相關(guān)申請的交叉參考本申請要求2014年12月5日提交的美國臨時申請no.62/088,465,2015年2月6日提交的美國臨時申請no.62/113,317和2015年5月8日提交的美國臨時申請no.62/158,791的優(yōu)先權(quán)，將其公開內(nèi)容以其整體按引用并入本文中用于所有目的。發(fā)明背景炎性腸病(ibd)發(fā)生于全世界并且影響數(shù)百萬人，是用于描述未知病因的胃腸道失調(diào)的集合術(shù)語：克羅恩病(cd)、潰瘍性結(jié)腸炎(uc)和未定型結(jié)腸炎(ic)。ibd與腸易激綜合征(ibs)合在一起，全部美國人的一半在生命過程中受到其影響，對于ibd，支出超過$26億美元，而對于ibs，超過$80億美元。導(dǎo)致這些高醫(yī)療成本的一個主要決定因素是難于診斷消化系統(tǒng)疾病和這些疾病的進展。生產(chǎn)力的喪失會加劇ibd和ibs的成本支出，患有這些病癥的人每年比國家平均數(shù)多丟失至少8天的工作日。盡管抗-tnfα療法在ibd治療中獲得成功，但仍有患者亞群難以治療，凸顯了未能滿足的對新療法的醫(yī)療需求。維多珠單抗(vedolizumab)是消化道特異性的，α4β7整聯(lián)蛋白中和性單克隆抗體，其不影響外周血細(xì)胞計數(shù)并且看起來缺乏全身性效應(yīng)。維多珠單抗是一種用于管理難治性患者的新的抗炎治療可選方案。此外，優(yōu)斯它單抗(ustekinumab)是il12p40單克隆抗體，其是另一種新的ibd治療劑。然而，對于在ibd患者中有效使用這些新的治療劑，需要有可用的能準(zhǔn)確測量生物制品(如維多珠單抗和優(yōu)斯它單抗)水平的診斷試驗。因此，本領(lǐng)域需要檢測試驗用于檢測患者樣品中的生物制品(如維多珠單抗和優(yōu)斯它單抗)的存在或水平，以監(jiān)控藥物治療和指導(dǎo)治療決定。這樣的檢測試驗特別可以用于監(jiān)控藥物功效和相應(yīng)地優(yōu)化療法從而通過個性化方案對疾病(如，潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病)實現(xiàn)治療管理，這樣的檢測試驗可以包括評價疾病過程和臨床參數(shù)，如藥效動力學(xué)、疾病活動指數(shù)、疾病負(fù)荷和炎癥生物標(biāo)志物。本發(fā)明滿足了這種需求并且還提供了相關(guān)的優(yōu)勢。發(fā)明簡述本發(fā)明提供了新的用于檢測和測量樣品中生物制品的存在或水平的間接均相遷移率變動試驗(indirecthomogeneousmobilityshiftassay)。本發(fā)明的試驗尤其可以用于檢測和測量靶向復(fù)雜抗原的生物制品的存在或水平，所述抗原包括細(xì)胞表面蛋白、跨膜蛋白、高度糖基化蛋白、多聚體蛋白等。由此，本發(fā)明可以提供信息用于指導(dǎo)針對接受生物制品治療的受試者作出的治療決定、以及在優(yōu)化治療、降低毒性和/或監(jiān)控生物療法的治療功效方面改善準(zhǔn)確度。本發(fā)明還提供，適用于本文所述試驗的分離的可溶性α4β7整聯(lián)蛋白雜二聚體和分離的可溶性il-12p40單體。在某些方面中，本發(fā)明提供，用于測定樣品中生物制品的存在或水平的方法，該方法包括：(a)將樣品接觸可以結(jié)合生物制品的未標(biāo)記的可溶性抗原，以在抗原和樣品中的生物制品之間形成未標(biāo)記的復(fù)合物；(b)將來自步驟(a)的樣品接觸標(biāo)記形式的生物制品，以在抗原和標(biāo)記的生物制品之間形成標(biāo)記的復(fù)合物；(c)將未標(biāo)記和標(biāo)記的復(fù)合物進行大小排阻色譜，以將未標(biāo)記和標(biāo)記的復(fù)合物與游離的標(biāo)記生物制品分離，并檢測游離的標(biāo)記生物制品的量；和(d)將步驟(c)中檢測到的游離的標(biāo)記生物制品的量與已知量的生物制品的標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較，由此確定樣品中生物制品的存在或水平。在一些實施方案中，生物制品包括抗體、抗體片段、蛋白、多肽、肽、融合蛋白、多價結(jié)合蛋白、抗體-藥物綴合物、疫苗、核酸、糖、其重組形式、其工程化形式及其組合。在某些實施方案中，抗原是膜結(jié)合蛋白、糖基化蛋白、多聚體蛋白、不溶性蛋白、難以表達或純化的蛋白和/或大蛋白的可溶形式(例如，可溶性片段、變體，或單體形式)。在某些情況中，抗原是膜結(jié)合蛋白的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域(例如，可溶性細(xì)胞因子受體胞外結(jié)構(gòu)域)。在某些其他情況中，抗原是可溶性同源二聚體或異源二聚體，其包含兩個膜結(jié)合蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域(例如，可溶性整聯(lián)蛋白異源二聚體)。在再其他情況中，抗原是在分離和/或純化后不發(fā)生多聚化并且保持單體形式的可溶性蛋白(例如，具有一個或多個半胱氨酸殘基被突變以最小化或消除多聚體形成的可溶性細(xì)胞因子變體)。在其他實施方案中，樣品是全血、血清或血漿樣品，例如，來自接受生物制品治療的受試者。在優(yōu)選實施方案中，樣品是血清。在特定實施方案中，受試者患有疾病或病癥，例如自身免疫疾病(例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、炎性疾病(例如，炎性腸病(ibd)，如克羅恩病(cd)或潰瘍性結(jié)腸炎(uc)，或癌癥。在特定實施方案中，通過將(例如，兩倍)連續(xù)稀釋的已知量的生物制品與抗原和標(biāo)記的生物制品一起孵育來產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。在某些實施方案中，將游離的標(biāo)記生物制品的曲線下面積(auc)相對于自標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的生物制品的已知量(例如，已知量的對數(shù))進行作圖，通過內(nèi)推(例如，基于游離的標(biāo)記生物制品的峰面積大小)計算樣品中的生物制品的水平。在其他實施方案中，將加入標(biāo)記生物制品的儲液中的游離標(biāo)記物用作標(biāo)記的生物制品的上樣對照。將游離的標(biāo)記生物制品與游離標(biāo)記物的比值相對于生物制品的已知量進行作圖。在一個特定實施方案中，按照本文中所述的，使用大小排阻色譜，用間接均相遷移率變動試驗，測定抗-α4β7整聯(lián)蛋白藥物(例如，維多珠單抗)的存在和/或水平。在另一個特定實施方案中，按照本文中所述的，使用大小排阻色譜，用間接均相遷移率變動試驗，測定抗-il12p40藥物(例如，優(yōu)斯它單抗)的存在和/或水平。在其他實施方案中，使用例如美國專利no.8,574,855和8,865,417以及美國專利公開no.2014/0051184和2014/0141983中所述的均相遷移率變動試驗，測定對抗抗-α4β7整聯(lián)蛋白藥物和抗-il12p40藥物以及其他生物制品產(chǎn)生的抗-藥物抗體(ada)(例如，包括haca、haha等的自身抗體)的存在和/或水平，上述專利申請的公開內(nèi)容以其整體按引用并入用于所有目的。在其他方面中，本發(fā)明提供分離的可溶性α4整聯(lián)蛋白多肽，其包含與seqidno:1或seqidno:3具有至少80％同一性的氨基酸序列。再在其他方面中，本發(fā)明提供分離的可溶性β7整聯(lián)蛋白多肽，其包含與seqidno:2或seqidno:4具有至少80％同一性的氨基酸序列。在特定實施方案中，本發(fā)明提供分離的可溶性α4β7整聯(lián)蛋白異源二聚體，其包含：(a)具有與seqidno:1具有至少80％同一性的氨基酸序列的α4整聯(lián)蛋白多肽，其中該α4整聯(lián)蛋白多肽連接結(jié)合對的第一成員(例如，seqidno:3)，和(b)具有與seqidno:2具有至少80％同一性的氨基酸序列的β7整聯(lián)蛋白多肽，其中β7整聯(lián)蛋白多肽連接結(jié)合對的第二成員(例如，seqidno:4)。在某些其他方面中，本發(fā)明提供分離的可溶性il-12p40多肽，其包含與seqidno:6、7、11、12或13具有至少80％同一性的氨基酸序列。在特定實施方案中，用于本發(fā)明的間接均相遷移率變動試驗中的未標(biāo)記可溶性抗原包括本文中所述的分離的可溶性α4β7整聯(lián)蛋白異源二聚體或分離的可溶性il-12p40多肽。在進一步的方面中，本發(fā)明提供編碼本文中所述的可溶性多肽的表達載體，包含所述表達載體的宿主細(xì)胞和用于產(chǎn)生本文中所述的可溶性多肽的方法。從以下詳述和附圖，本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點。附圖簡述圖1顯示本發(fā)明的間接均相遷移率變動試驗(hmsa)的原理。使用維多珠單抗(“vlm”或“vedo”)作為非限制性實例，在第一步中，將血清連同整聯(lián)蛋白α4β7和稀釋緩沖液一起加入96孔平板中。在第二步中，加入標(biāo)記的vlm(例如，vedoalexa488)。然后將樣品按序注射到hplc大小排阻柱上。圖2顯示在本發(fā)明一個實施方案中vedoalexa48(左)和vedoalexa488+整聯(lián)蛋白α4β7(右)的色譜圖，其中顯示保留時間(x-軸)和光單位(y-軸)。兩者都在4％標(biāo)準(zhǔn)人血清中。注意，抗原結(jié)合大部分標(biāo)記的vlm。圖3顯示在本發(fā)明一個實施方案中來自標(biāo)準(zhǔn)曲線的色譜圖疊加，其中顯示vlm試驗的各組分的保留時間(x-軸)和光單位(y-軸)?！皏edoalexa488/α4β7”＝結(jié)合可溶性α4β7異源二聚體的alexa488-標(biāo)記的vlm?！癮lexa488”＝封閉的(例如，滅活的)alexa488上樣對照。注意，當(dāng)存在越多治療性vlm時，游離vedoalexa488峰面積越大。圖4顯示在本發(fā)明一個實施方案中vlm標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用濃度范圍在0.15625μg/ml至80μg/ml的vlm連續(xù)稀釋物，產(chǎn)生該標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5顯示在本發(fā)明一個實施方案中vlm藥物試驗的驗證。使用以0.15625μg/ml至80μg/ml濃度范圍的vlm連續(xù)稀釋物產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算空白限(lob)、檢出限(lod)、定量下限(llqq)和定量上限(ulqq)。圖6顯示在本發(fā)明一個實施方案中vlm藥物試驗的試驗內(nèi)精確度和準(zhǔn)確度。圖7顯示在本發(fā)明一個實施方案中抗-維多珠單抗自身抗體(atv)試驗的保留時間(x-軸)和光單位(y-軸)。圖8顯示在本發(fā)明一個實施方案中atv試驗的驗證。圖9顯示在本發(fā)明一個實施方案中atv試驗的驗證。圖10顯示在本發(fā)明一個實施方案中atv試驗的試驗間精確度。圖11顯示在本發(fā)明一個實施方案中優(yōu)斯它單抗(utk)藥物試驗驗證。使用以0.078μg/ml至40μg/ml濃度范圍的utk連續(xù)稀釋物產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算空白限(lob)、檢出限(lod)、定量下限(llqq)和定量上限(ulqq)。圖12顯示在本發(fā)明一個實施方案中針對優(yōu)斯它單抗的自身抗體(atu)的試驗的驗證。圖13顯示本發(fā)明的可溶性α4整聯(lián)蛋白抗原和可溶性β7整聯(lián)蛋白抗原的示例性實施方案的示意圖。左：全長蛋白。右：具有acid-base肽的半胱氨酸橋的截短α4β7整聯(lián)蛋白異源二聚體。圖14顯示，對于(a)(vlm)和(b)維多珠單抗自身抗體(atv)，人血清中藥物稀釋的線性。圖15顯示血清中常見干擾因素的分析：(a)溶血的血清干擾；(b)脂血(lipemic)的血清干擾；和(c)rf血清干擾。圖16顯示優(yōu)斯它單抗(utk)均相遷移率變動試驗(hmsa)的原理。圖17顯示，對于(a)utk和(b)優(yōu)斯它單抗的自身抗體(atu)，正常人血清中稀釋的線性。圖18顯示血清中常見干擾因素的分析：(a)溶血的血清干擾；(b)脂血(lipemic)的血清干擾；和(c)rf血清干擾。圖19顯示在本發(fā)明vlm試驗的一個實施方案中整聯(lián)蛋白α4β7底物干擾。圖20顯示使用固定量的標(biāo)記維多珠單抗(“vedo488”)和整聯(lián)蛋白α4β7抗原(左上)以及2-倍提高(右上)或4-倍提高(左下)量的兩種試劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意，曲線的頂端在較高的vlm濃度下飽和。類似地，底端在稍高一些的vlm水平上變平。發(fā)明詳述i.引言本發(fā)明部分地基于如下發(fā)現(xiàn)：使用大小排阻色譜，間接均相遷移率變動試驗(hmsa)對于測量靶向具有以下一個或多個特征的抗原的生物制品的存在或水平特別有利：細(xì)胞表面或膜結(jié)合的、(高度)糖基化的、多聚體的(例如，形成異源二聚體、同源二聚體等)、不溶的、難以表達的、難以純化的、尺寸大的、及其組合。在某些方面中，使用抗原的可溶形式(例如，可溶性片段、變體或單體)可以克服與具有以上一個或多個特征的抗原相關(guān)的困難和局限性，使得能夠精確和準(zhǔn)確測量來自接受生物制品治療的患者的樣品中的任何目標(biāo)生物制品。本發(fā)明的間接試驗背后的原理是，獲自接受生物制品治療的患者的樣品(例如，血清)中(未標(biāo)記)生物制品的量決定了有多少未標(biāo)記抗原可以保持游離以結(jié)合標(biāo)記形式的生物制品。通過追蹤游離的(未結(jié)合的)標(biāo)記生物制品的面積變化，可以確定患者樣品中(未標(biāo)記)生物制品的存在或水平。更具體地，標(biāo)記和未標(biāo)記生物制品的相對量(例如，比值)決定了有多少抗原可以與之結(jié)合并決定了在大小排阻色譜后游離的標(biāo)記生物制品的量(例如，峰面積)。然后可以將該游離的標(biāo)記生物制品的量(例如，峰面積)與已知量的生物制品的標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較，以高靈敏度和動態(tài)范圍來提供患者樣品中生物制品水平的準(zhǔn)確測量。在某些實施方案中，計算大小排阻色譜后游離的標(biāo)記生物制品的峰面積大小，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，以內(nèi)推患者樣品中生物制品的濃度。fda要求在臨床試驗過程中進行藥物動力學(xué)和耐受性(例如，免疫應(yīng)答)研究，借由這一事實可以說明測量生物制品的血清濃度的重要性。