本發(fā)明涉及一種可用于白藜蘆醇抗氧化機(jī)制作用的評(píng)價(jià)方法。

背景技術(shù)：

衰老的自由基理論認(rèn)為物質(zhì)在人體內(nèi)代謝和產(chǎn)生能量都需要氧參與，但是氧氣在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生各種自由基。

氧自由基是由氧氣分子衍生的一系列自由基。自由基是含有一個(gè)不成對(duì)電子的分子或原子團(tuán)，如一氧化氮自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基和脂類自由基。由于自由基外層有一個(gè)不成對(duì)的電子，能量高，非常活躍，容易與其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。低濃度的氧自由基在體內(nèi)具有重要的生物功能，但伴隨氧自由基逐步積累，細(xì)胞膜則容易受到其攻擊，甚至可能損傷細(xì)胞成分導(dǎo)致疾病的發(fā)生。由此，無(wú)論從心腦血管疾病到癌癥，自由基和幾種主要疾病特別是衰老和老年退行性疾病(如老年癡呆癥和帕金森氏癥等)都有密切關(guān)系。

白藜蘆醇，其英文名：Resveratrol，化學(xué)名：E-3,5,4’-三羥基二苯乙烯，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式是：

白藜蘆醇是一種非黃酮類的多酚化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)存在順式和反式兩種異構(gòu)體，自然界中白藜蘆醇主要以反式形式存在，研究表明反式異構(gòu)體的生理活性強(qiáng)于順式異構(gòu)體。白藜蘆醇含有三個(gè)酚羥基，特別是其中的4-對(duì)位羥基是其抗氧化能力的主要來(lái)源，其鄰二羥基和乙烯基的存在則有助于形成共軛體系，穩(wěn)定自由基。這樣的分子結(jié)構(gòu)使得其具有很強(qiáng)的還原性。白藜蘆醇可以通過(guò)與自由基反應(yīng)，來(lái)降低自由基活性，阻止自由基進(jìn)一步鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，達(dá)到清除自由基的效果；同時(shí)，白藜蘆醇能夠保持谷胱甘肽的還原狀態(tài)，從而抑制氧化自由基的生產(chǎn)，最終達(dá)到抗氧化的功能。

因此，白藜蘆醇能保護(hù)細(xì)胞和器官免受氧化侵害，阻止膽固醇在血管內(nèi)的沉淀，免于斑點(diǎn)、皺紋、肌膚松弛的困擾，具有預(yù)防腫瘤，心血管疾病，抗衰老和抗菌的生理活性。

盡管白藜蘆醇具有抗氧自由基代謝的功能，然而本領(lǐng)域仍然期待有新的有效的抗氧自由基代謝的評(píng)價(jià)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種新的有效的抗氧自由基代謝的評(píng)價(jià)方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種對(duì)白藜蘆醇進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)的方法。已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)本發(fā)明，可以使用白藜蘆醇有效地評(píng)價(jià)抗氧自由基代謝。本發(fā)明基于此發(fā)現(xiàn)而得以完成。

本發(fā)明第一方面提供了白藜蘆醇在制備評(píng)價(jià)抗氧自由基代謝的試劑中的用途。

本發(fā)明第二方面提供了白藜蘆醇評(píng)價(jià)抗氧自由基代謝的方法。

根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，該方法包括以下試驗(yàn)項(xiàng)目以評(píng)價(jià)白藜蘆醇抗氧自由基代謝的效果：過(guò)氧化氫對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響、白藜蘆醇對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的保護(hù)作用、發(fā)酵罐中的規(guī)范實(shí)驗(yàn)、氧自由基對(duì)大腸桿菌代謝流的影響、高濃度白藜蘆醇對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制。

進(jìn)一步的，本發(fā)明第三方面提供了一種對(duì)白藜蘆醇進(jìn)行質(zhì)量控制的方法，該方法包括使用高效液相色譜法測(cè)定白藜蘆醇供試品中白藜蘆醇的含量，該方法包括如下操作：

(1)中國(guó)藥典2015年版四部第59所第0512節(jié)所載的高效液相色譜法中的規(guī)范進(jìn)行測(cè)定；

(2)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-0.05％酒石酸水溶液以體積比30：70為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為306nm；

取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液測(cè)定，理論板數(shù)按白藜蘆醇峰計(jì)應(yīng)不低于3000，白藜蘆醇與其最接近的雜質(zhì)峰之間的分離度應(yīng)大于1.5，白藜蘆醇與白藜蘆醇苷峰之間的分離度應(yīng)大于3.0；

(3)溶液制備：

取白藜蘆醇供試品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋，制成每1ml溶液中含有白藜蘆醇0.2mg的溶液，過(guò)濾，作為供試品溶液(即，200μg/ml)；

精密量取供試品溶液1ml置于100ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋刻度，搖勻，制成含白藜蘆醇濃度為2μg/ml的溶液，作為對(duì)照溶液(即，2μg/ml)；

精密稱取白藜蘆醇對(duì)照品、白藜蘆醇苷對(duì)照品適量，用流動(dòng)相溶解并制成兩種物質(zhì)濃度均為分別為200μg/ml和2μg/ml的溶液，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液(即，200μg/ml+2μg/ml)；

精密稱取白藜蘆醇對(duì)照品適量，用流動(dòng)相溶解并制成每1ml溶液中含有白藜蘆醇0.2mg的溶液，過(guò)濾，作為對(duì)照品溶液；

(4)測(cè)定：

精密量取對(duì)照溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，確定白藜蘆醇主成分的保留時(shí)間，并讀取白藜蘆醇峰的峰面積；

精密量取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算理論板數(shù)和各峰之間的分離度；

精密量取對(duì)照品溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；

精密量取供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至白藜蘆醇苷保留時(shí)間的2倍，讀取供試品溶液色譜圖中主成峰峰面積和各雜質(zhì)的峰面積；

