本發(fā)明涉及鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的經(jīng)間歇滅菌的(tyndallized)完整的免疫活性細(xì)菌細(xì)胞；其制造方法，以及用于定性和定量確定鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的經(jīng)間歇滅菌的完整的免疫活性細(xì)菌細(xì)胞的分析方法。

制造經(jīng)間歇滅菌的孢子或細(xì)菌的技術(shù)是眾所周知的。間歇滅菌是一種分級滅菌方法，其中以間歇模式實施加熱至80-100℃的溫度30分鐘。第一次熱處理殺死營養(yǎng)體型(vegetativeform)，之后是24小時的溫育期，促進(jìn)孢子萌發(fā)。將如此處理的材料恢復(fù)至80-100℃的溫度30分鐘，以殺死由孢子萌發(fā)產(chǎn)生的營養(yǎng)細(xì)胞(vegetativecell)。這些程序應(yīng)重復(fù)次。間歇滅菌用于不耐受高溫的物質(zhì)，例如孢子或乳酸菌。

經(jīng)間歇滅菌的細(xì)菌細(xì)胞是具有失活的復(fù)制能力和失活的酶能力的那些細(xì)菌細(xì)胞。然而，經(jīng)間歇滅菌的細(xì)胞維持了其未修飾的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壁。因此，從其活性的角度來看，經(jīng)間歇滅菌的細(xì)菌細(xì)胞可以被定義為生理上完整的細(xì)胞，由此它們具有免疫活性。這意味著經(jīng)間歇滅菌的完整細(xì)胞保持了其對galt的特異性免疫刺激活性。

腸相關(guān)淋巴組織(gut-associatedlymphoidtissue)，也稱為galt，通常是指存在于消化道水平的免疫系統(tǒng)部分。galt是粘膜相關(guān)淋巴組織的一個例子，其主要和次要應(yīng)答都負(fù)責(zé)保護(hù)粘膜免受病原體攻擊。實際上，胃腸系統(tǒng)代表與外部環(huán)境的溝通途徑，并且主要由潛在致病微生物居住(尤其是腸)，從而需要在粘膜水平上強(qiáng)力存在免疫系統(tǒng)以確保對這些群體的控制。

在研究最多的乳酸菌菌株中，毫無疑問，鼠李糖乳桿菌(lactobacillusrhamnosus)ggatcc53103由于其非凡的免疫刺激性質(zhì)/活性而被有效地用在人和兒科使用的許多制劑中。然而，迄今為止，不存在含有鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的經(jīng)間歇滅菌的細(xì)菌細(xì)胞的制劑。這特別是由于如下事實，即時至今日不可能確定存在于細(xì)菌細(xì)胞樣品中的經(jīng)間歇滅菌的完整細(xì)胞的確切數(shù)目。

因此，通過快速可靠和完全可再現(xiàn)的分析方法，能夠確定樣品中存在的具有完整的免疫活性細(xì)胞(具有未修飾的細(xì)胞壁的細(xì)胞)的經(jīng)間歇滅菌的細(xì)菌細(xì)胞的確切數(shù)目將是非常有用的。此外，還必須能夠確保經(jīng)間歇滅菌的完整的免疫活性細(xì)胞的確定數(shù)量對應(yīng)于在測試的經(jīng)間歇滅菌的樣品中實際存在的數(shù)量，以便于其施用，確保使用的劑量的再現(xiàn)性，延長即使在30℃的溫度下的保質(zhì)期以允許將鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的細(xì)菌細(xì)胞運送到更暖和的國家，并促進(jìn)將所述細(xì)菌細(xì)胞加工成最終產(chǎn)品(制劑)。

然而，目前并尚未獲得制造具有以快速、準(zhǔn)確、可靠和完全可再現(xiàn)的方式確定的細(xì)胞數(shù)的鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的經(jīng)間歇滅菌的完整的免疫活性細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)物的方法。

因此，仍然需要一種方法制造鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的經(jīng)間歇滅菌的完整的免疫活性細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)物；所述培養(yǎng)物具有準(zhǔn)確、可靠和完全可再現(xiàn)數(shù)量的細(xì)胞。此外，仍然需要一種分析方法，其能夠以快速、準(zhǔn)確、可靠和完全可再現(xiàn)的方式僅計數(shù)具有未修飾細(xì)胞壁從而保持其免疫系統(tǒng)的固有能力的鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的完整細(xì)菌細(xì)胞。