本發(fā)明還可以用于監(jiān)控接受這些藥物的患者，以確保患者獲得正確的劑量、藥物不會太快從身體清除、以及患者不產(chǎn)生對抗所述藥物的免疫應(yīng)答。此外，本發(fā)明還可以用于指導(dǎo)由于初始藥物失敗而在不同藥物之間進行的轉(zhuǎn)換。ii.定義如本文中使用的，除非另外指出，以下術(shù)語具有歸屬于它們的含義。如本文中使用的術(shù)語“一個(a)”、“一個(an)”或“該(the)”不僅包括具有一個成員的方面，而且還包括具有超過一個成員的方面。例如，除非文中另有清楚指明，否則單數(shù)形式“一個(a)”、“一個(an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)指代物。術(shù)語“競爭”、“基于競爭的”和“間接”在本文中可互換使用，是指用于測定樣品中(未標(biāo)記)生物制品的存在或水平的本發(fā)明試驗，依賴于檢測在將未標(biāo)記抗原和標(biāo)記的生物制品(按序)加入樣品中后留在樣品中的游離(未結(jié)合的)標(biāo)記生物制品的量。術(shù)語“vlm”、“vdz”和“vedo”在本文中可互換使用，是指維多珠單抗。如本文中使用的術(shù)語“生物制品”或“生物制劑”或“生物藥物”包括從生物系統(tǒng)(例如，活的生物體)生產(chǎn)或提取的產(chǎn)品和物質(zhì)。生物制品的非限制性實例包括抗體、抗體片段、蛋白、多肽、肽、融合蛋白(例如，ig融合蛋白或fc融合蛋白)、多價結(jié)合蛋白(例如，dvdig)、抗體-藥物綴合物、疫苗、核酸、糖、其重組形式、其工程化形式，及其組合。術(shù)語“抗體”包括，通過共價(二硫化物)和非共價相互作用結(jié)合在一起的兩個相同輕鏈(～220個氨基酸)和兩個相同重鏈(～440個氨基酸)組成的“y-形”大分子(150kda)。每個輕鏈和重鏈由含有一個鏈內(nèi)二硫鍵的恒定區(qū)或可變區(qū)的重復(fù)區(qū)段組成?？勺儏^(qū)位于輕鏈和重鏈的n-端，而恒定區(qū)位于輕鏈和重鏈的c-端。輕鏈和重鏈的n-端一起形成抗原結(jié)合位點。輕鏈由一個可變結(jié)構(gòu)域和一個恒定結(jié)構(gòu)域組成，而重鏈由一個可變結(jié)構(gòu)域和三個恒定結(jié)構(gòu)域組成。位于“y”的兩個末端的是兩個相同(二價)抗原結(jié)合位點。由于柔性鉸鏈區(qū)，兩個抗原結(jié)合位點之間的距離可以變化，并且因此，可以極大地提高抗原結(jié)合效率。通過重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈可變區(qū)(vl)的配對，引起抗原結(jié)合區(qū)的形成?？勺儏^(qū)氨基酸序列的變化導(dǎo)致抗原結(jié)合位點的巨大多樣性，而最大的變化發(fā)生在三個超變區(qū)中，稱為互補決定區(qū)(cdr)?？贵w的尾區(qū)，稱為fc區(qū)，對于每個重鏈，由兩個恒定結(jié)構(gòu)域(ch2和ch3)組成。fc區(qū)通過結(jié)合嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的fc受體，負(fù)責(zé)募集效應(yīng)子功能。術(shù)語“抗原”包括與生物制品(例如，特異性地)結(jié)合或相互作用的任何分子、試劑或物質(zhì)。作為一個非限制性實例，抗原包括膜結(jié)合蛋白、糖基化蛋白、多聚體蛋白、不溶性蛋白、難以表達或純化的蛋白和/或大蛋白的可溶性片段、變體或單體。作為另一個非限制性實例，抗原包括細(xì)胞表面分子(如整聯(lián)蛋白受體(例如，α4β7整聯(lián)蛋白))的可溶性片段，其中可溶性片段含有相應(yīng)全長分子的一個或多個胞外結(jié)構(gòu)域(例如，包含來自相應(yīng)全長α4和β7蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域序列的可溶性α4β7抗原異源二聚體)。作為再另一個非限制實例，抗原包括細(xì)胞因子，如tnfα或其亞基，如不形成同源二聚體或異源二聚體的il-12p40。術(shù)語“大小排阻色譜”或“sec”包括，基于分子的大小和/或流體力學(xué)體積分離溶液中的分子的色譜方法。其適用于大的分子或大分子復(fù)合物，如蛋白及其綴合物。通常，當(dāng)使用水性溶液將樣品運輸通過柱子時，該技術(shù)稱為凝膠過濾色譜。術(shù)語“復(fù)合物”包括，結(jié)合(例如，通過非共價方式)生物制品(例如，未標(biāo)記或標(biāo)記的生物制品)的抗原、和結(jié)合(例如，通過非共價方式)對抗生物制品的自身抗體的生物制品(例如，標(biāo)記的生物制品)。如本文中使用的，通過術(shù)語“標(biāo)記”修飾的實體包括，與按經(jīng)驗可檢測的另一個分子或化學(xué)實體綴合的任何抗原、分子、蛋白、酶、抗體、抗體片段、細(xì)胞因子或相關(guān)物質(zhì)。適合作為標(biāo)記的化學(xué)物質(zhì)包括，但不限于，熒光染料，例如，alexa染料，如alexa488、量子點、光學(xué)染料、發(fā)光染料和放射性核素，例如，125i。短語“熒光標(biāo)記檢測”包括用于檢測熒光標(biāo)記的手段。用于檢測的手段包括，但不限于，分光計、熒光計、光度計和通常與色譜儀器合并的檢測裝置，如但不限于，大小排阻-高效液相色譜，例如，但不限于，agilent-1200hplc系統(tǒng)。術(shù)語“受試者”、“患者”或“個體”通常包括人，但也包括其他動物，例如，其他靈長類、嚙齒動物、犬、貓、馬、綿羊、豬等。術(shù)語“樣品”包括獲自個體的任何生物樣本。樣品包括，不限于，全血、血漿、血清、紅細(xì)胞、白細(xì)胞(例如，外周血單核細(xì)胞(pbmc)、多形核(pmn)細(xì)胞)、導(dǎo)管灌洗液、乳頭抽吸物、淋巴(例如，淋巴結(jié)中散布的腫瘤細(xì)胞)、骨髓抽吸取、唾液、尿液、糞(即，糞便)、痰液、支氣管灌洗液、淚液、細(xì)針抽吸物(例如，通過隨機乳暈外圍細(xì)針吸引收集)、任何其他體液、組織樣品(如炎癥部位的活檢物(例如，針吸活檢物))、其細(xì)胞提取物、和源自這些體液或組織中的一種或多種的免疫球蛋白富集級分。在一些實施方案中，樣品是全血、其分級組分，如血漿、血清或細(xì)胞沉淀物，或其免疫球蛋白富集級分。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，在分析前，可以稀釋樣品，如血清樣品。在某些實施方案中，通過使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)分離pbmc和/或pmn來獲得樣品。在某些其他實施方案中，樣品是組織活檢物，例如，來自炎癥部位，如胃腸道或滑膜組織的一部分。應(yīng)用于核酸或多肽時，術(shù)語“分離的”表示，核酸或多肽基本上不含自然狀態(tài)下與其相關(guān)的其他細(xì)胞組分。優(yōu)選是均質(zhì)狀態(tài)，但也可以是干的或水溶液。通常使用分析化學(xué)技術(shù)，如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜，來測定純度和均質(zhì)度。當(dāng)多肽是制備物中存在的主要物質(zhì)時，該多肽是基本上純化的。特別地，分離的基因與位于基因側(cè)翼的編碼目標(biāo)基因之外的其他蛋白的開放閱讀框分離。術(shù)語“純化的”表示核酸或多肽在電泳凝膠中產(chǎn)生基本上一個條帶。特別地，這意味著核酸或多肽為至少約80％純、至少約85％純、至少約90％純、至少約95％純或至少約99％純。對于多肽，術(shù)語“可溶性”是指，可以使用宿主細(xì)胞或無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)以可溶的功能形式制備的多肽。例如，可溶性蛋白不形成包括錯誤折疊和/或功能上無活性多肽的不溶性聚集物。術(shù)語“核酸”或“多肽”包括單-或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非另有限制，該術(shù)語包括含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，其與參照核酸具有相似的結(jié)合特性并且以天然產(chǎn)生的核苷酸相似的方式代謝。除非另外指出，一個具體的核酸序列還隱含包括其保守性修飾的變體(例如，簡并密碼子置換)、等位基因、直系同源物、snp和互補序列以及明示的該序列。具體地，可以通過產(chǎn)生其中一個或多個選定(或全部)密碼子的第三位被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基置換的序列來實現(xiàn)簡并密碼子置換(batzer等，nucleicacidres.19:5081(1991)；ohtsuka等，j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；和cassol等，(1992)；rossolini等，mol.cell.probes8:91-98(1994))。術(shù)語核酸可以與基因、cdna和基因編碼的mrna互換使用。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互換使用，包括氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是相應(yīng)天然氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨基酸聚合物、以及天然氨基酸的聚合物和非天然氨基酸的聚合物。如本文中使用的，該術(shù)語包括任何長度的氨基酸鏈，包括全長蛋白、其截短形式或片段，其中氨基酸殘基由共價肽鍵連接。術(shù)語“氨基酸”是指天然產(chǎn)生的和非天然的氨基酸，以及以與天然氨基酸相似的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。氨基酸在本文中可以通過其名稱、其通常已知的三字母符號、或iupac-iub生化命名委員會推薦的其單字母符號來提及。另外，核苷酸可以通過其通常公認(rèn)的單字母代碼來提及。本發(fā)明方法的步驟無需一定以呈現(xiàn)它們的特定順序來實施。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，本發(fā)明方法步驟的其他順序也涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。括號，“[]”表示括號內(nèi)的物質(zhì)通過其濃度來提及。iii.實施方案的描述本發(fā)明提供新的用于檢測和測量樣品中生物制品的存在或水平的間接均相遷移率變動試驗。本發(fā)明的試驗對于檢測靶向復(fù)雜抗原或大抗原的生物制品的存在或水平特別有利，所述抗原包括細(xì)胞表面蛋白、跨膜蛋白、高度糖基化的蛋白和多聚體蛋白、以及不能純化的抗原、不純的抗原和部分或基本上純化的抗原。本發(fā)明還提供，適用于本文中所述試驗的分離的可溶性α4β7整聯(lián)蛋白異源二聚體和分離的可溶性il-12p40單體。在一個方面中，本發(fā)明提供用于測定樣品中生物制品的存在或水平的方法，該方法包括：(a)將樣品接觸結(jié)合生物制品的未標(biāo)記的可溶性抗原，在抗原和樣品中的生物制品之間形成未標(biāo)記的復(fù)合物(例如，多個未標(biāo)記的復(fù)合物)；(b)將來自步驟(a)的樣品接觸標(biāo)記形式的生物制品(“標(biāo)記的生物制品”)，在抗原和標(biāo)記的生物制品之間形成標(biāo)記的復(fù)合物(例如，多個標(biāo)記的復(fù)合物)；(c)將(例如，多個)未標(biāo)記和標(biāo)記的復(fù)合物進行大小排阻色譜，以將(例如，多個)未標(biāo)記和標(biāo)記的復(fù)合物與游離的標(biāo)記生物制品分離，并檢測游離的標(biāo)記生物制品的量；和(d)將步驟(c)中檢測的游離標(biāo)記生物制品的量與已知量的生物制品的標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較，由此確定樣品中生物制品的存在或水平。在一些實施方案中，生物制品包括抗體、抗體片段、蛋白、多肽、肽、融合蛋白、多價結(jié)合蛋白、抗體-藥物綴合物、疫苗、核酸、糖、其重組形式、其工程化形式及其組合。在特定實施方案中，生物制品包括抗體(例如，單克隆抗體)或其片段(例如，單克隆抗體的抗原結(jié)合片段)或其綴合物(例如，抗體-藥物綴合物)。基于抗體的生物制品的非限制性實例顯示于表1中。在特定實施方案中，本發(fā)明的方法檢測樣品中未結(jié)合(游離)的生物制品的存在和/或測量樣品中未結(jié)合(游離)的生物制品的含量，例如，樣品中未結(jié)合其(內(nèi)源性)靶抗原或其片段的生物制品的群。在某些實施方案中，抗原是膜結(jié)合蛋白、(高度)糖基化蛋白、多聚蛋白、不溶性蛋白、難以表達或純化的蛋白和/或大蛋白的可溶形式(例如，可溶性片段、變體，或單體形式)。在某些情況中，抗原是膜結(jié)合蛋白的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域(例如，可溶性細(xì)胞因子受體胞外結(jié)構(gòu)域)。在某些其他情況中，抗原是可溶性同源二聚體或異源二聚體，其包含兩個膜結(jié)合蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域(例如，可溶性整聯(lián)蛋白異源二聚體)。再在其他情況中，抗原是一旦分離和/或純化后不發(fā)生多聚化并且保持單體形式的可溶性蛋白(例如，具有一個或多個半胱氨酸殘基被突變以最小化或消除多聚體形成的可溶性細(xì)胞因子變體)。在一些實施方案中，抗原是細(xì)胞表面分子(例如，細(xì)胞粘附分子(cam))的可溶性片段(例如，胞外結(jié)構(gòu)域)。cam的非限制性實例包括免疫球蛋白超家族(igsf)cam、整聯(lián)蛋白、鈣粘蛋白和選擇蛋白。igsfcam是位于細(xì)胞表面上的各種多肽或蛋白中的任何一種，其具有一個或多個免疫球蛋白樣折疊結(jié)構(gòu)域并且其在胞間粘著和/或信號傳導(dǎo)中起作用。在許多情況中，igsfcam是跨膜蛋白。igsfcam的非限制性實例包括粘膜地址素細(xì)胞粘附分子1(madcam1)、神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(ncam；例如，ncam-120、ncam-125、ncam-140、ncam-145、ncam-180、ncam-185等)、胞間粘附分子(icam，例如，icam-1、icam-2、icam-3、icam-4和icam-5)、血管細(xì)胞粘附分子-1(vcam-1)、血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(pecam-1)、l1細(xì)胞粘附分子(l1cam)、與l1cam同源的細(xì)胞粘附分子(l1的近同源物)(chl1)、唾液酸結(jié)合ig-樣凝集素(siglec；例如，siglec-1、siglec-2、siglec-3、siglec-4等)、連接素(nectin)(例如，連接素-1、連接素-2、連接素-3等)和連接素樣分子(例如，necl-1、necl-2、necl-3、necl-4和necl-5)。