(5)結(jié)果計(jì)算：

根據(jù)供試品溶液色譜圖中主成分峰面積以及對(duì)照品溶液色譜圖中主成分峰面積和對(duì)照品溶液主成分濃度，計(jì)算供試品中白藜蘆醇的百分含量。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的方法，其中還包括使用所述高效液相色譜法測(cè)定白藜蘆醇供試品中雜質(zhì)白藜蘆醇苷的含量。具體地說(shuō)，根據(jù)記錄的各色譜圖，當(dāng)供試品中檢測(cè)到存在白藜蘆醇苷時(shí)，以對(duì)照溶液色譜圖中主成份峰面積為1.0％，計(jì)算供試品溶液色譜圖中白藜蘆醇苷相對(duì)于白藜蘆醇的百分含量，即得到供試品中的白藜蘆醇苷的含量(即，如果對(duì)照溶液主峰面積為100，供試品溶液色譜圖中雜質(zhì)白藜蘆醇苷的峰面積為115％，則白藜蘆醇苷相對(duì)于白藜蘆醇的百分含量，簡(jiǎn)稱白藜蘆醇苷含量為1.15％；供試品溶液色譜圖中雜質(zhì)白藜蘆醇苷的峰面積為87％，則白藜蘆醇苷含量為0.87％)。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的方法，其中所述色譜柱的規(guī)格是：柱長(zhǎng)15～30cm、柱內(nèi)徑4.6mm、填料粒徑5μm。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的方法，其中所述色譜柱的規(guī)格是：柱長(zhǎng)20～30cm、柱內(nèi)徑4.6mm、填料粒徑5μm。

根據(jù)本發(fā)明第三方面的方法，其中所述色譜柱的規(guī)格是：柱長(zhǎng)25cm、柱內(nèi)徑4.6mm、填料粒徑5μm。

在本發(fā)明上述方法的步驟中，雖然其描述的具體步驟在某些細(xì)節(jié)上或者語(yǔ)言描述上與下文具體實(shí)施方式部分的實(shí)例例中所描述的步驟有所區(qū)別，然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明全文的詳細(xì)公開(kāi)完全可以概括出以上所述方法步驟。

本發(fā)明的任一方面的任一實(shí)施方案，可以與其它實(shí)施方案進(jìn)行組合，只要它們不會(huì)出現(xiàn)矛盾。此外，在本發(fā)明任一方面的任一實(shí)施方案中，任一技術(shù)特征可以適用于其它實(shí)施方案中的該技術(shù)特征，只要它們不會(huì)出現(xiàn)矛盾。

下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。

本發(fā)明所引述的所有文獻(xiàn)，它們的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文，并且如果這些文獻(xiàn)所表達(dá)的含義與本發(fā)明不一致時(shí)，以本發(fā)明的表述為準(zhǔn)。此外，本發(fā)明使用的各種術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般含義，即便如此，本發(fā)明仍然希望在此對(duì)這些術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)作更詳盡的說(shuō)明和解釋，提及的術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)如有與公知含義不一致的，以本發(fā)明所表述的含義為準(zhǔn)。

紅葡萄酒含有多種活性生物分子，具有抗衰老，抗氧化，防腫瘤和抑菌的生理作用。這些分子中，白黎蘆醇由于具有最為顯著的抗氧化作用而受到人們的關(guān)注。已有美國(guó)部分廠家將其作為保健品進(jìn)行銷售。然而要想白黎蘆醇真正有效，安全地，廣泛地在藥品，食品領(lǐng)域發(fā)揮作用，必須清楚地了解其抗氧化的體內(nèi)過(guò)程和分子機(jī)制。

為此，我們查閱相關(guān)資料，了解衰老的氧自由基理論，認(rèn)識(shí)了白藜蘆醇的分子結(jié)構(gòu)與抗氧化能力。然后設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)了氧自由基對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)抑制，以及白藜蘆醇對(duì)這種抑制的緩解與保護(hù)。通過(guò)一種嶄新的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法，我們觀察到大腸桿菌的生長(zhǎng)抑制與恢復(fù)都是由其碳中心代謝系統(tǒng)狀態(tài)改變導(dǎo)致的。表明白藜蘆醇對(duì)大腸桿菌的保護(hù)作用是通過(guò)維持代謝系統(tǒng)流量穩(wěn)定這一機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)的。然后我們證明大腸桿菌碳中心代謝系統(tǒng)狀態(tài)改變主要是由催化相應(yīng)反應(yīng)的酶活變化導(dǎo)致的。進(jìn)一步地，我們發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致保護(hù)作用的減弱。我們根據(jù)白藜蘆醇濃度討論了紅酒飲用的上限。我們的實(shí)驗(yàn)既幫助人們認(rèn)識(shí)了白藜蘆醇，又為飲用紅酒提供了一定的指導(dǎo)意義。

有一個(gè)有名的法國(guó)悖論，法國(guó)人酷好美食，特別是高脂含量的食物，然而其心臟血管疾病的比例卻不高。這個(gè)悖論的解釋是因?yàn)榉▏?guó)人喜歡以紅酒來(lái)搭配美食，而紅酒富含各類活性生物成分，具有抗衰老，抗氧化功能，能預(yù)防腫瘤與心血管疾病。其中白藜蘆醇功能很大。

衰老的自由基理論認(rèn)為，物質(zhì)在人體內(nèi)代謝和產(chǎn)生能量都需要氧參與，但是氧氣在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生各種自由基。自由基是含有一個(gè)不成對(duì)電子的分子或原子團(tuán)，例如一氧化氮自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基和脂類自由基。由氧氣分子衍生的一系列自由基叫做氧自由基。由于自由基外層有一個(gè)不成對(duì)的電子，能量高，非常活躍，容易與其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。低濃度的氧自由基在體內(nèi)具有重要的生物功能。但如果氧自由基積累過(guò)多，就很容易攻擊細(xì)胞膜，還可能損傷細(xì)胞成分甚至導(dǎo)致疾病的發(fā)生。從心腦血管疾病到癌癥，自由基和幾種主要疾病特別是衰老和老年退行性疾病(老年癡呆癥和帕金森氏癥等)都有密切關(guān)系。

白藜蘆醇(化學(xué)名稱為E-3，5，4’-三羥基二苯乙烯)英文名為Resveratrol。它是非黃酮類的多酚化合物，分子式為C14H12O3，相對(duì)分子質(zhì)量為228.25，為白色針狀晶體。白藜蘆醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)，還分別存在順式和反式兩種異構(gòu)體，植物中白藜蘆醇主要以反式形式存在，研究表明反式異構(gòu)體的生理活性強(qiáng)于順式異構(gòu)體。白藜蘆醇含有三個(gè)酚羥基，特別是其中的4-對(duì)位羥基是其抗氧化能力的主要來(lái)源，其鄰二羥基和乙烯基的存在則有助于形成共軛體系，穩(wěn)定自由基。這樣的分子結(jié)構(gòu)使得其具有很強(qiáng)的還原性達(dá)到抗氧化的功能。

