本發(fā)明主要涉及胃腸道疼痛的調(diào)節(jié)且特別是涉及能夠調(diào)節(jié)胃腸道疼痛的藥物，如乳酸細菌的選擇和這樣的藥物的用途。

背景

胃腸道疼痛是與胃腸道有關(guān)的許多病癥、疾病和紊亂的癥狀。功能性腹痛，指經(jīng)常性腹痛。絕大多數(shù)具有經(jīng)常性腹痛的患者患有"功能性"或"非-器官性"疼痛，意指疼痛不是由身體異常引起的。各種運動障礙也與疼痛和便秘或腹瀉有關(guān)。該術(shù)語被用來描述其中由于各種原因腸道沒有適當(dāng)?shù)匕l(fā)育或失去了其協(xié)調(diào)肌肉活動的能力的各種疾病。

這樣的疾病可能以多種方式表現(xiàn)，并包括但不限于以下那些：

● 腹脹

● 復(fù)發(fā)性梗阻

● 腹疝痛

● 便秘

● 胃食管返流疾病

● 難治性、復(fù)發(fā)性嘔吐

● 腹瀉

● 腸易激綜合征(IBS)

● 炎性腸道疾病

● 大便失禁

● 嬰兒腹疝痛

● 頻繁復(fù)發(fā)性腹痛(FRAP)

● 反流

● 食物耐受不良

在廣義上說，在食物和分泌物運輸進入消化道的任何重大改變可被認為是一種腸道運動障礙，且這種類型的障礙往往與胃腸道疼痛有關(guān)。

需要胃和腸的適當(dāng)協(xié)調(diào)運動以消化并沿著消化道推進腸道內(nèi)容物。胃腸(GI)道的適當(dāng)運動所必需的收縮和松弛的模式是復(fù)雜的并利用GI壁內(nèi)的神經(jīng)和肌肉。每一天，在任何時間，許多因素可影響GI運動，例如體育鍛煉和情緒困擾。新生兒必須在GI道中發(fā)育復(fù)雜的運動系統(tǒng)。功能失調(diào)性胃腸運動常與GI疼痛有關(guān)。

衰老、癡呆、中風(fēng)、帕金森氏病、脊柱損傷、分娩期間的直腸撕破、糖尿病、外科并發(fā)癥和神經(jīng)肌肉疾病，如重癥肌無力，可引起與疼痛相關(guān)的運動障礙。

腸易激綜合征(IBS)，一種腸道運動和GI疼痛的常見診斷疾病，幾十年來一直被認為是結(jié)腸的疾病，但有關(guān)GI運動的研究已經(jīng)證明，潛在的運動擾亂也可以發(fā)生在小腸。IBS可常常伴有GI疼痛，而TRPV1免疫反應(yīng)性已被證明在IBS患者中顯著增加(Akbar, Yiangou等, Gut 2008)。

便秘，往往與GI疼痛有關(guān)，是美國最常見的消化道疾病，但盡管它頻繁出現(xiàn)，往往仍然未被識別，直至患者發(fā)生繼發(fā)性疾病，如肛腸紊亂或憩室病。如前提及的，GI疼痛是便秘的一種常見癥狀。

便秘在懷孕期間是很常見的。由于較高水平的激素孕酮和可能作為產(chǎn)前維生素服用的額外的鐵，通常移動食物通過腸道的肌肉收縮緩慢下降。這往往也伴有下腹疼痛。

便秘也與增加的年齡有關(guān)，并且所謂的“老化的腸道”通常特別是在年逾70的人群中和在長期護理機構(gòu)中發(fā)現(xiàn)。

在腸道運動障礙年齡譜的另一端，因嬰兒疝痛所致的持續(xù)或過度啼哭是嬰兒期最煩惱的問題之一。這對于嬰兒、父母和涉及的醫(yī)療保健專業(yè)人員而言，都是令人煩惱的。疝氣疼痛往往突然開始和停止。

繼發(fā)于假定的自主神經(jīng)失衡的腸運動過強也已被提出為一個疝痛的病因。調(diào)節(jié)運動活性的許多機制在嬰兒中是不成熟的。這些機制的不成熟可導(dǎo)致對喂養(yǎng)不耐受的脆弱性增加。因此，疝痛可能是嬰兒亞群中的一種常見的臨床表現(xiàn)，這些嬰兒在運動調(diào)節(jié)的一個或多個方面具有成熟性功能異常并常常導(dǎo)致嬰兒的GI疼痛。