整聯(lián)蛋白是跨膜αβ異源二聚體，并且在人類中已知有至少18個α和8個β亞基，產(chǎn)生24個異源二聚體。α和β亞基具有截然不同的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，來自各亞基的胞外結(jié)構(gòu)域促成異源二聚體的配體-結(jié)合位點。整聯(lián)蛋白的非限制性實例包括α1β1、α2β1、α3β1、α4β1、α5β1、α6β1、α7β1、α8β1、α9β1、α10β1、α11β1、αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、αiibβ3、α4β7、αeβ7、α6β4、αlβ2、αmβ2、αxβ2和αdβ2。在特定實施方案中，抗原是α4β7整聯(lián)蛋白并且生物制品是抗-α4β7整聯(lián)蛋白藥物，如維多珠單抗(vlm)。在某些情況中，結(jié)合抗-α4β7整聯(lián)蛋白藥物的可溶性α4β7整聯(lián)蛋白片段包括α4片段和/或β7片段，α4片段包含與seqidno:1或seqidno:3具有至少80％同一性的氨基酸序列，β7片段包含與seqidno:2或seqidno:4具有至少80％同一性的氨基酸序列。在其他實施方案中，抗原是α4β1整聯(lián)蛋白并且生物制品是抗-α4β1整聯(lián)蛋白藥物，如那他珠單抗(natalizumab)。在某些情況中，結(jié)合抗-α4β1整聯(lián)蛋白藥物的可溶性α4β1整聯(lián)蛋白片段包含α4和β1亞基的胞外結(jié)構(gòu)域的異源二聚體。鈣粘著蛋白是在細(xì)胞粘附中起著重要作用的鈣依賴性跨膜蛋白，形成粘著連接以將組織內(nèi)的細(xì)胞結(jié)合在一起。鈣粘著蛋白的非限制性實例包括e-鈣粘著蛋白、n-鈣粘著蛋白、n-鈣粘著蛋白2和p-鈣粘著蛋白。選擇蛋白是結(jié)合巖藻糖基化的碳水化合物的異嗜性cam(例如，粘蛋白)。三個家族成員是e-選擇蛋白(內(nèi)皮)、l-選擇蛋白(白細(xì)胞)和p-選擇蛋白(血小板)。在其他實施方案中，抗原是細(xì)胞表面分子(例如，細(xì)胞因子受體)的可溶性片段(例如，胞外結(jié)構(gòu)域)。細(xì)胞因子受體的非限制性實例包括i型細(xì)胞因子受體、ii型細(xì)胞因子受體、免疫球蛋白(ig)超家族的成員、腫瘤壞死因子受體、趨化因子受體和tgfβ受體。i型細(xì)胞因子受體的實例包括，但不限于，白介素受體(例如，il-2受體、il-3受體、il-4受體、il-5受體、il-6受體、il-7受體、il-9受體、il-11受體、il-12受體、il-13受體、il-15受體、il-21受體、il-23受體、il-27受體等)、集落刺激因子受體(例如，促紅細(xì)胞生成素受體、gm-sf受體、g-csf受體等)、激素受體或神經(jīng)肽受體(例如，生長激素受體、催乳素受體等)和其他細(xì)胞因子受體，如制瘤素m受體和白血病抑制因子受體。ii型細(xì)胞因子受體的實例包括，但不限于，干擾素受體(例如，干擾素α/β受體、干擾素γ受體等)和白介素受體(例如，il-10受體、il-20受體、il-22受體、il-28受體等)。免疫球蛋白(ig)超家族受體的實例包括，但不限于，il-1受體、csf1、c-kit受體和il-18受體。腫瘤壞死因子受體的實例包括，但不限于，tnf受體(cd120)、淋巴毒素β受體、cd134、cd40、fas、tnfrsf6b、cd27、cd30、cd137、tnfrsf10a、tnfrsf10b、tnfrsf10c、tnfrsf10d、rank、骨保護素、tnfrsf12a、tnfrsf13b、tnfrsf13c、tnfrsf14、神經(jīng)生長因子受體、tnfrsf17、tnfrsf18、tnfrsf19、tnfrsf21、tnfrsf25和外胚層發(fā)育異常蛋白a2受體。趨化因子受體的實例包括，但不限于，cxc趨化因子受體、cc趨化因子受體、c趨化因子受體和cx3c趨化因子受體。tgfβ受體的實例包括，但不限于，tgfβ受體1、tgfβ受體2和tgfβ受體3。在某些實施方案中，抗原是il-6受體并且生物制品是抗-il-6受體藥物，如塔西單抗(tocilizumab)。在某些情況中，結(jié)合抗il-6受體藥物的可溶性il-6受體片段包含il-6受體的胞外結(jié)構(gòu)域。再在其他實施方案中，抗原是分化簇(cd)分子的可溶性片段(例如，胞外結(jié)構(gòu)域)。cd分子的非限制性實例包括cd3、cd4、cd8、cd11a、cd11b、cd14、cd15、cd16、cd19、cd20、cd22、cd24、cd25、cd30、cd31、cd34、cd38、cd45、cd56、cd61、cd91、cd114、cd117、cd182等。在某些情況中，結(jié)合cd分子的可溶性片段的生物制品是選自visilizumab、普立昔單抗(priliximab)、利妥昔單抗(rituximab)、奧法木單抗(ofatumumab)、obinutuzumab、替伊莫單抗(ibritumomabtiuxetan)、托西莫單抗(tositumomab)、ocrelizumab、維妥珠單抗(veltuzumab)、達克珠單抗(daclizumab)的成員及其組合。在一些實施方案中，抗原是細(xì)胞因子或其單體(例如，具有一個或多個半胱氨酸殘基被突變以最小化或消除多聚體形成的可溶性細(xì)胞因子變體)。細(xì)胞因子的非限制性實例包括tnfα、tnf-相關(guān)的凋亡弱誘導(dǎo)劑(tweak)、骨保護素(opg)、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、白介素(例如，il-1α、il-1β、il-1受體拮抗劑(il-1ra)、il-2、il-4、il-5、il-6、可溶性il-6受體(sil-6r)、il-7、il-8、il-9、il-10、il-12、il-13、il-15、il-17、il-23和il-27)、脂肪細(xì)胞因子(例如，瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素、活性或總的纖溶酶原激活物抑制劑-1(pai-1)、內(nèi)臟脂肪素(visfatin)和視黃醇結(jié)合蛋白4(rbp4)等。在特定的實施方案中，細(xì)胞因子是il-12或il-23的p40亞基并且生物制品是抗-il-12p40藥物，如優(yōu)斯它單抗(utk)。在某些情況中，細(xì)胞因子是p40變體，其包含被突變的一個或多個半胱氨酸殘基以最小化或消除多聚體的形成。在一些情況中，p40變體包含與seqidno:6、7、11、12或13具有至少80％同一性的氨基酸序列。在其他實施方案中，細(xì)胞因子是tnfα并且生物制品是抗-tnfα藥物。抗-tnfα藥物的非限制性實例包括(英夫利昔單抗(infliximab))、(阿達木單抗(adalimumab))、(依那西普(etanercept))、(賽妥珠單抗(certolizumabpegol))、(戈利木單抗(golimumab))，及其組合。本文中可溶性抗原可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任一種方法來生產(chǎn)，所述方法如但不限于，合成方法，如固相和液相合成，或重組生物學(xué)方法。在一些實施方案中，樣品是全血、血清或血漿樣品，例如，獲自接受生物制品治療的受試者。在優(yōu)選的實施方案中，樣品是血清。在特定實施方案中，受試者患有疾病或病癥，例如，自身免疫疾病(例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、炎性疾病(例如，炎性腸病(ibd)，如克羅恩病(cd)或潰瘍性結(jié)腸炎(uc))，或癌癥。在特定實施方案中，通過用(例如，兩倍)連續(xù)稀釋的已知量的生物制品孵育抗原和標(biāo)記的生物制品來產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。在某些實施方案中，將游離的標(biāo)記生物制品的曲線下面積(auc)相對于獲自標(biāo)準(zhǔn)曲線的生物制品已知量(例如，已知量的對數(shù))進行作圖，并且通過內(nèi)推(例如，基于游離的標(biāo)記生物制品的峰面積大小)計算樣品中的生物制品的水平。在其他實施方案中，確定游離標(biāo)記生物制品與上樣對照(例如，游離標(biāo)記)的比值，并用于標(biāo)化自標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的樣品中生物制品的水平。在某些實施方案中，大小排阻色譜(sec)是大小排阻-高效液相色譜(se-hplc)。在特定實施方案中，(例如，多個)未標(biāo)記和標(biāo)記的復(fù)合物首先被洗脫通過固定相，之后是游離的標(biāo)記生物制品。sec的基本原理是，不同大小的分子或復(fù)合物將以不同的速率通過固定相洗脫(過濾)。這導(dǎo)致分子或復(fù)合物基于大小的溶液分離。只要所有分子或復(fù)合物同時或接近同時上樣，則相同大小的分子或復(fù)合物將一起洗脫。每個大小排阻柱具有一個可以分離的分子量范圍。排阻限規(guī)定了在該范圍上端的分子量，在該分子量處，分子或復(fù)合物太大以致不會被捕獲在固定相中。透過限規(guī)定在該分離范圍下端的分子量，在該分子量處，足夠小尺寸的分子或復(fù)合物可以完全穿透進入固定相的孔中，并且低于這個分子量的所有分子或復(fù)合物是如此小以致它們作為單個條帶被洗脫。在一些情況中，在恒定的體積或級分中收集洗脫液。分子或復(fù)合物的大小越相似，它們越可能在同一級分中，越不可能被分開檢測。優(yōu)選，通過光譜技術(shù)來檢查收集的級分，以測定洗脫的分子或復(fù)合物的濃度。通常，本發(fā)明中有用的光譜檢測技術(shù)包括，但不限于，熒光計、折射率(ri)和紫外線(uv)。在某些情況中，洗脫體積隨著分子流體力學(xué)體積的對數(shù)而大致線性地降低(即，較重的分子或復(fù)合物首先洗脫出來)?？梢杂酶鞣N可檢測基團中的任一種來標(biāo)記生物制品(例如，治療性抗體)。在某些實施方案中，生物制品用熒光團或熒光染料標(biāo)記。在其它實施方案中，生物制品用發(fā)光標(biāo)簽、金屬、放射性核素等標(biāo)記?？梢灾苯踊蜷g接檢測抗原與標(biāo)記的生物制品的特異性免疫結(jié)合或游離的標(biāo)記生物制品的量?？梢苑治鰜碜灾苯踊蜷g接標(biāo)記的信號，例如，使用分光光度計檢測來自顯色底物的顏色，使用輻射計數(shù)器檢測輻射，如用于檢測125i的γ計數(shù)器，或使用熒光計在特定波長的光存在下檢測熒光。熒光團或熒光染料的非限制性實例包括molecularprobescatalogue(分子探針目錄)中所列的那些，將其按引用并入本文中(參見，r.haugland,thehandbook-aguidetofluorescentprobesandlabelingtechnologies，第10版，molecularprobes,inc.(2005))。這樣的示例性熒光團或熒光染料包括，但不限于，alexa染料，如alexa350、alexa405、alexa430、alexa488、alexa514、alexa532、alexa546、alexa555、alexa568、alexa594、alexa610、alexa633、alexa635、alexa647、alexa660、alexa680、alexa700、alexa750和/或alexa790，以及其他熒光團，包括，但不限于，丹磺酰氯(dns-cl)、5-(碘代乙磺胺)熒光素(5-iaf)、熒光素5-異硫氰酸鹽(fitc)、四甲基若丹明5-(和6-)異硫氰酸鹽(tritc)、6-丙烯酰-2-二甲基氨基萘(acrylodan)、7-硝基苯并-2-氧雜-1,3,-二唑-4-基氯(nbd-cl)、溴化乙錠、螢光黃、鹽酸5-羧基若丹明6g、麗絲胺若丹明b磺酰氯、texasredtm磺酰氯、bodipytm、萘胺磺酸(例如，1-苯胺基萘-8-磺酸(ans)、6-(對甲苯胺基)萘-2-磺酸(tns)等)、anthroyl脂肪酸、dph、十八碳四烯酸、tma-dph、芴基脂肪酸、熒光素-磷脂酰乙醇胺、texasred-磷脂酰乙醇胺、芘基-磷脂酰膽堿、芴基-磷脂酰膽堿、部花青540、1-(3-磺酸丙基)-4-[β-[2[(二-正丁基氨基)-6-萘基]乙烯基]吡啶甜菜堿(naphtylstyryl)、3,3’二丙基硫雜二羰花青(dis-c3-(5))、4-(對二戊基氨基苯乙烯基)-l-甲基吡啶(di-5-asp)、cy-3碘代乙酰胺、cy-5-n-羥基琥珀酰亞胺、cy-7-異硫氰酸鹽、若丹800、ir-125、噻唑橙、天青b、尼羅藍(lán)、鋁酞菁、oxaxine1、4’,6-二脒-2-苯基吲哚(dapi)、hoechst33342、toto、吖啶橙、乙錠同型二聚物、n(乙氧基羰基甲基)-6-甲氧基喹啉鎓(mqae)、fura-2、鈣綠、羧基snarf-6,bapta、香豆素、phytofluors、暈苯、金屬配體復(fù)合物、700dx、700、800rs、800cw、800、cy5、cy5.5、cy7、dy676、dy680、dy682、dy780及其混合物。其他合適的熒光團包括酶-輔因子；鑭系元素、綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、或其突變體和衍生物。通常，熒光基團是選自染料類別的熒光團，包括多甲川染料(polymethines)、酞菁染料(pthalocyanines)、菁染料(cyanines)、呫噸染料(xanthenes)、芴(fluorenes)、若丹明(rhodamines)、香豆素(coumarins)、熒光素和bodipytm。在某些實施方案中，熒光基團是在約650至約900nm范圍發(fā)射的近紅外(nir)熒光團。近紅外熒光技術(shù)的使用在生物試驗中是有利的，因為其基本上消除或降低了來自生物底物自身熒光的背景。近-ir熒光技術(shù)的另一個益處在于，很大程度上減少了來自激發(fā)源的散射光，這是因為散射光強度與波長的四次方成反比。低背景熒光和低散射導(dǎo)致高信噪比，這對于高靈敏檢測是重要的。此外，生物組織中近紅外區(qū)域(650nm至900nm)的光透射窗口使nir熒光成為有價值的用于體內(nèi)成像和亞細(xì)胞檢測應(yīng)用的技術(shù)，這些應(yīng)用要求光透射通過生物組分。在這個實施方案的各個方面，熒光基團優(yōu)選選自700dx、700、800rs、800cw、800、alexa660、alexa680、alexa700、alexa750、alexa790、cy5、cy5.5、cy7、dy676、dy680、dy682和dy780。在某些實施方案中，近紅外基團是800cw、800、700dx、700或dynomicdy676?？