本發(fā)明的目的是鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的經(jīng)間歇滅菌的完整的免疫活性細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)物，如所附權(quán)利要求所述；所述培養(yǎng)物具有精確、可靠和完全可再現(xiàn)濃度值的經(jīng)間歇滅菌的細(xì)菌細(xì)胞。

本發(fā)明的目的是用于制備所述鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的經(jīng)間歇滅菌的完整的免疫活性細(xì)菌細(xì)胞的方法，如所附權(quán)利要求所述；所述方法快速、準(zhǔn)確、可靠且完全可再現(xiàn)。

本發(fā)明的目的是用于定性和定量地確定在先制備后經(jīng)間歇滅菌的鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物中存在的鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的經(jīng)間歇滅菌的完整的免疫活性細(xì)菌細(xì)胞的分析方法，如所附權(quán)利要求中所述。

本發(fā)明的一個目的是使用流式細(xì)胞熒光測定術(shù)來計數(shù)存在于鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的經(jīng)間歇滅菌的細(xì)菌細(xì)胞的樣品中的已死亡但完整的細(xì)胞，如所附權(quán)利要求中所述。

以下將在本說明書中描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。

本發(fā)明首先考慮了例如以固體形式的鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物，例如濃度為1×10⁶至1×10¹⁰ufc/g，優(yōu)選為1×10⁷至1×10⁹ufc/g的干燥、脫水或冷凍干燥的培養(yǎng)物的制備。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)和裝置制備培養(yǎng)物。一旦制備細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)，將其進(jìn)行間歇滅菌處理，以獲得經(jīng)間歇滅菌的細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物。

然后，為了定量經(jīng)間歇滅菌的完整的免疫活性細(xì)菌細(xì)胞，申請人開發(fā)了一種創(chuàng)新的分析計數(shù)方法以用于定性和定量確定經(jīng)間歇滅菌的細(xì)菌細(xì)胞，其有效應(yīng)用于鼠李糖乳桿菌gg(53103)并基于細(xì)胞熒光測定術(shù)的使用。

申請人將流式細(xì)胞熒光測定術(shù)應(yīng)用于鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的經(jīng)間歇滅菌的完整細(xì)菌細(xì)胞的樣品，所述樣品是通過已知的間歇滅菌技術(shù)和裝置獲得的。

所要求保護(hù)的方法可用于鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的細(xì)菌細(xì)胞的快速準(zhǔn)確計算，所述鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的細(xì)菌細(xì)胞在通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)和裝置進(jìn)行制備后，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)和裝置進(jìn)行間歇滅菌處理，這使其復(fù)制能力和酶能力失活。

該方法是由申請人開發(fā)的，因為傳統(tǒng)的計數(shù)方法不允許定量存在于經(jīng)間歇滅菌的生物樣品中的鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的死細(xì)菌細(xì)胞，并且同時不允許確保細(xì)菌細(xì)胞樣品具有良好建立和可再現(xiàn)的生物活性(刺激免疫系統(tǒng)和/或生物活性肽)。有利地是，該方法成功應(yīng)用于不能復(fù)制但具有細(xì)胞壁水平的結(jié)構(gòu)完整性的鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的細(xì)菌細(xì)胞。

本發(fā)明的方法設(shè)計了一系列步驟，這將在以下說明書中更詳細(xì)地描述。

首次應(yīng)用流式細(xì)胞熒光測定術(shù)以計數(shù)鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的經(jīng)間歇滅菌的完整細(xì)菌細(xì)胞。

因此，本發(fā)明的一個目的是使用細(xì)胞熒光測定法來產(chǎn)生、計數(shù)和確定鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量及其在經(jīng)間歇滅菌的樣品中的生物學(xué)活性。

流式細(xì)胞儀提供了一種快速可靠的方法來定量細(xì)菌懸液中存在的活細(xì)胞/死細(xì)胞。通過細(xì)胞熒光測定分析，可以利用專門研究細(xì)胞壁完整性的“bd^tm細(xì)胞活力”(bd^tmcellviability”)試劑盒(由bectondickinson公司出售)中所含的特定染料的組合，在生物樣品例如細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物中區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。