腸運動障礙適用于往往與GI疼痛有關(guān)的異常的腸收縮，對于不同疾病有許多不同種類的治療和建議，其中一些比許多其它治療和建議更有效。

因此，存在解決各種運動障礙和疼痛性疾病的整體需要和特定問題，即如何最佳選擇預(yù)防或減輕胃腸道疼痛的藥物。

瞬時受體電位香草素1 (TRPV1)是在例如外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)、呼吸系統(tǒng)和胃腸道中表達的Ca²⁺滲透陽離子通道。TRPV1被物理和化學(xué)刺激，例如溫度、pH改變和辣椒堿激活，并對傷害性和熱性炎癥性疼痛的檢測是至關(guān)重要的。在胃腸道中，TRPV1免疫反應(yīng)性可例如在內(nèi)臟感覺傳入神經(jīng)中被發(fā)現(xiàn)，且TRPV1細胞將例如胃疼痛的感覺傳播到腦的更高級中心。TRPV1被認為涉及幾種與疼痛感覺相關(guān)的胃腸病癥，且TRPV1免疫反應(yīng)性已表明在例如IBS中顯著地增加(Akbar, Yiangou等, Gut 2008)。作為這樣的一個實例，經(jīng)診斷患有活動性炎性腸道疾病的患者證實在結(jié)腸神經(jīng)纖維中的TRPV1免疫反應(yīng)性大大增加(Wang, Miyares和Ahern, 2005 J. Physiol.)。

雖然TRPV1被認為是開發(fā)治療不同形式疼痛的藥物的潛在靶標(biāo)，但該受體的廣泛表達可導(dǎo)致不良事件，這限制了系統(tǒng)性TRPV1拮抗劑在治療胃腸道疼痛中的使用。特別是，作為血管活性肽釋放減少的結(jié)果，拮抗該受體可能潛在地導(dǎo)致心血管并發(fā)癥。

發(fā)明簡述

尋找適合于減輕或預(yù)防胃腸道疼痛的藥物是一個總的目標(biāo)。

提供一種選擇有效減輕或預(yù)防胃腸道疼痛的藥物，優(yōu)選細菌菌株和更優(yōu)選乳酸細菌的方法是一個特定的目標(biāo)。

這些和其它目標(biāo)通過如本文公開的實施方案得到滿足。

實施方案的一個方面涉及一種選擇有效減輕或預(yù)防受試者的胃腸道疼痛的藥物的方法。所述方法包括選擇能夠減少自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的瞬時受體電位香草素1 (TRPV1)激活作用的藥物。

實施方案的另一個方面涉及通過以上鑒定的方法選擇的藥物。

實施方案的一個進一步的方面涉及通過以上鑒定的選擇方法可獲得的、用于減輕或預(yù)防受試者的胃腸道疼痛的藥物。

實施方案的又一個方面涉及一種組合物，其包含通過以上鑒定的選擇方法可獲得的藥物和至少一種另外的選自藥學(xué)上可接受的載體、藥學(xué)上可接受的稀釋劑、藥學(xué)上可接受的賦形劑、食品、食物補充劑和另一種預(yù)防劑或治療劑的組分。

實施方案的一個相關(guān)方面限定用于減輕或預(yù)防受試者的胃腸道疼痛的如上定義的藥物或如上定義的組合物。

實施方案的另一個相關(guān)方面限定通過以上鑒定的選擇方法可獲得的或如上定義的藥物或如上定義的組合物在制備用于減輕或預(yù)防受試者的胃腸道疼痛的藥物、食物產(chǎn)品或食物補充劑產(chǎn)品中的用途。

實施方案的還一個方面涉及一種減輕或預(yù)防受試者的胃腸道疼痛的方法。所述方法包括給予受試者有效量的通過以上鑒定的選擇方法可獲得的或如上定義的藥物或如上定義的組合物。

本實施方案提供可用來選擇或鑒定藥物，特別是細菌菌株，如乳酸細菌的有效的技術(shù)，所述藥物可用來減輕或預(yù)防患有引起胃腸道疼痛的障礙或疾病或與胃腸道疼痛有關(guān)的障礙或疾病的受試者，優(yōu)選人類受試者的胃腸道疼痛。