梢允褂脽晒鈭F的化學(xué)反應(yīng)性衍生物來完成熒光標(biāo)記。常用的反應(yīng)基團包括胺反應(yīng)性異硫氰酸鹽衍生物，如fitc和tritc(熒光素和若丹明的衍生物)、胺反應(yīng)性琥珀酰亞胺酯(如nhs-熒光素)和巰基反應(yīng)性馬來酰亞胺活化的熒光(如熒光素-5-馬來酰亞胺)，其中許多是商業(yè)上可購得的。這些反應(yīng)性染料中的任何一種與生物制品的反應(yīng)導(dǎo)致熒光團和生物制品之間形成穩(wěn)定的共價鍵。在某些情況中，熒光標(biāo)記反應(yīng)后，常常需要從標(biāo)記的靶分子中除去未反應(yīng)的熒光團。這常常通過大小排阻色譜，利用熒光團和標(biāo)記的蛋白之間的大小差異，來完成。反應(yīng)性熒光染料可以從許多來源獲得?？梢垣@得帶有不同的反應(yīng)基團的染料，所述反應(yīng)基團用于連接靶分子內(nèi)的各種功能性基團。也可以在標(biāo)記試劑盒中獲得這些染料，所述試劑盒含有進行標(biāo)記反應(yīng)的所有成分。在某些情況中，使用來自lifetechnologies(目錄號no.a-10235)的alexa488nhs。iv.間接均相遷移率變動試驗本發(fā)明提供，新的使用大小排阻色譜檢測和測量樣品中生物制品(“藥物”)的存在或水平的間接試驗。本發(fā)明的試驗對于檢測靶向復(fù)雜抗原或大抗原的藥物的存在或水平特別有利，所述抗原包括細(xì)胞表面蛋白、跨膜蛋白、高度糖基化的蛋白和多聚蛋白，以及不能純化的抗原、不純的抗原、和部分或基本上純化的抗原。抗原沒有標(biāo)記，并且因此患者藥物/抗原復(fù)合物不出現(xiàn)在色譜圖中。間接試驗背后的原理在于，患者藥物的量決定了有多少未標(biāo)記抗原可以保持游離以結(jié)合標(biāo)記形式的藥物。通過追蹤游離(未結(jié)合的)標(biāo)記藥物的面積變化，可以確定存在多少患者藥物。在某些方面中，本文中所述的間接試驗的第一步包括，含有治療性藥物(例如，維多珠單抗(vdz))的樣品(例如，血清)用固定量的所述藥物的抗原(例如，可溶性α4β7)孵育。在第二步中，加入固定量的標(biāo)記藥物(例如，與alexa488偶聯(lián)的vdz)。樣品中的治療藥物的量決定了有多少抗原保持游離并且可用于結(jié)合標(biāo)記的藥物。這轉(zhuǎn)而決定了有多少標(biāo)記的藥物是游離的。由于游離的標(biāo)記藥物的峰面積與樣品中的治療藥物的量成比例，因此可以通過從含有已知量藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線進行內(nèi)推來定量治療藥物的量。以下對本發(fā)明間接試驗原理的描述使用維多珠單抗(vdz)作為治療藥物，該描述只是為了舉例說明性的目的(參見圖1)，并且不旨在限制用于檢測或測量患者樣品中其他生物制品的存在或水平的試驗方法的范圍：1.向每個患者樣品(例如，血清)中，加入固定量的抗原(例如，可溶性α4β7)和標(biāo)記的vdz。可以以受控的比例向每個樣品中加入抗原和標(biāo)記vdz的量。例如，加入將結(jié)合高達約75-80％的標(biāo)記vdz的抗原量，可以提供最佳的靈敏度，且不限制試驗的動態(tài)范圍。通過用固定量的標(biāo)記vdz滴定抗原來測定抗原與標(biāo)記vdz的比例，以便當(dāng)將抗原加入標(biāo)記vdz中時，游離的標(biāo)記vdz的峰降低約75-80％(參見，圖2)。2.可以通過追蹤標(biāo)記vdz的峰面積增加(rt＝7.5-8.5min)來進行定量。這個面積與存在的治療藥物的量成比例?？梢詫ris-阻斷的alexa488加入標(biāo)記vdz的儲液中作為上樣對照?？梢栽赼gilentchemstation收集原始色譜圖，并隨后傳輸至程序“r”用于自動化分析?？梢酝ㄟ^將標(biāo)記vdz的峰面積作為已知vdz樣品濃度log的函數(shù)作圖，產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。可以使用10-點標(biāo)準(zhǔn)曲線并用5-參數(shù)logistic(5-pl)模型擬合來說明不對稱性?？梢酝ㄟ^內(nèi)推法從標(biāo)準(zhǔn)曲線測定未知量。在某些實施方案中，加入樣品中的抗原與標(biāo)記藥物的比例是這樣的，在該比例下各試劑的量在所需的下限靈敏度以及動態(tài)范圍(使得能夠測量患者樣品中的藥物而不需要稀釋)之間提供最佳的折衷。作為非限制性實例，加入樣品中的抗原與標(biāo)記藥物的比例為，抗原量結(jié)合約75％至約80％(例如，約75％、76％、77％、78％、79％或80％)的標(biāo)記藥物。在一些情況中，加入樣品中的抗原與標(biāo)記藥物的比例為，抗原量結(jié)合至少約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的標(biāo)記藥物。在其他情況中，加入樣品中的抗原與標(biāo)記藥物的比例為，抗原量結(jié)合約50％至約90％、約60％至約90％、約70％至約90％、約80％至約90％、約50％至約80％、約60％至約80％、約70％至約80％、約50％至約70％、約60％至約70％，或約50％至約60％的標(biāo)記藥物?？梢酝ㄟ^用固定量的標(biāo)記藥物滴定抗原來測定抗原與標(biāo)記藥物的比例，以便當(dāng)將抗原加入標(biāo)記藥物時，游離的標(biāo)記藥物的峰降低所需的百分比(例如，約75-80％)。在某些其他實施方案中，可以通過按比例地提高加入樣品中的抗原和標(biāo)記藥物兩者的量來提高本文中所述的間接試驗的動態(tài)范圍。在一些情況中，抗原和標(biāo)記藥物兩者的量，比抗原和標(biāo)記藥物的參照量，高約1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍或10倍。作為非限制性實例，標(biāo)記vdz的參照量可以為約75ng，而標(biāo)記vdz的提高量可以為約120ng(即，比參照量高1.6倍)。在一些實施方案中，本文中所述的間接試驗的定量下限(lloq)為約0.125μg/ml、0.25μg/ml、0.375μg/ml、0.5μg/ml、0.625μg/ml、0.75μg/ml、0.875μg/ml、1μg/ml、1.25μg/ml、1.5μg/ml、1.75μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml或5μg/ml。在其他實施方案中，本文中所述的間接試驗的定量上限(uloq)為約8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、11μg/ml、12μg/ml、13μg/ml、14μg/ml、15μg/ml、16μg/ml、17μg/ml、18μg/ml、19μg/ml、20μg/ml、21μg/ml、22μg/ml、23μg/ml、24μg/ml、25μg/ml、26μg/ml、27μg/ml、28μg/ml、29μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml或50μg/ml。在特定實施方案中，lloq為約1μg/ml，而uloq為約25μg/ml。v.可溶性α4β7整聯(lián)蛋白多肽抗原在一個方面中，本發(fā)明提供，包含與seqidno:1具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的分離的可溶性α4整聯(lián)蛋白多肽。在一些實施方案中，分離的可溶性α4整聯(lián)蛋白多肽包含人α4整聯(lián)蛋白胞外域的β-螺旋槳重復(fù)(即，重復(fù)1-7)和thigh結(jié)構(gòu)域(參見，圖13；“α4δ620”)，或其片段。在另一個實施方案中，分離的可溶性α4整聯(lián)蛋白多肽包含人α4整聯(lián)蛋白胞外域的β-螺旋槳重復(fù)、thigh結(jié)構(gòu)域和一個或兩個calf結(jié)構(gòu)域(即，calf-1和/或calf-2)，或其片段。再在其他實施方案中，分離的可溶性α4整聯(lián)蛋白多肽是包含完整的人α4整聯(lián)蛋白胞外域的截短受體。本文中描述的分離的可溶性α4整聯(lián)蛋白多肽包括配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其一部分。在一些實施方案中，分離的可溶性α4整聯(lián)蛋白多肽還包括acid肽。該肽可以具有與seqidno:08具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。acid肽可以與base肽形成α-螺旋卷曲螺旋構(gòu)象。在一些實施方案中，acid肽包括可以與base肽上的半胱氨酸殘基形成二硫橋的半胱氨酸殘基。酸性卷曲螺旋區(qū)域肽(acid肽)和堿性卷曲螺旋區(qū)域肽(base肽)描述于例如o’shea等，currbiol,1993,3:658-667,jun等，procnatlacadsciu.s.a.,2001,98(12):6830-6835,takagi等，natstruct.biol.,2001,8:412-416,nishida等，immunity,2006,25:583-594和dong等，biochemistry,2012,51(44):8814-8828。在一些實施方案中，分離的可溶性α4整聯(lián)蛋白多肽包括接頭，如一個或多個氨基酸殘基，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個氨基酸殘基。接頭可以位于胞外域的末端和acid肽之間。在一些實施方案中，分離的可溶性α4整聯(lián)蛋白多肽包含與seqidno:3具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列?？扇苄驭?整聯(lián)蛋白多肽還可以包括親和性標(biāo)簽或表位標(biāo)簽，如組氨酸標(biāo)簽、親和素標(biāo)簽、v5標(biāo)簽、flag標(biāo)簽、ha標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、可斷裂標(biāo)簽等。在一些情況中，可溶性α4整聯(lián)蛋白多肽可以包括熒光標(biāo)簽，如gfp、dsred、cfp、yfp、rfp等，或其他可檢測標(biāo)簽，如辣根過氧化物酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶等。在另一個方面中，本發(fā)明提供分離的可溶性β7整聯(lián)蛋白多肽，其包含與seqidno:2具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，分離的可溶性β7整聯(lián)蛋白多肽包含人β7整聯(lián)蛋白胞外域的psi結(jié)構(gòu)域、i-樣結(jié)構(gòu)域、雜合結(jié)構(gòu)域和i-egf1結(jié)構(gòu)域(參見，圖13；“β7δ527”)，或其片段。在其他實施方案中，分離的可溶性β7整聯(lián)蛋白多肽包含人β7整聯(lián)蛋白胞外域的psi結(jié)構(gòu)域、i-樣結(jié)構(gòu)域和一個或兩個雜合結(jié)構(gòu)域中的一個或多個，或其片段。再在其他實施方案中，分離的可溶性β7整聯(lián)蛋白多肽包含人β7整聯(lián)蛋白胞外域的psi結(jié)構(gòu)域、i-樣結(jié)構(gòu)域、雜合結(jié)構(gòu)域、i-egf結(jié)構(gòu)域(即，結(jié)構(gòu)域1-4)和任選的β-尾，或其片段。在進一步的實施方案中，分離的可溶性β7整聯(lián)蛋白多肽是包含完整人β7整聯(lián)蛋白胞外域的截短受體。本文中描述的可溶性β7整聯(lián)蛋白多肽包括配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其部分。在一些實施方案中，分離的可溶性β7整聯(lián)蛋白多肽還包括base肽。該肽可以具有與seqidno:9具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。base肽可以與acid肽形成α-螺旋卷曲螺旋構(gòu)象。在一些實施方案中，分離的可溶性β7整聯(lián)蛋白多肽包括蛋白酶斷裂位點。在一些情況中，斷裂位點是煙草蝕刻病毒(tev)蛋白酶斷裂位點。tev位點可以包括氨基酸序列exxyxq/s，其中x是任何氨基酸殘基(seqidno:10)。tev位點可以位于base肽上游。在一些實施方案中，分離的可溶性β7整聯(lián)蛋白多肽包括接頭，如一個或多個氨基酸殘基，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個氨基酸殘基。接頭可以位于β7整聯(lián)蛋白胞外域的egf-i結(jié)構(gòu)域末端和斷裂位點之間。在一些實施方案中，分離的可溶性β7整聯(lián)蛋白多肽進一步包含親和標(biāo)簽或表位標(biāo)簽。有用的親和或表位標(biāo)簽包括，但不限于，組氨酸標(biāo)簽、親和素標(biāo)簽、v5標(biāo)簽、flag標(biāo)簽、ha標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、可斷裂標(biāo)簽等。在一些情況中，可溶性β整聯(lián)蛋白多肽可以包括熒光標(biāo)簽，如gfp、dsred、cfp、yfp、rfp等，或其他可檢測標(biāo)簽，如辣根過氧化物酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶等。在一些實施方案中，分離的可溶性β7整聯(lián)蛋白多肽包含與seqidno:4具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。分離的可溶性β7整聯(lián)蛋白多肽可以結(jié)合本文中所述的可溶性α4整聯(lián)蛋白多肽，形成復(fù)合物，如共價連接的異源二聚體。在一些情況中，α4β7整聯(lián)蛋白復(fù)合物可以結(jié)合α4β7配體，如但不限于vcam-1和madcam-1，以及結(jié)合抗α4β7整聯(lián)蛋白的抗體，如，但不限于，維多珠單抗、那他珠單抗和etrolizumab。在一些方面中，本發(fā)明提供分離的可溶性α4β7整聯(lián)蛋白多肽，其包含可溶性α4整聯(lián)蛋白多肽和可溶性β7整聯(lián)蛋白多肽，所述可溶性α4整聯(lián)蛋白多肽包含與seqidno:1具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其中α4整聯(lián)蛋白多肽與結(jié)合對的第一成員連接，所述可溶性β7整聯(lián)蛋白多肽包含與seqidno:2具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其中β7整聯(lián)蛋白多肽與所述結(jié)合對的第二成員連接。在一些實施方案中，結(jié)合對可以是能夠允許α4亞基和β7亞基形成異源二聚體(如共價連接的異源二聚體)的任何肽、分子、基序和化合物。