可商購的試劑盒包含第一染色試劑如噻唑橙(to)，其能夠標(biāo)記所有細(xì)胞(活細(xì)胞和死細(xì)胞)，以及第二染色試劑如碘化丙啶(pi)，其針對死細(xì)胞具有特異性。

對于定量細(xì)胞確定，必須與上述試劑盒，由bectondickinson公司出售的熒光小珠“bd^tm液體計數(shù)小珠”(“bd^tmliquidcountingbeads”)的懸浮液相關(guān)聯(lián)。所述小珠懸浮液是熒光聚苯乙烯微球在0.1％疊氮化鈉溶液中的懸浮液。

加入10至100μl，優(yōu)選為40至60μl的已知量的小珠，這允許通過外推收集的數(shù)據(jù)來確定絕對細(xì)胞計數(shù)。

具有完整細(xì)胞質(zhì)膜的活細(xì)胞對于染料，如碘化丙啶(pi)不可滲透。相反，諸如碘化丙啶(pi)等染料可以進(jìn)入具有受損的細(xì)胞質(zhì)膜的細(xì)胞。噻唑橙(to)是能夠進(jìn)入所有細(xì)胞(活細(xì)胞和死細(xì)胞)的染料。這兩種染色試劑的組合提供了一種快速可靠的方法來區(qū)分具有結(jié)構(gòu)完整性的活細(xì)菌細(xì)胞和死細(xì)菌細(xì)胞。

重要的是執(zhí)行對試劑和測試樣品進(jìn)行調(diào)理(conditioning)的初步步驟。

因此，程序如下：

·使用前將所有試劑盒試劑置于室溫。

·將含有細(xì)菌細(xì)胞的生物樣品在室溫下放置1-6小時，優(yōu)選當(dāng)儲存在-20℃的溫度時1.5至3小時，例如2至2.5小時，當(dāng)儲存在+4℃時約60分鐘，例如30分鐘。

·在緩慢輕柔攪拌下放入含有小珠的懸浮液。

接下來，進(jìn)行制備鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物，隨后對其間歇滅菌，以獲得經(jīng)間歇滅菌的細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)物，例如為固體形式，如干燥、脫水或冷凍干燥培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物具1×10⁶至1×10¹⁰ufc/g，優(yōu)選為1×10⁷至1×10⁹ufc/g的濃度。

然后，進(jìn)行試驗樣品的制備。

·在液體形式的樣品的情況下，在0.1％無菌蛋白胨鹽水中連續(xù)稀釋1:10，直至達(dá)到約10⁵-10⁷個細(xì)胞/ml的濃度。

·在無水樣品的情況下，在無菌袋中以1:10復(fù)建樣品，然后將其整齊(stomachingthewhole)，以使制劑勻質(zhì)化。然后，如同在液體形式的樣品的情況下，進(jìn)行隨后的1:10稀釋。

接下來，通過使用細(xì)胞熒光測定術(shù)對活細(xì)胞/死細(xì)胞的量進(jìn)行分析。

關(guān)于染色步驟，程序如下：

·向0.5ml適宜稀釋液加入2.5μl噻唑橙to和1.5μl碘化丙啶pi，在室溫下攪拌并溫育2分鐘；和

·加入50μl含有小珠的懸浮液，并對樣品進(jìn)行細(xì)胞熒光測定分析。

然后，執(zhí)行數(shù)據(jù)的獲取和分析。

建立細(xì)胞圖，其中x軸表示正向散射(fsc)和y軸表示側(cè)向散射(ssc)，以限定待分析的群體(r2，參見圖1)。

為了將基于所使用的染料的內(nèi)在化而區(qū)分的細(xì)胞亞群正確地可視化，建立第二細(xì)胞圖，其中x軸表示fl-1(to，參見圖2)和y軸表示fl-3(pi，參見圖2)。