因此白藜蘆醇能保護(hù)細(xì)胞和器官免受氧化侵害，阻止膽固醇在血管內(nèi)的沉淀，免于斑點(diǎn)、皺紋、肌膚松弛的困擾，還具有預(yù)防腫瘤，心血管疾病，抗衰老和抗菌的生理活性。很多科學(xué)家都認(rèn)為白藜蘆醇未來(lái)可能作為保健品，或者食品，乃至藥品，在預(yù)防和輔助治療疾病中發(fā)揮重要作用，產(chǎn)生廣泛的價(jià)值?，F(xiàn)在網(wǎng)絡(luò)上甚至已經(jīng)有一些廠家在出售所謂的美國(guó)產(chǎn)的白黎蘆醇保健品，如美國(guó)美安等品牌的。

然而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)乜?，這些行為還是比較倡促的。要想真正將白黎蘆醇有效，安全地，廣泛地應(yīng)用于藥品，食品領(lǐng)域，必須了解白黎蘆醇抗氧化過(guò)程的機(jī)制。自由基對(duì)生物損害的有哪些靶標(biāo)，白藜蘆醇對(duì)機(jī)體保護(hù)的又是哪些分子靶標(biāo)？同時(shí)，白黎蘆醇保護(hù)作用有著什么樣的劑量關(guān)系等等。

本發(fā)明人經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的科學(xué)研究，獲得的研究結(jié)果能夠有效地解決現(xiàn)有技術(shù)迫切需要解決的問(wèn)題，體現(xiàn)在：

(1)提供白藜蘆醇在制備評(píng)價(jià)抗氧自由基代謝的試劑中的用途。

(2)提供白藜蘆醇評(píng)價(jià)抗氧自由基代謝的方法。示例性的，該方法包括以下試驗(yàn)項(xiàng)目以評(píng)價(jià)白藜蘆醇抗氧自由基代謝的效果：過(guò)氧化氫對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響、白藜蘆醇對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的保護(hù)作用、發(fā)酵罐中的規(guī)范實(shí)驗(yàn)、氧自由基對(duì)大腸桿菌代謝流的影響、高濃度白藜蘆醇對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制。

(3)提供一種對(duì)白藜蘆醇進(jìn)行質(zhì)量控制的方法，該方法包括使用高效液相色譜法測(cè)定白藜蘆醇供試品中白藜蘆醇的含量。進(jìn)一步的，該質(zhì)量控制的方法還包括使用所述高效液相色譜法測(cè)定白藜蘆醇供試品中雜質(zhì)白藜蘆醇苷的含量。

附圖說(shuō)明

圖1：M9培養(yǎng)基中大腸桿菌在加入不同濃度雙氧水后的生長(zhǎng)曲線

圖2：M9培養(yǎng)基中大腸桿菌在加入0.015％雙氧水和不同濃度白藜蘆醇后的生長(zhǎng)曲線

圖3：13C同位素示蹤確定代謝流量的基本原理

圖4：大腸桿菌三種實(shí)驗(yàn)條件下部分碳中心代謝流量分布值和酶活變化情況

圖5：M9培養(yǎng)基中大腸桿菌在加入0.015％雙氧水和不同濃度白藜蘆醇后的生長(zhǎng)曲線

圖6：高濃度情況時(shí)，白藜蘆醇的濃度和保護(hù)效果的回歸關(guān)系圖

具體實(shí)施方式

通過(guò)下面的實(shí)施例可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，然而，本發(fā)明的范圍并不限于下述實(shí)施例。本領(lǐng)域的專業(yè)人員能夠理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變化和修飾。本發(fā)明對(duì)試驗(yàn)中所使用到的材料以及試驗(yàn)方法進(jìn)行一般性和/或具體的描述。雖然為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細(xì)描述。

實(shí)施例1：白藜蘆醇的含量測(cè)定及其中雜質(zhì)的含量測(cè)定

目前市售的白藜蘆醇多是從虎杖中提取得到的，盡管進(jìn)行了分離純化使產(chǎn)物白藜蘆醇含量達(dá)90％以上，然而其中通常還會(huì)存在少量雜質(zhì)例如白藜蘆醇苷。而白藜蘆醇苷需要經(jīng)過(guò)一系列的生物化學(xué)反應(yīng)才能形成白藜蘆醇，白藜蘆醇苷的存在對(duì)于白藜蘆醇的生物學(xué)效應(yīng)以及白藜蘆醇應(yīng)用于評(píng)價(jià)抗氧自由基代謝的方法都會(huì)有不良影響。因此，檢測(cè)白藜蘆醇產(chǎn)品中的雜質(zhì)白藜蘆醇苷含量是非常重要的。

邢琪昌等(邢琪昌，等，高效液相色譜法測(cè)定虎杖中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量，湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，15(3):33)的文獻(xiàn)中介紹了一種使用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定虎杖中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量，其中使用的HPLC的色譜條件是：色譜柱為L(zhǎng)ichrospher C18(4.6mm×250mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.03％磷酸水溶液(30：70)，梯度洗脫，流速：1.0mL/min，柱溫：30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：306nm，進(jìn)樣量：20μL，理論塔板數(shù)以白藜蘆醇計(jì)不低于3000，分離度大于1.5。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，上述方法只適用于中藥材虎杖中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷的含量測(cè)定，該中藥材虎杖中白藜蘆醇和白藜蘆醇苷二者的含量相差不大甚至白藜蘆醇苷更高；然而，本發(fā)明目前需要測(cè)定的是一種白藜蘆醇產(chǎn)品，其中含有90％以上的白藜蘆醇以及少量的白藜蘆醇苷和其它雜質(zhì)。目標(biāo)成分是白藜蘆醇，而白藜蘆醇苷為雜質(zhì)，然而根據(jù)上述文獻(xiàn)的方法，其中白藜蘆醇的保留時(shí)間大約為6分鐘，而白藜蘆醇苷保留時(shí)間大約在18分鐘，相對(duì)保留時(shí)間大約為3.0。因此使白藜蘆醇苷保留時(shí)間提前并且盡量不會(huì)造成白藜蘆醇保留時(shí)間提前以便獲得足夠的理論塔板數(shù)和其它令人滿意的色譜分析指標(biāo)，是非常必要的。為此，本發(fā)明提供以下方法以測(cè)定白藜蘆醇含量：

使用高效液相色譜法測(cè)定白藜蘆醇中白藜蘆醇的含量，其包括如下操作：

(1)中國(guó)藥典2015年版四部第59所第0512節(jié)所載的高效液相色譜法中的規(guī)范進(jìn)行測(cè)定；

(2)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-0.03％磷酸水溶液以體積比30：70為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為306nm；

