殼納米顆粒的水溶液：

在銀三角納米顆粒溶液中加入2mmol/L的PVP溶液10mL，然后依次加入1mmol/L二乙胺溶液3mL、1mmol/L的抗壞血酸溶液3mL，混合均勻后在攪拌條件下加入1%的HAuCl₄溶液10mL，反應(yīng)結(jié)束后，即得Ag@Au核殼納米顆粒的水溶液。

⑵基于Ag@Au三角納米粒子的芯片的制備：

a. 制備處理后的玻璃基片：

將雙面都沒(méi)有磨砂的標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡用玻璃基片裁成片狀，清洗干凈后依次浸入食人魚(yú)酸洗液、質(zhì)量濃度為50%的氨水中進(jìn)行超聲處理，使其表面羥基化，然后依次經(jīng)超純水清洗、氬氣吹干后，在APTES混合液中浸泡進(jìn)行表面氨基化處理，36h后得到表面已氨基化的玻璃基片，該表面已氨基化的玻璃基片在體積濃度為95%的乙醇中超聲處理后依次經(jīng)超純水清洗、氬氣吹干，最后在溫度為80℃的條件下烘干至恒重，即得處理后的玻璃基片。

其中：片狀尺寸、APTES混合液同實(shí)施例1。

超聲處理?xiàng)l件是指超聲波的頻率為25kHz、功率為400W，處理時(shí)間為5min。

b. 玻璃基片表面Ag@Au核殼納米粒子的組裝：

將處理后的玻璃基片放入表面皿中，倒入Ag@Au核殼納米顆粒的水溶液，并使該Ag@Au核殼納米顆粒的水溶液沒(méi)過(guò)處理后的玻璃基片，組裝36h后，取出處理后的玻璃基片，并依次經(jīng)超純水清洗、氬氣吹干，即得Ag@Au三角納米粒子芯片。

實(shí)施例3 一種原位高通量檢測(cè)芯片的制備方法，包括以下步驟：

⑴制備三角形的Ag@Au核殼納米粒子：

①制備銀三角納米顆粒溶液：

將1.5mmol/L的AgNO₃溶液和5mmol/L的檸檬酸鈉溶液按照體積比35：15的比例混合，使其總體積為50mL；然后加入0.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H₂O₂溶液，最后，在攪拌條件下迅速加入新制冰冷的150mmol/L的NaBH₄溶液0.5mL，反應(yīng)結(jié)束后，即得銀三角納米顆粒溶液。

②合成Ag@Au核殼納米顆粒的水溶液：

在銀三角納米顆粒溶液中加入1mmol/L的PVP溶液5mL，然后依次加入0.5mmol/L二乙胺溶液1.5mL、0.5mmol/L的抗壞血酸溶液1.5mL，混合均勻后在攪拌條件下加入0.5%的HAuCl₄溶液5mL，反應(yīng)結(jié)束后，即得Ag@Au核殼納米顆粒的水溶液。

⑵基于Ag@Au三角納米粒子的芯片的制備：

a. 制備處理后的玻璃基片：

將雙面都沒(méi)有磨砂的標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡用玻璃基片裁成片狀，清洗干凈后依次浸入食人魚(yú)酸洗液、質(zhì)量濃度為30%的氨水中進(jìn)行超聲處理，使其表面羥基化，然后依次經(jīng)超純水清洗、氬氣吹干后，在APTES混合液中浸泡進(jìn)行表面氨基化處理，24h后得到表面已氨基化的玻璃基片，該表面已氨基化的玻璃基片在體積濃度為80%的乙醇中超聲處理后依次經(jīng)超純水清洗、氬氣吹干，最后在溫度為70℃的條件下烘干至恒重，即得處理后的玻璃基片。

其中：片狀尺寸、APTES混合液同實(shí)施例1。

超聲處理?xiàng)l件是指超聲波的頻率為25kHz、功率為250W，處理時(shí)間為65min。

b. 玻璃基片表面Ag@Au核殼納米粒子的組裝：

將處理后的玻璃基片放入表面皿中，倒入Ag@Au核殼納米顆粒的水溶液，并使該Ag@Au核殼納米顆粒的水溶液沒(méi)過(guò)處理后的玻璃基片，組裝72h后，取出處理后的玻璃基片，并依次經(jīng)超純水清洗、氬氣吹干，即得Ag@Au三角納米粒子芯片。