圖1涉及fsc對ssc細(xì)胞圖，而圖2涉及fl1對fl3細(xì)胞圖。

接下來，執(zhí)行結(jié)果的計算和表達(dá)。

為了確定樣品中死細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)目，使用下列公式。

(*)待應(yīng)用的數(shù)值是在所使用的小珠包裝上注明的數(shù)值，并在批次間不同；d.f.＝稀釋因子

對于液體形式的樣品結(jié)果表示為細(xì)胞數(shù)/ml，或?qū)τ跓o水形式的樣品表示為細(xì)胞數(shù)/g。

通過使用上述公式和由區(qū)域(r6)限定的細(xì)胞事件，獲得樣品中存在的死細(xì)胞數(shù)。

已死亡但具有結(jié)構(gòu)完整性的細(xì)胞對于液體形式的樣品以細(xì)胞數(shù)/ml表示，或者對于無水形式的樣品以細(xì)胞數(shù)/g表示。

一個實施方式涉及用于計數(shù)在鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的經(jīng)間歇滅菌的細(xì)菌細(xì)胞的樣品中具有完整細(xì)胞膜的死細(xì)胞數(shù)目的方法；所述方法包括：

-通過連續(xù)稀釋制備含有濃度為10⁵至10⁷個細(xì)胞/ml的鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的經(jīng)間歇滅菌的細(xì)菌細(xì)胞的樣品；

-向所述樣品中加入第一試劑噻唑橙和第二試劑碘化丙啶，以獲得溶液；

-向所述溶液中加入熒光微球在疊氮化鈉中的懸浮液，以獲得測試樣品；

-通過流式細(xì)胞熒光測定術(shù)對所述測試樣品進(jìn)行總細(xì)胞計數(shù)，包括活細(xì)胞和死細(xì)胞，以及單獨死細(xì)胞計數(shù)；

-計數(shù)在經(jīng)間歇滅菌的樣品中存在的死細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述方法進(jìn)一步設(shè)想，向0.5ml含有濃度為10⁵至10⁷個細(xì)胞/ml的鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的經(jīng)間歇滅菌的細(xì)菌細(xì)胞的樣品加入2.5微升所述第一試劑和1.5微升所述第二試劑以獲得溶液。

優(yōu)選地，所述方法進(jìn)一步設(shè)想，熒光微球在疊氮化鈉中的懸浮液包含聚苯乙烯微球，優(yōu)選小珠懸浮液是熒光聚苯乙烯微球在0.1％疊氮化鈉溶液中的懸浮液。

優(yōu)選地，所述方法還設(shè)想加入10-100μl，優(yōu)選40-60μl的已知量的小珠，用于允許細(xì)胞計數(shù)測定。

另一個實施方式涉及制造具有完整細(xì)胞壁的鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的經(jīng)間歇滅菌的細(xì)菌細(xì)胞的方法；所述方法包括：

-制備濃度為1×10⁶至1×10¹⁰ufc/g的鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物；

-使所述培養(yǎng)物進(jìn)行間歇滅菌處理以獲得經(jīng)間歇滅菌的細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)物；

-應(yīng)用上述計數(shù)方法。

另一個實施方式涉及通過如上所述的制造細(xì)菌細(xì)胞的方法獲得的鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的經(jīng)間歇滅菌的完整的免疫活性細(xì)菌細(xì)胞的培養(yǎng)物。

另一個實施方式涉及流式細(xì)胞熒光測定術(shù)用于計數(shù)在鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的經(jīng)間歇滅菌的細(xì)菌細(xì)胞的樣品中具有完整細(xì)胞膜的鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的經(jīng)間歇滅菌的死細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)目的用途。

優(yōu)選地，所述用途設(shè)想用如上所述的計數(shù)方法計數(shù)具有完整細(xì)胞膜的鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的經(jīng)間歇滅菌的死細(xì)菌細(xì)胞。

以下示出了對鼠李糖乳桿菌gg(atcc53103)的細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行的實驗實施例(值以bn/g表示)：

圖3涉及所述樣品的fsc對ssc細(xì)胞圖，而圖4涉及所述樣品的fl1對fl3細(xì)胞圖。

使用的細(xì)胞熒光計和試劑盒具有以下規(guī)格。

·配有488nm激光激發(fā)的流式細(xì)胞儀facscalibur3ca(bectondickinsonitalia，目錄號343020)及其cellquest^tm軟件。

·具有bd液體計數(shù)珠的bd^tm細(xì)胞活力試劑盒(目錄號34948)。