α4β7異源二聚體能夠結(jié)合α4β7配體，如，但不限于，vcam-1和madcam-1，以及結(jié)合抗α4β7整聯(lián)蛋白抗體，如，但不限于，維多珠單抗、那他珠單抗和etrolizumab。可溶性α4整聯(lián)蛋白多肽和可溶性β7整聯(lián)蛋白多肽可以通過半胱氨酸橋或其衍生物異源二聚體化(參見，圖13)。在一些實施方案中，結(jié)合對選自由卷曲-螺旋肽、亮氨酸拉鏈肽、對接鎖定(dock-and-lock)肽、親和素-生物素，及其衍生物。在一些情況中，卷曲-螺旋肽是acid-base肽。本文中描述的多肽可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任一種方法來產(chǎn)生，如但不限于，合成方法，如固相和液相合成，或重組生物方法，如本文中描述的那些。在其他方面中，本發(fā)明提供編碼可溶性α4β7整聯(lián)蛋白多肽的表達載體，其包含第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列包含編碼可溶性α4整聯(lián)蛋白多肽的核酸序列和編碼結(jié)合對的第一成員的核酸序列，其中所述可溶性α4整聯(lián)蛋白多肽具有與seqidno:1具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，所述第二多核苷酸序列包含編碼可溶性β7整聯(lián)蛋白多肽的核酸序列和編碼結(jié)合對的第二成員的核酸序列，其中所述可溶性β7整聯(lián)蛋白多肽具有與seqidno:2具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，結(jié)合對的第一成員是acid肽。在一些實施方案中，結(jié)合對的第一成員是base肽。在一些情況中，第二多核苷酸序列還包含編碼親和標(biāo)簽(如組氨酸標(biāo)簽)的核酸序列。在一些情況中，第二多核苷酸序列還包含編碼蛋白酶斷裂位點(如tev位點)的核酸序列。在一些實施方案中，第一多核苷酸序列包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽具有與seqidno:3具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，第二多核苷酸序列包含編碼多肽的核酸序列，所述多肽具有與seqidno:4具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，表達載體能夠指引多核苷酸序列在特定細(xì)胞類型中優(yōu)先表達。表達載體可以是質(zhì)粒、噬菌體、噬菌粒、粘粒、噬菌體、桿狀病毒載體、慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、酵母質(zhì)粒等。表達載體還可以包含啟動子。有用的啟動子包括組成型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子。表達載體的第一多核苷酸序列和/或第二多核苷酸序列可以可操作地連接啟動子?？梢愿鶕?jù)含有表達載體的宿主細(xì)胞或用于產(chǎn)生或生產(chǎn)由本文中所述的表達載體編碼的可溶性α4β7整聯(lián)蛋白多肽的宿主細(xì)胞，選擇啟動子。表達載體可以包括調(diào)控元件、選擇標(biāo)記盒、抗生素抗性盒，或任何其他有助于宿主細(xì)胞表達多肽的組分。在一些實施方案中，第一和第二多核苷酸序列存在于單個表達載體中。這樣的多核苷酸序列可以位于雙順反子表達載體中，使得ires序列位于載體中第一和第二多核苷酸序列之間。單個啟動子可以驅(qū)動兩個多核苷酸序列的表達。在一些實施方案中，第一多核苷酸序列可操作地連接啟動子并且位于編碼核糖體跳躍(skip)(如病毒2a肽)的核酸序列緊上游，而編碼核糖體跳躍的核酸序列就位于第二多核苷酸序列緊上游。在其他實施方案中，第二多核苷酸序列可操作地連接啟動子并且位于編碼核糖體跳躍的核酸序列緊上游，而編碼核糖體跳躍的核酸序列就位于第一多核苷酸序列緊上游?？扇苄驭?整聯(lián)蛋白多肽和可溶性β7整聯(lián)蛋白多肽可以從一個表達載體產(chǎn)生。用于構(gòu)建表達載體的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。實驗方案和方法的詳細(xì)描述可以見于例如green,m.r.和sambrook,j.編輯，molecularcloning:alaboratorymanual，第4版，coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(2012)，ausubel,f.m.等，currentprotocolsinmolecularbiology(supplement99),johnwiley&sons,newyork(2012)；berger和kimmel,guidetomolecularcloningtechniques,methodsinenzymology:第152卷，academicpress,inc.,sandiego,ca,(1987)；和pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications,academicpress,sandiego,ca,(1990)。在其他方面中，本發(fā)明提供包含任一個編碼本文中所述的可溶性α4β7整聯(lián)蛋白多肽的表達載體的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以是穩(wěn)定的細(xì)胞系，如，但不限于，hek293細(xì)胞、cho細(xì)胞、cos細(xì)胞、jurkat細(xì)胞、nih3t3細(xì)胞及其衍生物。宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、藻類細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、動物細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、非人細(xì)胞、或人細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞描述于goeddel,geneexpressiontechnology:methodsinenzymology,185,academicpress,sandiego,ca,(1990)。可以通過方法，包括但不限于轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、核轉(zhuǎn)染、微注射、電穿孔、生物轟擊、病毒體、脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、聚陽離子或脂質(zhì):多核苷酸綴合物、裸dna、人工病毒粒、和試劑增強的dna吸收，將表達載體引入宿主細(xì)胞中。再在另一個方面中，本發(fā)明提供產(chǎn)生由本文中所述的任一個表達載體編碼的可溶性α4β7整聯(lián)蛋白多肽的方法。所述方法包括(a)將編碼可溶性α4β7整聯(lián)蛋白多肽的表達載體引入宿主細(xì)胞中，(b)在產(chǎn)生可溶性α4β7整聯(lián)蛋白多肽的條件下培養(yǎng)所得到的宿主細(xì)胞，和(c)分離可溶性α4β7整聯(lián)蛋白多肽?？梢栽谠试S、促進或誘導(dǎo)可溶性α4β7整聯(lián)蛋白多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)含有表達載體的細(xì)胞?？扇苄驭?整聯(lián)蛋白多肽、可溶性β7整聯(lián)蛋白多肽和可溶性α4β7整聯(lián)蛋白多肽可以從例如細(xì)胞培養(yǎng)物上清液或細(xì)胞提取物的可溶性級分純化，純化可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進行，包括但不限于，色譜(例如，離子交換、親和、疏水、色譜聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備性等電聚焦)、差異溶解性(例如，硫酸銨沉淀)、sds-page、或提取(參見，例如，proteinpurification,j.c.janson和larsryden編輯，vchpublishers，紐約，(1989))，以獲得基本上純的多肽。用于蛋白純化、色譜、電泳、離心和結(jié)晶的方法描述于例如coligan等，currentprotocolsinproteinscience，第1卷，johnwileyandsons,inc.，紐約，(2000)?？扇苄灾亟Mα4β7整聯(lián)蛋白多肽可以與其關(guān)連配體(cognateligand)復(fù)合，如特異性地結(jié)合野生型、全長α4β7整聯(lián)蛋白的配體?？扇苄灾亟Mα4β7整聯(lián)蛋白多肽可以是針對抗-α4β7整聯(lián)蛋白抗體的抗原。vi.可溶性il-12p40多肽抗原在一個方面中，本發(fā)明提供分離的可溶性il-12p40多肽，其包含與seqidno:6、11、12或13具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，該多肽進一步包含親和標(biāo)簽。在其他實施方案中，分離的可溶性il-12p40多肽包含與seqidno:7具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，該多肽進一步包含親和標(biāo)簽。在特定實施方案中，可溶性il-12p40多肽是單體，并且不能二聚化或形成多聚體。在另一個方面中，本發(fā)明提供包含多核苷酸序列的編碼可溶性il-12p40多肽的表達載體，所述多核苷酸序列包含編碼il-12p40多肽的核酸序列，其中所述多肽具有與seqidno:6、11、12或13具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。該多核苷酸序列可以進一步包含編碼親和標(biāo)簽的核酸序列。這樣的親和標(biāo)簽可以是組氨酸標(biāo)簽，如六組氨酸。親和標(biāo)簽的其他非限制性實例包括親和素標(biāo)簽、v5標(biāo)簽、flag標(biāo)簽、ha標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、可斷裂標(biāo)簽等。在一些實施方案中，多核苷酸包含編碼il-12p40多肽的核酸序列，其中所述多肽具有與seqidno:7具有至少80％序列同一性，例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，表達載體能夠指引多核苷酸序列在特定細(xì)胞類型中優(yōu)先表達。表達載體可以是質(zhì)粒、噬菌體、噬菌粒、粘粒、細(xì)菌噬菌體、桿狀病毒載體、慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、酵母質(zhì)粒等。表達載體還可以包含啟動子。有用的啟動子包括組成型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子。表達載體的多核苷酸序列可以可操作地連接啟動子?？梢愿鶕?jù)選擇來產(chǎn)生或生產(chǎn)由本文中所述的表達載體編碼的可溶性il-12p40多肽的宿主細(xì)胞來選擇啟動子。表達載體可以包括調(diào)控元件、選擇標(biāo)記盒、抗生素抗性盒，或任何其他有助于多肽表達的組分。用于構(gòu)建表達載體的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。實驗方案和方法的詳細(xì)描述參見例如green,m.r.和sambrook,j.編輯，molecularcloning:alaboratorymanual，第4版，coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(2012)，ausubel,f.m.等，currentprotocolsinmolecularbiology(supplement99),johnwiley&sons,newyork(2012)；berger和kimmel,guidetomolecularcloningtechniques,methodsinenzymology:第152卷，academicpress,inc.,sandiego,ca,(1987)；和pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications,academicpress,sandiego,ca,(1990)。在其他方面中，本發(fā)明提供包含編碼本文中所述的可溶性il-12p40多肽的任一個表達載體的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以是穩(wěn)定的細(xì)胞系，如，但不限于，hek293細(xì)胞、cho細(xì)胞、cos細(xì)胞、jurkat細(xì)胞、nih3t3細(xì)胞及其衍生物。宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、藻類細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、動物細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、非人細(xì)胞、或人細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞描述于goeddel,geneexpressiontechnology:methodsinenzymology,185,academicpress,sandiego,ca,(1990)?？梢酝ㄟ^方法，包括但不限于轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、核轉(zhuǎn)染、微注射、電穿孔、生物轟擊、病毒體、脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、聚陽離子或脂質(zhì):多核苷酸綴合物、裸dna、人工病毒粒、和試劑增強的dna吸收，將表達載體引入宿主細(xì)胞中。再在另一個方面中，本發(fā)明提供產(chǎn)生由本文中所述的任一個表達載體編碼的可溶性il-12p40多肽的方法。所述方法包括(a)將編碼可溶性il-12p40多肽的表達載體引入宿主細(xì)胞中，(b)在產(chǎn)生可溶性il-12p40多肽的條件下培養(yǎng)所得到的宿主細(xì)胞，和(c)分離可溶性il-12p40多肽?？梢栽谠试S、促進或誘導(dǎo)可溶性il-12p40多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)含有表達載體的細(xì)胞?？