取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液測(cè)定，理論板數(shù)按白藜蘆醇峰計(jì)應(yīng)不低于3000，白藜蘆醇與其最接近的雜質(zhì)峰之間的分離度應(yīng)大于1.5，白藜蘆醇與白藜蘆醇苷峰之間的分離度應(yīng)大于3.0；

(3)溶液制備：

取白藜蘆醇供試品適量，加流動(dòng)相溶解并稀釋，制成每1ml溶液中含有白藜蘆醇0.2mg的溶液，過(guò)濾，作為供試品溶液(即，200μg/ml)；

精密量取供試品溶液1ml置于100ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋刻度，搖勻，制成含白藜蘆醇濃度為2μg/ml的溶液，作為對(duì)照溶液(即，2μg/ml)；

精密稱取白藜蘆醇對(duì)照品、白藜蘆醇苷對(duì)照品適量，用流動(dòng)相溶解并制成兩種物質(zhì)濃度均為分別為200μg/ml和2μg/ml的溶液，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液(即，200μg/ml+2μg/ml)；

精密稱取白藜蘆醇對(duì)照品適量，用流動(dòng)相溶解并制成每1ml溶液中含有白藜蘆醇0.2mg的溶液，過(guò)濾，作為對(duì)照品溶液；

(4)測(cè)定：

精密量取對(duì)照溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，確定白藜蘆醇主成分的保留時(shí)間，并讀取白藜蘆醇峰的峰面積；

精密量取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算理論板數(shù)和各峰之間的分離度；

精密量取對(duì)照品溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；

精密量取供試品溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至白藜蘆醇苷保留時(shí)間的2倍，讀取供試品溶液色譜圖中主成峰峰面積和各雜質(zhì)的峰面積；

(5)結(jié)果計(jì)算：

根據(jù)供試品溶液色譜圖中主成分峰面積以及對(duì)照品溶液色譜圖中主成分峰面積和對(duì)照品溶液主成分濃度，計(jì)算供試品中白藜蘆醇的百分含量；

當(dāng)供試品中檢測(cè)到存在白藜蘆醇苷時(shí)，以對(duì)照溶液色譜圖中主成份峰面積為1.0％，計(jì)算供試品溶液色譜圖中白藜蘆醇苷相對(duì)于白藜蘆醇的百分含量，即得到供試品中的白藜蘆醇苷的含量(即，如果對(duì)照溶液主峰面積為100，供試品溶液色譜圖中雜質(zhì)白藜蘆醇苷的峰面積為115％，則白藜蘆醇苷相對(duì)于白藜蘆醇的百分含量，簡(jiǎn)稱白藜蘆醇苷含量為1.15％；供試品溶液色譜圖中雜質(zhì)白藜蘆醇苷的峰面積為87％，則白藜蘆醇苷含量為0.87％)。

以上HPLC方法，所述色譜柱的規(guī)格是：柱長(zhǎng)15～30cm、柱內(nèi)徑4.6mm、填料粒徑5μm。特別地，所述色譜柱的規(guī)格是：柱長(zhǎng)20～30cm、柱內(nèi)徑4.6mm、填料粒徑5μm。特別地，所述色譜柱的規(guī)格是：柱長(zhǎng)25cm、柱內(nèi)徑4.6mm、填料粒徑5μm。

實(shí)施例1a：使用上述以乙腈-0.03％磷酸水溶液為流動(dòng)相的色譜方法，色譜柱的規(guī)格是：柱長(zhǎng)25cm、柱內(nèi)徑4.6mm、填料粒徑5μm，結(jié)果：白藜蘆醇保留時(shí)間為6.23min，白藜蘆醇苷保留時(shí)間為18.37min，其相對(duì)于白藜蘆醇的相對(duì)保留時(shí)間為2.95?？梢?jiàn)，作為雜質(zhì)的白藜蘆醇苷雜質(zhì)峰的出峰時(shí)間較晚，這是不利于色譜測(cè)定的。還發(fā)現(xiàn)，使用乙腈-0.03％磷酸水溶液為流動(dòng)相，在進(jìn)行精密度試驗(yàn)時(shí)，取同一批白藜蘆醇樣品溶液(濃度為0.2mg/mL)，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，按白藜蘆醇峰面積計(jì)算，RSD通常在0.35～0.38％范圍內(nèi)，顯示白藜蘆醇具有優(yōu)良的精密度；但是，同樣地如果針對(duì)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液色譜圖中的各雜質(zhì)峰面積計(jì)算時(shí)，白藜蘆醇苷的RSD均在1.82～1.96％范圍內(nèi)，顯示這種雜質(zhì)的精密度不能滿足要求。在補(bǔ)充試驗(yàn)中，使用以上以乙腈-0.03％磷酸水溶液為流動(dòng)相的色譜方法，測(cè)定白藜蘆醇/白藜蘆醇苷二者以1：1的混合物時(shí)，白藜蘆醇RSD在0.35～0.37％范圍內(nèi)，白藜蘆醇苷RSD在0.37～0.41％范圍內(nèi)，顯示二者均具有優(yōu)良的精密度。申請(qǐng)人推測(cè)這種差異可能是由于供試品中兩種物質(zhì)比例偏差造成的。總之，現(xiàn)有技術(shù)無(wú)法滿足本發(fā)明供試品測(cè)試要求。

實(shí)施例1b：根據(jù)上述HPLC法，但是流動(dòng)相中使用的0.03％磷酸水溶液改為等體積的0.05％酒石酸水溶液，其它測(cè)定條件不變，色譜柱的規(guī)格是：柱長(zhǎng)25cm、柱內(nèi)徑4.6mm、填料粒徑5μm，結(jié)果：白藜蘆醇保留時(shí)間為6.11min，白藜蘆醇苷保留時(shí)間為13.62min，其相對(duì)于白藜蘆醇的相對(duì)保留時(shí)間為2.23?？梢?jiàn)，作為雜質(zhì)的白藜蘆醇苷雜質(zhì)峰的出峰時(shí)間顯示提前，這可以大大提高分析方法的效率。還發(fā)現(xiàn)，使用乙腈-0.03％酒石酸水溶液為流動(dòng)相，在進(jìn)行精密度試驗(yàn)時(shí)，取同一批白藜蘆醇樣品溶液(濃度為0.2mg/mL)，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，按白藜蘆醇峰面積計(jì)算，RSD通常在0.33～0.37％范圍內(nèi)，顯示白藜蘆醇具有優(yōu)良的精密度；還出人意料地發(fā)現(xiàn)，針對(duì)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液色譜圖中的各雜質(zhì)峰面積計(jì)算時(shí)，白藜蘆醇苷的RSD均在0.41～0.54％范圍內(nèi)，顯示這種雜質(zhì)白藜蘆醇苷的精密度完全能夠滿足要求。在補(bǔ)充試驗(yàn)中，使用以上以乙腈-0.05％酒石酸水溶液為流動(dòng)相的色譜方法，測(cè)定白藜蘆醇/白藜蘆醇苷二者以1：1的混合物時(shí)，白藜蘆醇RSD在0.36～0.38％范圍內(nèi)，白藜蘆醇苷RSD在0.35～0.38％范圍內(nèi)，顯示二者均具有優(yōu)良的精密度。這表明，使用乙腈-0.05％酒石酸水溶液為流動(dòng)相的色譜方法，不論供試品中兩種物質(zhì)的比例如何，它們均具有優(yōu)良的色譜測(cè)定性能。