附圖簡述

實施方案，與其另外的目的和優(yōu)點一起，通過參考與附圖結(jié)合在一起的以下描述，可最好地得到理解，其中：

圖1顯示在加入1x10⁸ DSM 17938單位(cfu)/ml (A)、1x10⁹ cfu/ml DSM 17938 (B)、稀釋的DSM 17938條件培養(yǎng)物(1:5) (C)、1x10⁹ cfu/ml γ-輻照的DSM 17938 (D)和稀釋的單獨培養(yǎng)基(1:5) (E)后的腸系膜多單位自發(fā)放電(mesenteric multiunit spontaneous firing) (Wilcoxon檢驗)。

圖2顯示DSM 17938對脊髓傳入神經(jīng)自發(fā)放電速率的影響。A) 當(dāng)1x10⁹ cfu/ml DSM 17938被添加到管腔中時，多單位放電速率降低(Wilcoxon檢驗)。B) 左小圖，脊髓單-單位放電被DSM 17938減少(Wilcoxon檢驗)。C) 上小圖，加入DSM 17938之前和之后的自發(fā)多單位放電的代表性痕跡；下小圖，在上面的痕跡中由“o”標(biāo)記的時間點發(fā)生的一個單一單位的疊加波形。

圖3顯示，DSM 17938通過加入辣椒堿至漿膜液中拮抗脊髓纖維的興奮性應(yīng)答。A) 從113個脊髓各自的單一單位繪制辣椒堿劑量-反應(yīng)曲線圖(●)并用一個三參數(shù)邏輯方程擬合，EC₅₀= 200 nM。Max= 238 ± 27 %；對于另外116個纖維，辣椒堿的劑量-反應(yīng)曲線圖在1x10⁹ cfu/ml DSM 17938的存在下另外繪制(■)并用相同的邏輯方程擬合，對此EC₅₀= 500 nM和Max= 129 ± 17 % (對于EC₅₀和Max的差異分別為P = 0.7和P= 0.004，額外的平方和F檢驗(extra sum-of-squares F test))。B) 具有均數(shù)和SEMs的概括散點圖顯示在1x10⁹cfu/ml DSM的不存在或存在下，單一單位應(yīng)答如何隨著辣椒堿的劑量增加而變化。(n )表示每個組的單一單位的比例。

圖4顯示，DSM 17938或TRPV1拮抗劑減少在脊髓單一單位中由擴張引起的興奮性應(yīng)答。A) 分散圖顯示，加入1x10⁹ DSM 17938至管腔降低通過提高腔內(nèi)壓力至48 hPa引發(fā)的脊髓單一單位放電速率的增加。B) 加入10μM的TRPV1拮抗劑6-碘代降二氫辣椒堿至管腔模擬加入DSM 17938的作用(Wilcoxon檢驗)。

圖5顯示，DSM 17938減少辣椒堿-誘導(dǎo)的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元胞體中的Ca²⁺升高。A) 1μM辣椒堿誘導(dǎo)DRG神經(jīng)元Ca²⁺進入的增加，其被被管腔內(nèi)DSM 17938造成劑量-依賴性減少且不受1x10⁹ cfu/ml JB-1的影響。B) 概括圖顯示，由辣椒堿誘導(dǎo)的最大Ca²⁺熒光(F)對基線Ca²⁺熒光(F₀)的比率(F/F₀)如何隨著17938濃度或JB-1變化。(P 值，Bonferroni's多重比較檢驗)。

圖6顯示，用DSM 17938喂食9天減輕胃脹誘發(fā)的心動過緩。A) 由40和60 mmHg胃脹誘導(dǎo)的靜息心率的百分比降低的總結(jié)值(P 值，未配對t檢驗)。B) 概括圖顯示靜息心率如何隨時間的推移響應(yīng)于60 mmHg胃脹而變化(P = 0.01，雙向ANOVA檢驗)。

圖7顯示，DSM 17938誘導(dǎo)的辣椒堿對脊髓傳入神經(jīng)的興奮性作用降低通過DSM 17938條件培養(yǎng)物模擬。概括圖顯示由1μM辣椒堿在對照條件、用DSM 17938條件培養(yǎng)物(1:5)或用1x10⁹ cfu/ml DSM 17938誘導(dǎo)的單-單位脊髓纖維的放電頻率增加(P=0.02，單向ANOVA檢驗；事后P值，Holm-Sidak’s多重比較檢驗)。