扇苄詉l-12p40多肽可以從例如細(xì)胞培養(yǎng)物上清液或細(xì)胞提取物的可溶性級分純化，其中純化可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進行，包括但不限于，色譜(例如，離子交換、親和、疏水、色譜聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備性等電聚焦)、差異溶解性(例如，硫酸銨沉淀)、sds-page或提取(參見，例如，proteinpurification,j.c.janson和larsryden編輯，vchpublishers，紐約，(1989))，以獲得基本上純的多肽。用于蛋白純化、色譜、電泳、離心和結(jié)晶的方法描述于例如coligan等，currentprotocolsinproteinscience，第1卷，johnwileyandsons,inc.，紐約，(2000)。與野生型il-12p40不同，本文中所述的可溶性重組il-12p40多肽不能形成二聚體、三聚體或寡聚體。在特定實施方案中，野生型il-12p40多肽中兩個半胱氨酸置換為丙氨酸(seqidno:6)或兩個半胱氨酸置換為絲氨酸(seqidno:11)，以防止il-12p40抗原寡聚化。在其他實施方案中，可溶性il-12p40多肽單體具有野生型il-12p40多肽序列，其中一個半胱氨酸置換為丙氨酸和一個半胱氨酸置換為丙氨酸(seqidno:12或13)?？筰l-12p40抗體，如優(yōu)斯它單抗，可以特異性地結(jié)合可溶性重組il-12p40多肽。vii.生物制品治療本發(fā)明的間接均相遷移率變動試驗適用于檢測和/或測量來自受試者(例如，正接受生物制品治療的受試者)的樣品中生物制品的存在或水平。生物制品的非限制性實例包括抗體、抗體片段、蛋白、多肽、融合蛋白(例如，ig融合蛋白或fc融合蛋白)、多價結(jié)合蛋白(例如，dvdig)、抗體-藥物綴合物、疫苗、核酸、糖、其重組形式、其工程化形式，及其組合。基于抗體的生物制品的實例包括，但不限于，診斷或治療性單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段或綴合物。在某些實施方案中，抗體包括抗-整聯(lián)蛋白藥物，如抗-α4β7整聯(lián)蛋白藥物(例如，維多珠單抗(entyviotm)、etrolizumab)和/或抗-α4β1整聯(lián)蛋白藥物(例如，那他珠單抗)。在其他實施方案中，抗體包括抗-細(xì)胞因子藥物，如抗-il12p40藥物(例如，優(yōu)斯它單抗)。再在其他實施方案中，抗體包括抗細(xì)胞因子受體藥物，如抗-il6受體藥物(例如，塔西單抗)。在進一步的實施方案中，抗體包括抗-cd受體藥物，如抗-cd3受體藥物(例如，visilizumab)、抗-cd4受體藥物(例如，普立昔單抗)、抗-cd20受體藥物(例如，利妥昔單抗奧法木單抗obinutuzumab替伊莫單抗托西莫單抗ocrelizumab、維妥珠單抗)、抗-cd25受體藥物(例如，達克珠單抗)，或其組合。在其他實施方案中，抗體包括抗-tnfα藥物，如英夫利昔單抗阿達木單抗依那西普戈利木單抗賽妥珠單抗或其組合?；诳贵w的生物制品的其他實例包括抗體-藥物綴合物，如brentuximabvedotin表1提供了已經(jīng)獲得批準(zhǔn)或目前在研發(fā)中的診斷和治療性單克隆抗體的示例性和非窮舉性列表。在題為“418biotechnologymedicinesintestingpromisetobolsterthearsenalagainstdisease”的2006phrma報告和題為“medicinesindevelopment–biologics”的2013phrma報告中，提供了生物制品藥物的全面列表，包括在臨床研發(fā)和獲批產(chǎn)品中的、基于單克隆抗體的治療劑和診斷劑，在此將上述文獻的公開內(nèi)容全部按引用并入本文中用于所有目的。基于蛋白或基于多肽的生物制品的非限制性實例包括細(xì)胞因子(例如，白介素)、趨化因子、生長激素、血液產(chǎn)生刺激蛋白(例如，紅細(xì)胞生成素)、激素(例如，(促卵泡激素)、生長激素)、酶(例如，(阿法鏈道酶))、凝血因子、胰島素、白蛋白、其片段、其保守性修飾變體、其類似物，及其組合。細(xì)胞因子的實例包括，但不限于，tnfα、凋亡的tnf-相關(guān)弱誘導(dǎo)劑(tweak)、骨保護素(opg)、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、白介素(例如，il-1α、il-1β、il-1受體拮抗劑(il-1ra)、il-2、il-4、il-5、il-6、可溶性il-6受體(sil-6r)、il-7、il-8、il-9、il-10、il-12、il-13、il-15、il-17、il-23和il-27)、脂肪細(xì)胞因子(例如，瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素、活性或總的纖溶酶原激活物抑制劑-1(pai-1)、內(nèi)臟脂肪素和視黃醇結(jié)合蛋白4(rbp4))，及其組合。在特定實施方案中，白介素包括il-2，如(阿地白介素；重組il-2)。趨化因子的實例包括，但不限于，cxcl1/gro1/groα、cxcl2/gro2、cxcl3/gro3、cxcl4/pf-4、cxcl5/ena-78、cxcl6/gcp-2、cxcl7/nap-2、cxcl9/mig、cxcl10/ip-10、cxcl11/i-tac、cxcl12/sdf-1、cxcl13/bca-1、cxcl14/brak、cxcl15、cxcl16、cxcl17/dmc、ccl1、ccl2/mcp-1、ccl3/mip-1α、ccl4/mip-1β、ccl5/rantes、ccl6/c10、ccl7/mcp-3、ccl8/mcp-2、ccl9/ccl10、ccl11/eotaxin、ccl12/mcp-5、ccl13/mcp-4、ccl14/hcc-1、ccl15/mip-5、ccl16/lec、ccl17/tarc、ccl18/mip-4、ccl19/mip-3β、ccl20/mip-3α、ccl21/slc、ccl22/mdc、ccl23/mpif1、ccl24/eotaxin-2、ccl25/teck、ccl26/eotaxin-3、ccl27/ctack、ccl28/mec、cl1、cl2、cx3cl1，及其組合。生長因子的非限制性實例包括表皮生長因子(egf)、肝素結(jié)合表皮生長因子(hb-egf)、血管內(nèi)皮生長因子(vegf)、色素上皮衍生因子(pedf；也稱為serpinf1)、雙調(diào)蛋白(areg；也稱為神經(jīng)鞘瘤衍生的生長因子(sdgf))、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bfgf)、肝細(xì)胞生長因子(hgf)、轉(zhuǎn)化生長因子-α(tgf-α)、轉(zhuǎn)化生長因子β(tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3等)、內(nèi)皮縮血管肽(et-1)、角質(zhì)細(xì)胞生長因子(kgf；也稱為fgf7)、骨形態(tài)生成蛋白(例如，bmp1-bmp15)、血小板衍生的生長因子(pdgf)、神經(jīng)生長因子(ngf)、β-神經(jīng)生長因子(β-ngf)、神經(jīng)營養(yǎng)因子(例如，腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(bdnf)、神經(jīng)營養(yǎng)因子3(nt3)、神經(jīng)營養(yǎng)因子4(nt4)等)、生長分化因子-9(gdf-9)、粒細(xì)胞-集落刺激因子(g-csf)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)、myostatin(gdf-8)、紅細(xì)胞生成素(epo)、促血小板生成素(tpo)，及其組合?；谑荏w構(gòu)建體或基于融合蛋白的生物制品的實例包括，但不限于，連接免疫球蛋白框架的天然受體(例如，(阿巴西普(abatacept)；免疫球蛋白ctla-4融合蛋白)、(alefacept；igg1融合蛋白)、(依那西普；重組人tnf-受體融合蛋白)、結(jié)合兩個不同多肽物質(zhì)的工程化蛋白(例如，(地尼白介素(denileukindiftitox)；包含白介素-2和白喉毒素的工程化蛋白)，及其組合。本發(fā)明因此可以用于檢測和測量來自正接受生物制品治療的受試者的樣品中生物制品的存在或水平的方法中，所述生物制品治療本文和表1中提及的一種或多種疾病或病癥，包括以下的一種或多種：炎癥疾病，如炎性腸炎(ibd)(例如，克羅恩病(cd)和潰瘍性結(jié)腸炎(uc))、葡萄膜炎、結(jié)節(jié)病、韋格納肉芽腫和其他具有炎癥作為中心特征的疾病；自身免疫疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(ra)、多發(fā)性硬化(ms)、全身性紅斑狼瘡(sle)、強直性脊柱炎(bechterew’s病)、狼瘡、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、全身性紅斑狼瘡和乳糜瀉；癌癥，如消化道和胃腸道癌(例如，結(jié)直腸癌、小腸(smallintestine)(小腸(smallbowel)癌)；胃腸間質(zhì)瘤、胃腸類癌瘤、結(jié)腸癌、腎癌、肛門癌、膽道癌、胃(gastric)(胃(stomach))癌；食道癌；盲腸癌；等)；膽囊癌；肝癌；胰腺癌；乳癌；肺癌(例如，非小細(xì)胞肺癌)；前列腺癌；卵巢癌；腎癌(例如，腎細(xì)胞癌)；中樞神經(jīng)系統(tǒng)的癌癥；皮膚癌；絨毛膜癌；頭頸癌；惡性血液病(例如，白血病、淋巴瘤，如b-細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤)；成骨性肉瘤(例如，ewing肉瘤)；軟組織肉瘤(例如，隆凸性皮膚纖維肉瘤(dfsp)、橫紋肌肉瘤)；其他軟組織惡性疾病，和甲狀腺乳頭狀癌；感染性疾病，如艱難梭菌(c.difficile)病、呼吸道合胞病毒(rsv)、hiv、炭疽病、念珠菌病、葡萄球菌感染和丙肝；血液疾病，如膿毒病、膿毒性休克、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿和溶血性尿毒綜合征；心血管疾病，如動脈粥樣硬化、急性心肌梗死、心肺分流術(shù)和心絞痛；代謝病癥，如糖尿病，例如，1型糖尿病和2型糖尿??；遺傳病癥，如陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(pnh)；神經(jīng)學(xué)病癥，如骨關(guān)節(jié)炎疼痛和阿爾茨海默??；呼吸病癥，如哮喘、慢性梗阻性肺病(copd)、鼻息肉和小兒哮喘；皮膚病，如牛皮癬，包括慢性中度至重度斑塊狀牛皮癬；移植排斥，如急性腎移植排斥、心臟和肝移植排斥的逆轉(zhuǎn)、腎移植排斥的預(yù)防、急性腎移植排斥的預(yù)防、和腎移植排斥；和/或其他疾病，如腎臟炎癥、絕經(jīng)期后骨質(zhì)疏松(骨病)、嗜酸細(xì)胞增多綜合征、嗜酸細(xì)胞食管炎和花生過敏。在特定實施方案中，受試者患有炎性疾病(例如，炎性腸病(ibd)，如克羅恩病(cd)或潰瘍性結(jié)腸炎(uc))或自身免疫疾病(例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)。viii.實施例提供以下實施例用于舉例說明目的，不旨在以任何方式來限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地認(rèn)識到各種非關(guān)鍵性參數(shù)，其可以變化或改變來產(chǎn)生實質(zhì)上相同的結(jié)果。實施例1本實施例舉例說明，用于測量炎性腸病(ibd)患者血清中的維多珠單抗(vlm)和抗-vlm抗體(atv)的均相遷移率變動試驗(hmsa)的驗證。維多珠單抗(vlm)，α4β7整聯(lián)蛋白拮抗劑，是最近批準(zhǔn)的治療性單克隆抗體，用于不能充分響應(yīng)常規(guī)治療或tnfα拮抗劑的中度至重度潰瘍性結(jié)腸炎或克羅恩病患者。α4β7整聯(lián)蛋白是腸道特異性異源二聚體糖蛋白，其對于腸內(nèi)白細(xì)胞歸巢至炎癥部位是重要的，所述歸巢經(jīng)由α4β7整聯(lián)蛋白與腸血管內(nèi)皮上表達的粘膜地址素細(xì)胞細(xì)胞粘附分子-1(madcam-1)的相互作用實行。對于在ibd患者中有效使用這種新的治療劑，獲得可以準(zhǔn)確測量vlm藥物水平和抗-vlm抗體的診斷試驗是必需的。繼我們的抗-tnfα治療藥物監(jiān)控試驗之后，我們現(xiàn)在已經(jīng)研發(fā)并驗證了測量患者血清中的vlm和抗-vlm水平的試驗。方法從哺乳動物細(xì)胞(例如，cho細(xì)胞)表達和純化可溶性α4β7蛋白異源二聚體。特別地，在thigh結(jié)構(gòu)域后截短整聯(lián)蛋白α4亞基(α4δ620)，在i-egf1結(jié)構(gòu)域后截短整聯(lián)蛋白β7(β7δ527)(參見，圖13)。將含有一個二硫橋形成cys殘基的酸性/堿性α-螺旋卷曲螺旋肽連接至這些亞基的c-末端，以穩(wěn)定異源二聚體(takagi等，emboj.,18:4607-4615(2003)；o’shea等，curr.biol.,3:658-667(1993))。將六組氨酸標(biāo)簽與堿性肽的c-末端融合，以促進純化。將這種重組的異源二聚體用于基于“競爭”的均相遷移率變動試驗(hmsa)形式中，以測量接受vlm治療的患者血清中的vlm水平。將患者血清與α4β7組合，以允許治療性vlm結(jié)合α4β7。隨后，熒光標(biāo)記的vlm與患者血清中的未標(biāo)記vlm競爭結(jié)合其靶標(biāo)α4β7，接著在hplc大小排阻色譜上分離?！坝坞x的”vlm-alexafluor的量確定了患者血清中的vlm水平。對于該抗-vlm試驗，通過如下形成標(biāo)準(zhǔn)曲線：用熒光標(biāo)記的vlm孵育含有已知量的兔抗-vlm抗體的正常人血清；然后通過sec-hplc分離結(jié)合的和游離的vlm。根據(jù)行業(yè)建議確定方法驗證。結(jié)果vlm的靈敏度為0.35μg/ml。確定了定量的上限和下限(lloq和uloq)分別為0.625μg/ml和14μg/ml。對于抗-vlm，lloq和uloq分別為3.13u/ml和150u/ml。針對每個試驗產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示出了高重復(fù)性和靈敏性。試驗間和試驗內(nèi)的精確度顯示出低于10％cv且準(zhǔn)確度在20％內(nèi)。不存在來自脂血(lipemic)、溶血或類風(fēng)濕因子(rf)血清的明顯干擾。參見，圖4-10。結(jié)論已經(jīng)研發(fā)并驗證了靈敏且特異性的試驗來測量正接受ibd治療的患者中的vlm和抗-vlm水平。由于大異源二聚體的、高度糖基化的、膜結(jié)合的抗原作為藥物靶標(biāo)的復(fù)雜性，所述試驗形式需要獨特的方法。