以上實(shí)施例1a和實(shí)施例1b中，白藜蘆醇與其最接近的雜質(zhì)峰之間的分離度大于1.5，白藜蘆醇與白藜蘆醇苷峰之間的分離度應(yīng)大于4.0，理論板數(shù)按白藜蘆醇峰計(jì)大于5000。以上實(shí)施例1a和實(shí)施例1b中，使用的色譜柱的規(guī)格是：柱長(zhǎng)25cm、柱內(nèi)徑4.6mm、填料粒徑5μm。本發(fā)明人在補(bǔ)充試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)改用柱長(zhǎng)15cm、20cm、或30cm，但柱內(nèi)徑和填料粒徑仍分別為4.6mm和5μm，都能獲得與上述實(shí)施例1a和實(shí)施例1b類似的結(jié)果，這表明柱長(zhǎng)不影響測(cè)定。

實(shí)施例2：氧自由基對(duì)生物體的影響

1、過(guò)氧化氫對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響

為了檢驗(yàn)氧自由基對(duì)生物的影響，我們選取了大腸桿菌作為實(shí)驗(yàn)的“被試”，雙氧水作為氧自由基的代表。大腸桿菌是一種很常見(jiàn)的微生物，由于被科學(xué)家研究得比較多，以它作為實(shí)驗(yàn)是有很好的代表性。

我們先是在4個(gè)500mL的三角搖瓶，利用250mL無(wú)機(jī)M9培養(yǎng)基對(duì)大腸桿菌JM101菌株進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)基OD600值達(dá)到0.3后，分別加入終濃度為0.005％，0.01％，0.015％的雙氧水(H2O2，下文正文使用雙氧水，圖表使用H2O2)，然后記錄其OD值變化情況。這里OD600指的是某種溶液在600nm波長(zhǎng)處的吸光值。這樣的實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel畫(huà)成了圖1。從圖中，可見(jiàn)加入雙氧水的搖瓶里的大腸桿菌的生長(zhǎng)，在最開(kāi)始的30分鐘里明顯受到遏制；之后大腸桿菌的生長(zhǎng)也變慢了許多。這充分說(shuō)明了，大腸桿菌的正常生長(zhǎng)在受到雙氧水脅迫后受到很大的抑制。圖1是M9培養(yǎng)基中大腸桿菌在加入不同濃度雙氧水后的生長(zhǎng)曲線。

2、白藜蘆醇對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的保護(hù)

接下來(lái)需要檢驗(yàn)白藜蘆醇是否能夠?qū)﹄p氧水抑制大腸桿菌生長(zhǎng)起到一定的影響。這一次的實(shí)驗(yàn)設(shè)置和之前一樣，但是所有培養(yǎng)基中都添加0.015％的雙氧水。我們又在其中分別加入了25uM、50uM、100uM的白藜蘆醇。這樣可以比較不同濃度的白藜蘆醇對(duì)大腸桿菌的保護(hù)作用。將得到的結(jié)果畫(huà)為圖2，可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)白藜蘆醇的濃度在一定范圍內(nèi)變化時(shí)，雙氧水對(duì)大腸桿菌正常生長(zhǎng)的阻遏作用明顯變小了，說(shuō)明白藜蘆醇效果優(yōu)異。圖2是M9培養(yǎng)基中大腸桿菌在加入0.015％雙氧水和不同濃度白藜蘆醇后的生長(zhǎng)曲線。

3、發(fā)酵罐中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

之前的實(shí)驗(yàn)是在搖瓶中進(jìn)行的，而搖瓶培養(yǎng)里的各種物質(zhì)的濃度是在發(fā)生變化的，所以不是一個(gè)穩(wěn)定的條件，如果以后要說(shuō)明深入問(wèn)題可能存在困難。所以，想到用發(fā)酵罐進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，可以使得體系內(nèi)的各種參數(shù)都恒定。

在發(fā)酵罐上進(jìn)行了與搖瓶中類似的實(shí)驗(yàn)。在發(fā)酵罐上為了便于比較，我們將不同實(shí)驗(yàn)的洗脫速率都設(shè)置為恒定值，這也就決定了發(fā)酵罐中細(xì)菌的生長(zhǎng)速率是恒定的。在發(fā)酵罐中，反映大腸桿菌的生長(zhǎng)特性的值變成生物質(zhì)比合成速率，也就是培養(yǎng)基中每克葡萄糖能夠生成多少克的生物質(zhì)。我們測(cè)量了大腸桿菌JM101菌株，在正常培養(yǎng)基和含雙氧水培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特性。在雙氧水培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，雙氧水的濃度被精細(xì)地選擇在0.2％(V/V)，在此濃度下，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境受到足夠的擾動(dòng)而同時(shí)細(xì)胞可以維持其生長(zhǎng)速度大于等于替換速率(0.2h-1)。用于抗氧化的白藜蘆醇的濃度則選擇為20uM。我們的結(jié)果表明，在發(fā)酵罐中生物質(zhì)合成量在加入雙氧水后明顯下降，大腸桿菌的生長(zhǎng)同樣受到雙氧水很大的抑制。白藜蘆醇則可以保護(hù)大腸桿菌，使得其所受氧化劑的影響變小了。具體結(jié)果見(jiàn)下表：

表：發(fā)酵罐中脅迫實(shí)驗(yàn)的基本參數(shù)

4、氧自由基對(duì)大腸桿菌代謝流的影響

以上實(shí)驗(yàn)讓人們對(duì)氧自由基和白藜蘆醇對(duì)大腸桿菌的影響都有了非常直觀的感受。當(dāng)然，我們更想了解氧自由基為什么會(huì)對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，也就是這些參數(shù)變化的更深層次的原因。細(xì)胞攝取諸如葡萄糖等糖類，將這些糖類分解成更小的分子，利用它們來(lái)構(gòu)建DNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜和驅(qū)動(dòng)細(xì)胞運(yùn)行的能量分子。整個(gè)的過(guò)程稱作為代謝，它使得細(xì)胞能夠執(zhí)行各種功能以及生長(zhǎng)和增殖，由此創(chuàng)造了整個(gè)生物體。

在代謝系統(tǒng)中，三羧酸循環(huán)是機(jī)體將糖或其他物質(zhì)氧化而獲得能量的最有效方式；同時(shí)，三羧酸循環(huán)是糖、脂和蛋白質(zhì)三大類物質(zhì)代謝與轉(zhuǎn)化的樞紐。它的活性大小，直接決定了細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。其具體生物化學(xué)反應(yīng)如圖3所示，這些生物化學(xué)反應(yīng)組合起來(lái)，形成一個(gè)開(kāi)放的循環(huán)。三羧酸循環(huán)的運(yùn)行就是各個(gè)生化反應(yīng)的一個(gè)接力賽，各個(gè)反應(yīng)將相應(yīng)的產(chǎn)物傳遞給下一步反應(yīng)。圖3是13C同位素示蹤確定代謝流量的基本原理。

氧化劑對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響，應(yīng)該會(huì)和對(duì)大腸桿菌三羧酸循環(huán)代謝流量的影響有關(guān)。于是，之前的問(wèn)題就變成了在脅迫與保護(hù)情況下，三羧酸循環(huán)各個(gè)反應(yīng)的流量是否受到影響。然而，通過(guò)某個(gè)反應(yīng)的流量本身是一個(gè)很動(dòng)態(tài)的概念，不像物質(zhì)的量，濃度等比較容易測(cè)定。真要測(cè)量這個(gè)東西，感覺(jué)還是個(gè)問(wèn)題。通過(guò)13-C同位素示蹤來(lái)檢測(cè)代謝流量大小的方法。這種方法在原理上有些巧妙，它是利用混合了不同比例穩(wěn)定同位素(13C，12C)的葡萄糖來(lái)喂養(yǎng)大腸桿菌，當(dāng)這種葡萄糖進(jìn)入大腸桿菌后，同位素分子會(huì)隨著各個(gè)生化反應(yīng)而生產(chǎn)各種生物分子，由于不同的化學(xué)反應(yīng)對(duì)分子的碳骨架的處理不同，導(dǎo)致不同的流量對(duì)應(yīng)不同的同位素標(biāo)記狀態(tài)，通過(guò)測(cè)定這些分子碳骨架的穩(wěn)定同位素標(biāo)記狀態(tài)，我們可以反推出這些流量來(lái)。

比如圖3中一個(gè)含有3個(gè)碳的分子m，有50％全為13C標(biāo)記，50％則全為12C。這種分子會(huì)有兩種下游的反應(yīng)，一是經(jīng)過(guò)A反應(yīng)生成a，這個(gè)反應(yīng)中分子碳骨架沒(méi)有改變，然后由a再生產(chǎn)下游的n；另一個(gè)是經(jīng)過(guò)B反應(yīng)，從一個(gè)3碳的分子被拆成一個(gè)2碳分子b和一個(gè)一碳分子c。而a可以通過(guò)反應(yīng)C生成分子n，而b和c則可以通過(guò)反應(yīng)D結(jié)合生產(chǎn)分子n。但是，反應(yīng)C和反應(yīng)D來(lái)的n內(nèi)部的同位素標(biāo)記狀態(tài)卻有很大區(qū)別。單純從反應(yīng)C來(lái)的，其同位素分布狀態(tài)就如圖3x所示，單純從反應(yīng)D來(lái)的，其同位素分布狀態(tài)就如圖3z所示。而一半來(lái)自反應(yīng)C，一半來(lái)自反應(yīng)D的n，則如圖3y所示。因此，我們?nèi)绻麥y(cè)定了分子n的同位素標(biāo)記狀態(tài)，我們就可以反推出反應(yīng)C和D的值。這就是利用13C同位素示蹤方法檢測(cè)代謝流得基本原理。而檢測(cè)分子的同位素標(biāo)記狀態(tài)則可以使用質(zhì)譜，因?yàn)?3C與12C的原子質(zhì)量不一樣，相同分子如果含有的13C數(shù)量不一樣，在質(zhì)譜上會(huì)形成不同的質(zhì)譜峰。

借助實(shí)驗(yàn)室的一系列的技術(shù)和儀器。我們又開(kāi)始了我們的實(shí)驗(yàn)。這一次我們一開(kāi)始就使用了發(fā)酵罐來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)，使得整個(gè)培養(yǎng)體系處于一個(gè)恒定狀態(tài)。接下來(lái)，我們就開(kāi)始測(cè)量之前四種條件下大腸桿菌三羧酸循環(huán)各反應(yīng)的流量值。

首先收集發(fā)酵罐里面所有的培養(yǎng)基，通過(guò)離心的方式使大腸桿菌菌體與培養(yǎng)基分離。菌體再用Tris-HCl洗一到兩次，然后用6M的HCl重懸，并高溫進(jìn)行水解，使細(xì)菌菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)分解成游離的氨基酸。

標(biāo)準(zhǔn)水解方法是在110℃下水解12-24h，我們的產(chǎn)物放在105℃水解時(shí)，有不少的沉淀最后沒(méi)有能夠溶解，而且時(shí)間稍長(zhǎng)后變黑。但一般存度稍高的蛋白質(zhì)水解并不會(huì)出現(xiàn)黑褐色，因此估計(jì)是細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)被碳化造成的，尤其是細(xì)胞所含的多糖不易溶解，而產(chǎn)生黑色。當(dāng)然其中肯定有不少氨基酸被氧化，至于氧化的程度則不能完全確定。為此，將水解的溫度先降低到90℃，先水解4-5個(gè)小時(shí)(并且將菌液濃度降低)，等大部分可見(jiàn)沉淀溶解后，調(diào)到105℃水解18個(gè)小時(shí)。

將水解后的大腸桿菌樣品用專門的衍生化試劑處理后，將樣品交送入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析，得到三羧酸循環(huán)所生成的各個(gè)氨基酸分子的同位素標(biāo)記狀態(tài)。然后，將這些分子的同位素標(biāo)記狀態(tài)輸入到，實(shí)驗(yàn)室自己開(kāi)發(fā)的優(yōu)化軟件中，通過(guò)對(duì)13C標(biāo)記狀態(tài)進(jìn)行擬合，軟件給出了代謝流量的最優(yōu)估計(jì)值。