藥物試驗和抗藥物試驗都顯示出高準(zhǔn)確性和精確性，并具有高靈敏度，對已知的干擾因素具有高容忍性。所述試驗對于個體患者的臨床監(jiān)控和藥物優(yōu)化是有用的。實施例2本實施例舉例說明均相遷移率變動試驗(hmsa)的驗證，該試驗用于測量炎性腸病(ibd)患者血清中的優(yōu)斯它單抗(utk)和抗優(yōu)斯它單抗抗體(atu)。優(yōu)斯它單抗是在不能響應(yīng)常規(guī)治療或tnfα拮抗劑的ibd患者的治療中具有潛在實用性的治療性單克隆抗體。優(yōu)斯它單抗是對白介素12和白介素23(經(jīng)由其共有的p40亞基)具有特異性的單克隆抗體，并且通過這些途徑阻斷炎癥。我們在此描述了對用于測量utk以及抗優(yōu)斯它單抗抗體的基于hplc的高遷移率變動試驗的分析驗證。方法從哺乳動物細(xì)胞表達和純化重組的可溶性il12p40亞基(例如，seqidno:7)。該試驗利用了熒光標(biāo)記的utk與患者血清中未標(biāo)記的utk對il12p40的競爭結(jié)合。用重組il12p40孵育患者血清后，添加utk-alexafluor488，之后在hplc大小排阻柱上運行樣品，從而將“游離”utk-alexafluor488與結(jié)合il12p40的utk-alexafluor488分開?！坝坞x”utk-alexafluor488的量是患者血清中治療性utk量的量度。將“游離”utk-alexafluor488的曲線下面積(auc)相對于已知標(biāo)準(zhǔn)樣品中的utk濃度的對數(shù)作圖，通過內(nèi)推法計算患者血清中的utk濃度。對于atu試驗，通過如下形成標(biāo)準(zhǔn)曲線：用熒光標(biāo)記的utk孵育含有已知量的兔atu的正常人血清；然后通過sec-hplc分離結(jié)合的和游離的glm。根據(jù)行業(yè)建議確認(rèn)方法驗證。結(jié)果utk的靈敏度為0.15μg/ml。確定定量的上限(uloq)為8μg/ml，而確定定量的下限(lloq)為0.625μg/ml。對于atu，lloq和uloq分別為3.13u/ml和150u/ml。針對每個試驗產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示出高的可重復(fù)性和靈敏度。試驗間和試驗內(nèi)精確性顯示了低于10％cv，并且準(zhǔn)確性在20％內(nèi)。不存在來自脂血(lipemic)、溶血或類風(fēng)濕因子(rf)血清的明顯干擾。參見，圖11-12。結(jié)論本研究描述了對新的基于“競爭”的試驗的驗證，所述試驗用于測量正接受ibd治療的患者中優(yōu)斯它單抗的水平。由于抗原在血清中形成同源二聚體和異源二聚體的趨勢，造成難以使用常規(guī)hmsa測定，因此考慮到操作該抗原的復(fù)雜性，該試驗形式需要獨特的方法進行?；诟偁幍膆msa試驗顯示出高準(zhǔn)確性和精確性，并具有高靈敏度。此外，所述試驗對已知干擾因素具有高容忍性。這些試驗對于個體患者的臨床監(jiān)控和藥物優(yōu)化是有用的。實施例3本實施例描述了本發(fā)明的示例性維多珠單抗(vlm)競爭試驗方法。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識到本實施例中描述的試驗方法適用于在如下情形中確定樣品中優(yōu)斯它單抗(utk)以及其他生物制品的存在或水平，在所述情形下，操作與生物制品結(jié)合的抗原(例如，抗原是膜結(jié)合的蛋白、糖基化蛋白、多聚蛋白、不溶性蛋白、難以表達或純化的蛋白，和/或大蛋白)的復(fù)雜性使得必須使用抗原的可溶形式(例如，可溶性片段、變體或單體)。將摻入了已知量的維多珠單抗(vlm)的正常人血清(nhs)連續(xù)稀釋。從80μg/mlvlm開始在nhs中兩倍連續(xù)稀釋來制備10-點曲線(即，80μg/ml至0.15625μg/ml)。將摻入了12、4和1μg/mlvlm的nhs用作陽性對照。將標(biāo)準(zhǔn)血清樣品、陽性對照和患者樣品加入96孔平板中。加入未稀釋的或在nhs中4×或8×稀釋的患者樣品，以增加試驗的動態(tài)范圍。加入可溶性α4β7抗原和試驗稀釋劑。將平板置于搖床上并且允許在室溫孵育1小時。1小時后，加入標(biāo)記的vlm(例如，vlm-alexa488)。將平板再次置于搖床上，孵育1小時。使用0.2μm過濾板將樣品過濾。將樣品上樣于hplc自動取樣機上并按序通過大小排阻色譜柱(例如，phenomenexbiosep-sec-s3000柱)運行，其將分離游離的標(biāo)記的vlm(例如，vlm-alexa488)與結(jié)合可溶性α4β7整聯(lián)蛋白的標(biāo)記的vlm。以r編程語言書寫的軟件用于鑒別代表游離的標(biāo)記的vlm(例如，vlm-alexa488)的峰并確定峰面積。當(dāng)患者血清中存在vlm時，這個峰的面積會變大。通過將該峰的大小與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，可以內(nèi)推患者的vlm水平。使用prism(例如，graphpadprism6)，通過將游離的標(biāo)記vlm(例如，vlm-alexa488)的面積作為血清vlm水平的函數(shù)繪圖，產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過將該峰的大小與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，可以內(nèi)推患者的vlm藥物濃度。本實施例中描述的試驗的前提是，來自正接受vlm治療的患者的樣品中的vlm和加入樣品反應(yīng)物中的標(biāo)記的vlm之間對可溶性α4β7抗原存在結(jié)合競爭。標(biāo)記的和未標(biāo)記的vlm的相對比例確定了有多少α4β7抗原分別與之結(jié)合，并確定了游離的標(biāo)記vlm(例如，vlm-alexa488)的峰面積。患者樣品中存在越多藥物，將有越多的標(biāo)記vlm保持游離而非結(jié)合于α4β7抗原。實施例4本實施例舉例說明對用于測量炎性腸病(ibd)患者血清中的維多珠單抗(vlm)和抗-vlm抗體的均相遷移率變動試驗(hmsa)的驗證。背景和目的維多珠單抗，α4β7整聯(lián)蛋白拮抗劑，是最近批準(zhǔn)的治療性單克隆抗體，用于不能充分響應(yīng)常規(guī)治療或tnfα拮抗劑的中度至重度潰瘍性結(jié)腸炎或克羅恩病患者。可獲得準(zhǔn)確測量血清vlm和抗-vlm(atv)水平的診斷試驗，對于在ibd患者中有效使用這種新的治療劑是必需的。我們在此分析驗證了研發(fā)用于測量患者血清中vdm和atv水平的hmsa及其臨床實用性。方法在哺乳動物細(xì)胞中表達和純化可溶性α4β7異源二聚體(例如，α4δ620/β7δ527異源二聚體；參見，圖13)。將該重組異源二聚體用于基于“競爭”的hmsa形式中，用于測量正接受vlm治療的患者中的血清vlm水平。將患者血清與α4β7混合，以允許治療性vlm結(jié)合α4β7。隨后，熒光標(biāo)記的vlm與患者血清中未標(biāo)記的vlm競爭結(jié)合其靶標(biāo)α4β7，接著在hplc大小排阻色譜上分離(參見，圖1)。對于抗vlm試驗，通過如下方式形成標(biāo)準(zhǔn)曲線：用熒光標(biāo)記的vlm孵育含有已知量的兔抗vlm抗體的正常人血清，；然后通過sec-hplc分離結(jié)合的和游離的vlm。根據(jù)行業(yè)推薦進行了驗證(shankar，g.等，2008)。結(jié)果vlm和atv試驗顯示出高的試驗內(nèi)精確性和準(zhǔn)確性。試驗內(nèi)精確性低于10％，試驗內(nèi)準(zhǔn)確性低于15％誤差。運行與運行之間、儀器與儀器之間，以及分析物與分析物之間的變異性在幾乎所有情況中低于15％cv和低于20％誤差(表2)。針對vlm的靈敏度為0.348μg/ml，具有0.625-14μg/ml的動態(tài)范圍(表3)。atv試驗的檢出限為<1.56u/ml。不能確定精確值，因為該值太低以致不能插入我們的曲線中。atv的動態(tài)范圍在未稀釋的血清中為3.13-150u/ml(表3)。摻入了vlm或atv的正常人血清顯示出跨連續(xù)稀釋的良好線性和回收率(recovery)(圖14)。atv顯示出在20μg/mlvlm水平下的高耐藥性(表4)。測試了患者血清中的常見干擾因素，在ibd患者中看到的水平下沒有干擾(圖15)。表2.針對試驗的準(zhǔn)確性和精確性的驗證數(shù)據(jù)vlm-hmsa的準(zhǔn)確性和精確性atv-hmsa的準(zhǔn)確性和精確性表3.每個試驗的定量限表4.抗-vlm試驗中的藥物干擾vedo[μg/ml]總atv[u/ml]2051.6049.22026.4024.82013014結(jié)論已經(jīng)研發(fā)并驗證了一種靈敏且特異性的試驗來測量正接受ibd治療的患者中的vlm和抗-vlm水平。由于大異源二聚體的、高度糖基化的膜蛋白作為藥物靶標(biāo)的復(fù)雜性，這種試驗形式需要一種獨特的方法。藥物試驗和抗藥物試驗都顯示了高準(zhǔn)確性和精確性、以及對已知干擾因素的容忍性。vlm和抗-vlm試驗的研發(fā)對于個體患者中的臨床監(jiān)控和藥物優(yōu)化是有用的。實施例5本實施例舉例說明對用于測量炎性腸病(ibd)患者血清中的優(yōu)斯它單抗(utk)和抗優(yōu)斯它單抗抗體(atu)的均相遷移率變動試驗(hmsa)的驗證。背景和目的優(yōu)斯它單抗是在不能響應(yīng)常規(guī)治療或tnfα拮抗劑的ibd患者的治療中具有潛在實用性的治療性單克隆抗體。優(yōu)斯它單抗對il-12和il-23(經(jīng)由其共有的p40亞基)具有特異性，并且通過這些途徑阻斷炎癥?？色@得準(zhǔn)確測量血清ust和抗-ust(atu)水平的診斷試驗，對于在ibd患者中有效利用這種新的治療劑是必需的。在此，我們分析驗證了研發(fā)用于測量utk水平的基于“競爭”的hmsa以及用于測量患者血清中的atu水平的常規(guī)hmsa。方法從哺乳動物細(xì)胞表達和純化重組的、可溶性的il12p40(例如，seqidno:7)。將重組il12p40用于基于“競爭”的hmsa形式中，以測量接受utk治療的患者中的血清utk水平。將患者血清與ril12p40混合以允許治療性utk結(jié)合ril12p40。隨后，熒光標(biāo)記的utk與患者血清中未標(biāo)記的utk競爭結(jié)合其靶標(biāo)，ril12p40，接著在hplc大小排阻色譜上分離(參見，圖16)。對于抗utk試驗，通過如下形成標(biāo)準(zhǔn)曲線：用熒光標(biāo)記的utk孵育含有已知量的兔抗-utk抗體的正常人血清；然后通過sec-hplc分離結(jié)合的和游離的utk。結(jié)果utk和atu試驗顯示出高的試驗內(nèi)精確性和準(zhǔn)確性。試驗內(nèi)精確性低于10％，試驗內(nèi)準(zhǔn)確性低于15％誤差。運行與運行之間、儀器與儀器之間，以及分析物與分析物之間的變異性低于15％cv和低于20％誤差(表5)。針對utk的靈敏度為0.224μg/ml，具有0.625-10μg/ml的動態(tài)范圍(表6)。atu試驗的檢出限為<1.56u/ml。不能確定精確值，因為該值太低以致不能從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)推得出。atv的動態(tài)范圍在未稀釋的血清中為3.13-150u/ml(表6)。摻入了utk或atu的正常人血清顯示出在試驗動態(tài)范圍內(nèi)跨連續(xù)稀釋的良好線性和回收率(圖17)。atu顯示出高耐藥性。20μg/ml的utk水平不顯著干擾atu檢測(表7)。測試了患者血清中常見的干擾因素，并且在ibd患者中看到的水平下沒有干擾。只有高度溶血的血清可能潛在干擾，但在患者血清中正?？梢姷乃较聸]有干擾(圖18)。表5.試驗的精確性和準(zhǔn)確性的驗證數(shù)據(jù)utk-hmsa的準(zhǔn)確性和精確性atu-hmsa的準(zhǔn)確性和精確性表6.每個試驗的定量限定量限表7.抗-utk試驗中的藥物干擾utk[μg/ml]總atu[u/ml]2058.8051.72016.7022.1205.609.2結(jié)論用于utk和atu的hmsa顯示出在寬動態(tài)范圍內(nèi)的高準(zhǔn)確性和精確性。hmsa平臺允許檢測utk和atu，即使在已知限制elisa/eclia方法應(yīng)用的干擾因素存在下也可以。新的基于“競爭”的hmsa平臺的研發(fā)允許在常規(guī)hmsa不可行時測量治療性藥物的水平。實施例6本實施例舉例說明，通過實施實驗以提高用于維多珠單抗(vdz)測量的均相遷移率變動試驗(hmsa)的動態(tài)范圍。在改善試驗的動態(tài)范圍的努力中，通過將試驗中使用的vdz-alexa488的量提高1.6倍來改進試驗。提高標(biāo)記的vdz的量并成比例地提高α4β7抗原(例如，α4δ620/β7δ527異源二聚體；參見，圖13)的量，改善了試驗的動態(tài)范圍。此外，改變α4β7相對于標(biāo)記vdz的量影響了定量的下限。相對于標(biāo)記vdz的過量抗原使得試驗相對地對患者血清中的藥物不敏感并且升高了定量的下限。相反，相對于標(biāo)記vdz太少的抗原具有降低定量上限的作用。將標(biāo)記vdz的量從75ng/孔提高至120ng/孔(1.6倍)并滴定抗原以使存在的抗原結(jié)合75-80％標(biāo)記的vdz，可以在所需的下限靈敏度以及改善的動態(tài)范圍(使得能夠在大多數(shù)情況下不需要稀釋即可以測量患者血清中的藥物)之間提供最佳的平衡。此外，將數(shù)據(jù)作圖，可以將vdz-alexa488的峰面積(沒有除以封閉的alexa488對照峰面積)相對于vdz濃度的對數(shù)作圖。i.試驗限空白限(limitofblank)從標(biāo)準(zhǔn)曲線空白的30個重復(fù)測定了空白限(lob)。所有試驗中的標(biāo)準(zhǔn)曲線空白(陰性對照)由在每100μl注射中4％正常人血清+40ngvdz-alexa488+165ngα4β7組成。計算了vdz-alexa488峰面積的平均值(mean)+1.645sd并隨后用于lod的計算。表8.試驗的空白限(lob)n30平均值(vdz-alexa488峰面積)1.91sd(vdz-alexa488峰面積)0.09平均值(mean)+1.645sd2.06內(nèi)推得出的lob0.156/ml**平均值(mean)+1.645sd剛好低于曲線的最低點并且因此取曲線上的最低點用于lob。檢出限通過利用測量的lob和血清重復(fù)(含有接近lob的低濃度的vdz)，測定了檢出限(lod)。選擇標(biāo)準(zhǔn)10，因為這是曲線上的最低點并且最接近lob。使用等式：lod＝lob+1.645(sd低濃度樣品)計算了lod(armbruster等，2008)。然后從用于該計算的實驗的平均標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)推得出該值，產(chǎn)生以μg/ml計的濃度。表9.