結(jié)果如圖4所示。從圖4的結(jié)果可以看到，暴露在雙氧水之下后三羧酸循環(huán)的主要限速酶代謝流量值發(fā)生了明顯的變化，異檸檬酸脫氫酶在正常的時(shí)候值為0.23，加入雙氧水后，降低為0.16，在有白藜蘆醇保護(hù)時(shí)回升至0.1。a-酮戊二酸脫氫酶在正常的時(shí)候值為0.11，加入雙氧水后，降低為0.02，在有白藜蘆醇保護(hù)時(shí)回升至0.06。這兩個(gè)酶流量的變化和大腸桿菌生長(zhǎng)狀態(tài)的變化非常一致。圖4是大腸桿菌三種實(shí)驗(yàn)條件下部分碳中心代謝流量分布值和酶活變化情況。紅色小方框中為代謝流量或者酶活在3種情況下的對(duì)比。1代表對(duì)照組，2代表雙氧水脅迫組，3代表加入白藜蘆醇的保護(hù)組。其中BIOMASS表示生物質(zhì)。

從結(jié)果中可以看到，加入雙氧水后，三羧酸循環(huán)流量降低，大腸桿菌生長(zhǎng)效率受到抑制；當(dāng)加入白藜蘆醇后，三羧酸循環(huán)流量有所回升，而相應(yīng)地大腸桿菌生長(zhǎng)抑制也得到緩解。因此，這充分說(shuō)明白藜蘆醇對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響是通過(guò)對(duì)中心碳代謝流量的影響來(lái)達(dá)到得。

5、大腸桿菌代謝流變化的原因探究

這些代謝系統(tǒng)的改變又是由什么導(dǎo)致的呢？代謝反應(yīng)都是由生物酶來(lái)催化的，而大部分的酶就是蛋白質(zhì)的一種。代謝反應(yīng)的速率的變化，會(huì)不會(huì)與酶的活力變化有關(guān)呢？

受這個(gè)思路啟發(fā)，我們想測(cè)試幾種條件下的酶活。由于之前代謝流的測(cè)定圍繞著三羧酸循環(huán)進(jìn)行，我們選定了異檸檬酸脫氫酶和□-酮戊二酸脫氫酶。酶活的測(cè)量原理相對(duì)比較簡(jiǎn)單，首先要將代測(cè)反應(yīng)耦聯(lián)一個(gè)能產(chǎn)生發(fā)色基團(tuán)的反應(yīng)。然后就是在單位時(shí)間內(nèi)，測(cè)定酶所催化生成的發(fā)色基團(tuán)的多少來(lái)代表酶活。酶活檢測(cè)的結(jié)果和流量結(jié)果一樣畫(huà)在圖5。

我們把酶活檢測(cè)的結(jié)果與代謝流量的變化情況作了一個(gè)對(duì)比，如圖5。這個(gè)圖很能說(shuō)明問(wèn)題，可以看到酶活變化和代謝流量值變化的方向是一致的，同時(shí)變化幅度也很相關(guān)，酶活的變化大的時(shí)候，代謝流量的變化也很大。因此，酶活變化和代謝流量值變化具有非常強(qiáng)的相關(guān)性。這也表明，代謝反應(yīng)的速率的變化有很大程度來(lái)自酶的活力變化。圖5是M9培養(yǎng)基中大腸桿菌在加入0.015％雙氧水和不同濃度白藜蘆醇后的生長(zhǎng)曲線。

6、白藜蘆醇對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制

白藜蘆醇雖然能有效地抗氧化，但是如果它本身濃度過(guò)高，會(huì)不會(huì)有相反的效果呢？我們又重復(fù)了之前的實(shí)驗(yàn)，但是換成了500uM，2.5mM，10mM，50mM的白藜蘆醇。結(jié)果當(dāng)白藜蘆醇濃度過(guò)大時(shí)，在濃度超過(guò)10mM時(shí)，大腸桿菌生長(zhǎng)抑制反而開(kāi)始加重，繼續(xù)增大時(shí)，抑制也很明顯。表明當(dāng)濃度過(guò)大時(shí)，白藜蘆醇本身也是對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)有抑制作用。我們將這些數(shù)據(jù)500uM，2.5mM，10mM，50mM濃度的數(shù)據(jù)畫(huà)成了圖5。這表明白藜蘆醇對(duì)生長(zhǎng)的保護(hù)是有一定的限度，任何事物都有限度，這就是所謂“過(guò)猶不及”的道理。

7、從白藜蘆醇討論紅酒飲用上限

我們知道了白藜蘆醇的抗氧化性可以保護(hù)細(xì)胞在生長(zhǎng)時(shí)免受氧化劑的威脅，但是白藜蘆醇濃度過(guò)高后，這種效果就明顯減弱了。這是不是說(shuō)，紅酒喝太多了也沒(méi)有效果了呢？我們覺(jué)得可以從我們的實(shí)驗(yàn)中做一些推導(dǎo)。我們覺(jué)得首先要計(jì)算出白藜蘆醇失效的最大濃度，這可以通過(guò)之前所進(jìn)行的500uM，2.5mM，10mM，50mM的白藜蘆醇數(shù)據(jù)進(jìn)行推導(dǎo)。我們將在圖5中0.015％雙氧水刺激時(shí)，加入白藜蘆醇后，大腸桿菌OD值的回升均值作為白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用的指標(biāo)。這樣我們手里，有了兩組數(shù)據(jù)，一個(gè)組是白藜蘆醇的濃度，一組是這些濃度對(duì)應(yīng)的保護(hù)指標(biāo)。我們將白藜蘆醇的濃度取了底為10的對(duì)數(shù)后，根據(jù)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行了線性回歸，得到了線性擬合方程Y＝0.633-0.119*X。擬合圖如圖6，Y軸是白藜蘆醇濃度的對(duì)數(shù)值，X軸是這些濃度對(duì)應(yīng)的保護(hù)指標(biāo)。將這個(gè)方程外推到保護(hù)指標(biāo)為零，得到白藜蘆醇失效的濃度為0.2M。圖6是高濃度情況時(shí)，白藜蘆醇的濃度和保護(hù)效果的回歸關(guān)系圖。

但這只是針對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)菌，而對(duì)真實(shí)的吸收到人體的情況又不一樣。為了用一個(gè)較為準(zhǔn)確的人體模型模擬來(lái)估計(jì)上限，我們查閱了好多資料，找到了一些有用的參數(shù)，