試驗的檢出限n30平均(vdz-alexa488峰面積)1.91sd(vdz-alexa488峰面積)0.0611.645*sd0.100內(nèi)推的(1.645*sd)太低以致不能內(nèi)推lod＝平均值(mean)+3*sd0.457μg/ml定量限通過分析低濃度vdz陽性樣品的30個重復(fù)的內(nèi)推濃度，確定了定量下限(lloq)。在這種情況中，選擇了標(biāo)準(zhǔn)8(0.625μg/ml的有效血清濃度)。通過分析高濃度vdz陽性樣品(有效血清濃度等于14μg/ml)的30個重復(fù)，確定了定量上限(uloq)。將lloq規(guī)定為導(dǎo)致cv≤20％，誤差≤25％的濃度，并且由此測量低分析物濃度下試驗的精確性和準(zhǔn)確性。還通過cv≤20％，誤差≤25％定量了uloq。表10.lloq和uloqlloquloqn3030預(yù)期的(μg/ml)125平均值(μg/ml)1.0520.95sd(μg/ml)0.121.44cv(％)11.396.86誤差(％)5.13-16.19這些標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)致了用于試驗限的以下值：表11.試驗定量限lod0.457μg/mllloq1μg/mluloq25μg/ml2.干擾抗維多珠單抗抗體(atv)的干擾在本實驗中，將2.5、5、10和20μg/mlvdz加入正常的人血清或各種濃度的兔atv陽性血清中。然后使用試驗分析了這些樣品并計算％回收率。表12.atv干擾在此實驗中，對atv的試驗容忍性高達6.25u/ml。atv干擾是預(yù)期的，因為中和性atv將與α4β7競爭結(jié)合患者vdz。預(yù)期只有結(jié)合非中和性atv的vdz得到檢測。整聯(lián)蛋白α4β7底物干擾為了檢查α4β7的干擾，在1至1000ng/ml范圍中進行了滴定。vdz濃度作圖在x-軸的截距上，對應(yīng)于每種干擾因素的零濃度(圖19)。表13.α4β7干擾(100ng/ml)從遠(yuǎn)超過預(yù)期在vdz治療的患者血清中看到的水平的α4β7水平，沒有明顯干擾。3.抗原穩(wěn)定性通過在4度(4℃)下儲存一周來評價α4β7抗原的穩(wěn)定性。1周后，從4℃儲存中取出α4β7并相對在-70℃儲存的新鮮等份試樣進行分析。然后將來自4℃儲存樣品的數(shù)據(jù)與儲存前獲得的進行比較，并計算百分比誤差。如果誤差在25％內(nèi)，則認(rèn)為等份試樣在4℃是穩(wěn)定的。表14.加速的穩(wěn)定性α4β7的加速穩(wěn)定性。將儲存在-70℃的抗原用于該試驗中，以檢查vdz陽性對照。對照出自規(guī)格范圍內(nèi)(誤差≤25％和cv≤25％)。將儲存在4℃的抗原用于試驗中，以檢查vdz陽性對照。這些對照也出自規(guī)格范圍內(nèi)。此外，作為儲存在4℃vs.-70℃的結(jié)果，沒有明顯的抗原效力損失。4.其他動態(tài)范圍實驗使用1×量標(biāo)記的vdz(例如，75ng/孔vdz-alexa488)，以及2×和4×量，產(chǎn)生了三個標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖20顯示，成比例地提高試驗中使用的vdz-alexa488和整聯(lián)蛋白α4β7的濃度可以增加試驗的動態(tài)范圍。還可以提高對抗藥物抗體的容忍性。1μg/ml的最大lloq是針對該試驗的標(biāo)準(zhǔn)。特別地，將標(biāo)記的vdz和α4β7的量提高1.6倍能夠?qū)崿F(xiàn)1μg/ml的最大lloq，同時提供25μg/ml的提高的頂端范圍(參見，表11)。盡管為了理解清楚的目的，通過說明書和實施例，較為詳細(xì)地描述了之前的發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到可以在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)實施某些改變和變化。此外，本文中提供的每篇參考文獻全部按引用并入，就如同每篇參考文獻單獨按引用并入一樣。序列表seqidno：1人α4整聯(lián)蛋白片段mawearrepgprraavretvmlllclgvptgrpynvdtesallyqgphntlfgysvvlhshganrwllvgaptanwlanasvinpgaiyrcrigknpgqtceqlqlgspngepcgktcleerdnqwlgvtlsrqpgengsivtcghrwknifyiknenklptggcygvppdlrtelskriapcyqdyvkkfgenfascqagissfytkdlivmgapgssywtgslfvynittnkykafldkqnqvkfgsylgysvgaghfrsqhttevvggapqheqigkayifsidekelnilhemkgkklgsyfgasvcavdlnadgfsdllvgapmqstireegrvfvyinsgsgavmnametnlvgsdkyaarfgesivnlgdidndgfedvaigapqeddlqgaiyiyngradgisstfsqrieglqiskslsmfgqsisgqidadnngyvdvavgafrsdsavllrtrpvvivdaslshpesvnrtkfdcvengwpsvcidltlcfsykgkevpgyivlfynmsldvnrkaespprfyfssngtsdvitgsiqvssreancrthqafmrkdvrdiltpiqieaayhlgphviskrsteefpplqpilqqkkekdimkktinfarseqidno：2人β7整聯(lián)蛋白片段mvalpmvlvlllvlsrgeseldakipstgdatewrnphlsmlgscqpapscqkcilshpscawckqlnftasgeaearrcarreellargcpleeleeprgqqevlqdqplsqgargegatqlapqrvrvtlrpgepqqlqvrflraegypvdlyylmdlsysmkddlervrqlghallvrlqevthsvrigfgsfvdktvlpfvstvpsklrhpcptrlercqspfsfhhvlsltgdaqaferevgrqsvsgnldspeggfdailqaalcqeqigwrnvsrllvftsddtfhtagdgklggifmpsdghchldsnglysrstefdypsvgqvaqalsaaniqpifavtsaalpvyqelsklipksavgelsedssnvvqlimdaynslsstvtlehsslppgvhisyesqcegpekregkaedrgqcnhvrinqtvtfwvslqathclpephllrlralgfseelivelhtlcdcncsdtqpqaphcsdgqghlqcgvcscapgrlgrlcecsvaelsspdlesgcseqidno：3帶有酸性肽的人α4整聯(lián)蛋白片段mawearrepgprraavretvmlllclgvptgrpynvdtesallyqgphntlfgysvvlhshganrwllvgaptanwlanasvinpgaiyrcrigknpgqtceqlqlgspngepcgktcleerdnqwlgvtlsrqpgengsivtcghrwknifyiknenklptggcygvppdlrtelskriapcyqdyvkkfgenfascqagissfytkdlivmgapgssywtgslfvynittnkykafldkqnqvkfgsylgysvgaghfrsqhttevvggapqheqigkayifsidekelnilhemkgkklgsyfgasvcavdlnadgfsdllvgapmqstireegrvfvyinsgsgavmnametnlvgsdkyaarfgesivnlgdidndgfedvaigapqeddlqgaiyiyngradgisstfsqrieglqiskslsmfgqsisgqidadnngyvdvavgafrsdsavllrtrpvvivdaslshpesvnrtkfdcvengwpsvcidltlcfsykgkevpgyivlfynmsldvnrkaespprfyfssngtsdvitgsiqvssreancrthqafmrkdvrdiltpiqieaayhlgphviskrsteefpplqpilqqkkekdimkktinfartgglaqcekelqalekenaqlewelqalekelaqseqidno：4人β7整聯(lián)蛋白片段，帶有肽velcro的base-p1序列(在七肽重復(fù)肽的“d”位置含有cys)、帶有tev斷裂位點和his6標(biāo)簽mvalpmvlvlllvlsrgeseldakipstgdatewrnphlsmlgscqpapscqkcilshpscawckqlnftasgeaearrcarreellargcpleeleeprgqqevlqdqplsqgargegatqlapqrvrvtlrpgepqqlqvrflraegypvdlyylmdlsysmkddlervrqlghallvrlqevthsvrigfgsfvdktvlpfvstvpsklrhpcptrlercqspfsfhhvlsltgdaqaferevgrqsvsgnldspeggfdailqaalcqeqigwrnvsrllvftsddtfhtagdgklggifmpsdghchldsnglysrstefdypsvgqvaqalsaaniqpifavtsaalpvyqelsklipksavgelsedssnvvqlimdaynslsstvtlehsslppgvhisyesqcegpekregkaedrgqcnhvrinqtvtfwvslqathclpephllrlralgfseelivelhtlcdcncsdtqpqaphcsdgqghlqcgvcscapgrlgrlcecsvaelsspdlesgcgglengyfqggknaqckkklqalkkknaqlkwklqalkkklaqgghhhhhhseqidno：5人il-12p40野生型mchqqlviswfslvflasplvaiwelkkdvyvveldwypdapgemvvltcdtpeedgitwtldqssevlgsgktltiqvkefgdagqytchkggevlshsllllhkkedgiwstdilkdqkepknktflrceaknysgrftcwwlttistdltfsvkssrgssdpqgvtcgaatlsaervrgdnkeyeysvecqedsacpaaeeslpievmvdavhklkyenytssffirdiikpdppknlqlkplknsrqvevsweypdtwstphsyfsltfcvqvqgkskrekkdrvftdktsatvicrknasisvraqdryyssswsewasvpcseqidno：6人il-12p40變體(c199a，c274a)mchqqlviswfslvflasplvaiwelkkdvyvveldwypdapgemvvltcdtpeedgitwtldqssevlgsgktltiqvkefgdagqytchkggevlshsllllhkkedgiwstdilkdqkepknktflrceaknysgrftcwwlttistdltfsvkssrgssdpqgvtcgaatlsaervrgdnkeyeysvecqedsaapaaeeslpievmvdavhklkyenytssffirdiikpdppknlqlkplknsrqvevsweypdtwstphsyfsltfavqvqgkskrekkdrvftdktsatvicrknasisvraqdryyssswsewasvpcseqidno：7具有六組氨酸標(biāo)簽的人il-12p40變體(c199a，c274a)mchqqlviswfslvflasplvaiwelkkdvyvveldwypdapgemvvltcdtpeedgitwtldqssevlgsgktltiqvkefgdagqytchkggevlshsllllhkkedgiwstdilkdqkepknktflrceaknysgrftcwwlttistdltfsvkssrgssdpqgvtcgaatlsaervrgdnkeyeysvecqedsaapaaeeslpievmvdavhklkyenytssffirdiikpdppknlqlkplknsrqvevsweypdtwstphsyfsltfavqvqgkskrekkdrvftdktsatvicrknasisvraqdryyssswsewasvpchhhhhhseqidno：8具有半胱氨酸殘基(3)的acid肽aqcekelqalekenaqlewelqalekelaqseqidno：9具有半胱氨酸殘基的(16)、tev斷裂位點(3-9)和六組氨酸標(biāo)簽(46-51)的base肽gglengyfqggknaqckkklqalkkknaqlkwklqalkkklaqgghhhhhhseqidno：10tev斷裂位點exxyxq/sx是任何氨基酸殘基seqidno：11人il-12p40變體(c199s，c274s)mchqqlviswfslvflasplvaiwelkkdvyvveldwypdapgemvvltcdtpeedgitwtldqssevlgsgktltiqvkefgdagqytchkggevlshsllllhkkedgiwstdilkdqkepknktflrceaknysgrftcwwlttistdltfsvkssrgssdpqgvtcgaatlsaervrgdnkeyeysvecqedsaspaaeeslpievmvdavhklkyenytssffirdiikpdppknlqlkplknsrqvevsweypdtwstphsyfsltfsvqvqgkskrekkdrvftdktsatvicrknasisvraqdryyssswsewasvpcseqidno：12人il-12p40變體(c199a，c274s)mchqqlviswfslvflasplvaiwelkkdvyvveldwypdapgemvvltcdtpeedgitwtldqssevlgsgktltiqvkefgdagqytchkggevlshsllllhkkedgiwstdilkdqkepknktflrceaknysgrftcwwlttistdltfsvkssrgssdpqgvtcgaatlsaervrgdnkeyeysvecqedsaapaaeeslpievmvdavhklkyenytssffirdiikpdppknlqlkplknsrqvevsweypdtwstphsyfsltfsvqvqgkskrekkdrvftdktsatvicrknasisvraqdryyssswsewasvpcseqidno：13人il-12p40變體(c199s，c274a)mchqqlviswfslvflasplvaiwelkkdvyvveldwypdapgemvvltcdtpeedgitwtldqssevlgsgktltiqvkefgdagqytchkggevlshsllllhkkedgiwstdilkdqkepknktflrceaknysgrftcwwlttistdltfsvkssrgssdpqgvtcgaatlsaervrgdnkeyeysvecqedsaspaaeeslpievmvdavhklkyenytssffirdiikpdppknlqlkplknsrqvevsweypdtwstphsyfsltfavqvqgkskrekkdrvftdktsatvicrknasisvraqdryyssswsewasvpc。當(dāng)前第1頁12