1)在刊登于《中外葡萄與葡萄酒》雜志上的“干紅葡萄酒中白藜蘆醇的含量與分布”(《中外葡萄與葡萄酒》，2004(2):8-10)一文中，可以找到紅酒中白藜蘆醇的含量，一般在5-30uM之間。我們?nèi)?5uM作為代表值X。

2)在第四軍醫(yī)大梁力的碩士學(xué)位論文“乙?；邹继J醇和白藜蘆醇在SD大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究”中，可以找到大鼠以438um/kg的量口服白藜蘆醇后的血藥最高峰值為12uM，吸收效率為0.0273/kg我們以此代替人的吸收效率。那么，一個(gè)質(zhì)量為Y kg個(gè)人的效率為0.0273/Y。

3)我們以剛剛推定的白藜蘆醇失效的濃度為0.2M為基準(zhǔn)，那么要想使得白藜蘆醇的血藥濃度達(dá)到這一標(biāo)準(zhǔn)，需要飲用的紅葡萄酒體積為

V＝(0.2*Y/0.0273)/X

假設(shè)一個(gè)人體60KG，那么可以得到白藜蘆醇失效的所需紅酒量322344.25L,顯然這個(gè)濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常人能夠飲用的量。同時(shí)，在這個(gè)計(jì)算中還未考慮到白藜蘆醇吸收后，經(jīng)過(guò)首關(guān)效應(yīng)被代謝為其他衍生物；真核細(xì)胞存在線粒體保護(hù)大三羧酸循環(huán)等作用。故而，日常生活中，除開(kāi)紅酒中的其他物質(zhì)如酒精，單就白藜蘆醇而言，我們可以放心大膽飲用紅酒，而不必?fù)?dān)心白藜蘆醇的作用減弱。當(dāng)然，因?yàn)橛捎谝韵乱恍┰颍缥覀兊膶?duì)象是大腸桿菌；白藜蘆醇在人體內(nèi)可能會(huì)被代謝成其他成分；血液濃度還和細(xì)胞外濃度不完全相同等，真實(shí)情況和我們的模型很有差距。

8、實(shí)驗(yàn)總結(jié)：

大腸桿菌在遭受一定濃度的氧自由基(本文中為過(guò)氧化氫)脅迫時(shí)，其生長(zhǎng)會(huì)受到明顯抑制。這種現(xiàn)象無(wú)論是在搖瓶中，還是在發(fā)酵罐中都很明顯，所以氧自由基對(duì)生物是有害的；

白藜蘆醇能緩解，減輕氧自由基對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)抑制和影響。而且，這些保護(hù)作用存在一定的劑量依賴現(xiàn)象。也就是說(shuō)在我們的實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，氧自由基濃度越大，則抑制現(xiàn)象就越嚴(yán)重；而白藜蘆醇濃度越高，則其表現(xiàn)出來(lái)的保護(hù)作用也就越強(qiáng)；

大腸桿菌在脅迫與保護(hù)時(shí)所產(chǎn)生的生長(zhǎng)的抑制與恢復(fù)現(xiàn)象都與大腸桿菌的代謝狀態(tài)緊密相關(guān)，大腸桿菌中心碳代謝系統(tǒng)三羧酸循環(huán)中通過(guò)異檸檬酸脫氫酶和a-酮戊二酸酶的流量在加入氧自由基或者白藜蘆醇后都有明顯變化。中心碳代謝系統(tǒng)的變化可能是大腸桿菌生長(zhǎng)抑制與恢復(fù)的主要原因；

在上述實(shí)驗(yàn)中，大腸桿菌的中心碳代謝酶催化流量的變化與該酶的酶活變化在方向上完全一致，在數(shù)值上存在很大的相關(guān)性。酶的變化可以解釋代謝流量的變化；

當(dāng)白藜蘆醇濃度超過(guò)一定限度，數(shù)量級(jí)發(fā)生變化后，濃度越高，起保護(hù)作用反而越弱，達(dá)到極限后，其保護(hù)作用明顯減弱到不明顯。我們對(duì)白藜蘆醇濃度增長(zhǎng)與保護(hù)作用變化之間的定量關(guān)系進(jìn)行了擬合，得到了回歸曲線，并將該曲線外推到零點(diǎn)，得到了白藜蘆醇完全失活的濃度值。通過(guò)假定的模型，計(jì)算出了，白藜蘆醇完全失活時(shí)對(duì)應(yīng)的紅酒的量，遠(yuǎn)高于日常紅酒飲用量。結(jié)果說(shuō)明，我們無(wú)需擔(dān)心紅酒喝多了白藜蘆醇沒(méi)有效果。

研究意義：通過(guò)對(duì)白黎蘆醇的實(shí)驗(yàn)探究，發(fā)現(xiàn)了白黎蘆醇抗氧化的機(jī)理，也意識(shí)到白黎蘆醇的藥用價(jià)值。特別是，我們對(duì)白藜蘆醇濃度增長(zhǎng)與保護(hù)作用變化之間的定量關(guān)系進(jìn)行了擬合，得到了回歸曲線，并將該曲線外推到零點(diǎn)，從而得到了白藜蘆醇完全失活的濃度值。通過(guò)文獻(xiàn)挖掘假定的人體吸收和稀釋模型，計(jì)算出了白藜蘆醇完全失活時(shí)對(duì)應(yīng)的紅酒的量，遠(yuǎn)高于日常紅酒飲用量，說(shuō)明，我們無(wú)需擔(dān)心紅酒喝多了白藜蘆醇沒(méi)有效果。這對(duì)我們飲用紅酒具有參考價(jià)值。

當(dāng)然，由于所做實(shí)驗(yàn)有一定的局限性，我們只針對(duì)大腸桿菌進(jìn)行研究；白藜蘆醇在人體內(nèi)可能會(huì)被代謝成其他成分；血液濃度還和細(xì)胞外濃度不完全相同等。真實(shí)情況和我們的模型很有差距。但是在進(jìn)一步的研究中，用該課題所提供的研究方法，可對(duì)不同的自由基，不同動(dòng)物細(xì)胞，不同的酶的代謝過(guò)程等多方面進(jìn)行研究是否同樣能達(dá)到防止代謝過(guò)程被破壞的作用。另外，一般事物具有兩面性，對(duì)于白黎蘆醇是否有毒性，其毒害作用也將納入今后的研究方向。明確白黎蘆醇的作用機(jī)理，為我們今后更加全面，更加深刻認(rèn)識(shí)這一物質(zhì)奠定了基礎(chǔ)，也為實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)藥用白黎蘆醇提供理論指導(dǎo)。