詳細描述

為促進對本發(fā)明的理解，一些術(shù)語定義如下。

"胃腸道疼痛"，也稱為GI疼痛，表示受試者的胃腸系統(tǒng)的疼痛。這樣的胃腸道疼痛往往典型地由胃腸系統(tǒng)的各種疾病和障礙引起或與它們有關(guān)，即是它們的癥狀或疾病成分。胃腸道疼痛包括胃腸系統(tǒng)的一般性疼痛，往往表示本領(lǐng)域的一般性胃腸道疼痛、與腸運動障礙有關(guān)的疼痛、源自炎性腸道疾病和腸易激綜合征的疼痛、胃痛、一般性腹痛、內(nèi)臟痛，功能性腹痛、頻繁的經(jīng)常性腹痛和其它功能性胃腸障礙的疼痛。

“功能性腹痛”指經(jīng)常性腹痛。絕大多數(shù)具有經(jīng)常性腹痛的患者具有"功能性"或"非-器官性"疼痛，意味著疼痛不是由身體異常引起。

"腸運動障礙"被用來描述各種障礙，其中腸道由于各種原因沒有適當(dāng)?shù)匕l(fā)育或失去了其協(xié)調(diào)肌肉活動的能力。這樣的障礙可以多種方式表現(xiàn)，并包括但不限于以下那些：

● 腹脹

● 復(fù)發(fā)性梗阻

● 腹疝痛

● 便秘

● 胃食管返流疾病

● 難治性、復(fù)發(fā)性嘔吐

● 腹瀉

● 腸易激綜合征(IBS)

● 炎性腸道疾病

● 大便失禁

● 嬰兒腹疝痛,

● 頻繁復(fù)發(fā)性腹痛(FRAP)

● 反流

● 食物耐受不良

在廣義上說，在食物和分泌物運輸進入消化道的任何重大改變可被認為是一種腸道運動障礙，且這往往與胃腸道疼痛有關(guān)。

“胃痛”是一個用來描述上腹部疼痛或不適的集合術(shù)語。

在一實施方案中，胃痛的原因選自非-潰瘍性消化不良、消化性潰瘍、胃食管返流疾病和胃炎，例如由它們組成。

在一特定的實施方案中，胃痛的原因是非-潰瘍消化不良和/或胃炎。

如本文所用的，術(shù)語“放電頻率”被用來測量感覺神經(jīng)至腦的棘波串(spike trains)。

如本文所用的，術(shù)語“腔內(nèi)峰壓” (PPr)是基于腔內(nèi)壓力記錄，其中腔內(nèi)壓力變化在腸段的縱向軸線的中點測定。分析壓力信號并鑒定和測量腔內(nèi)峰壓(PPr)。

如本文所用的，術(shù)語“遷移運動復(fù)合頻率” (MMC頻率)通過計數(shù)時空地圖中暗MC波段的數(shù)量來計算。

如本文所用的，術(shù)語“遷移運動復(fù)合速度” (MMC速度)從遷移運動復(fù)合物產(chǎn)生的時空地圖中每個波段的斜率測定。

如本文所用的，術(shù)語“藥物”被用來指任何物質(zhì)或材料，包括全細胞；微生物；條件培養(yǎng)物；源自這樣一種條件培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)、肽、酶和/或分子；從全細胞或微生物分泌或衍生的蛋白質(zhì)、肽、酶和/或分子；或其它可用來調(diào)節(jié)哺乳動物的胃腸系統(tǒng)的胃腸道疼痛的生物學(xué)或化學(xué)材料。優(yōu)選的藥物的實例有細菌菌株，例如益生菌菌株，和特別是乳酸菌菌株。優(yōu)選的藥物的另一個實例是來自細菌菌株，例如益生菌菌株，和特別是乳酸菌菌株的條件培養(yǎng)物。

條件培養(yǎng)物，有時也稱為條件培養(yǎng)基，是細胞已在其中培養(yǎng)一段時間的一種培養(yǎng)物(培養(yǎng)基)。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞通過釋放或分泌各種成分或分子，如蛋白質(zhì)、肽、酶、細胞因子、趨化因子、化學(xué)物等“調(diào)整”培養(yǎng)物。

開始接受的是，腸道微生物作為所謂的微生物組群-腸-腦軸(microbiome-gut-brain axis)的部分發(fā)信號至腦。然而，有關(guān)腸道微生物組群在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育或功能中的作用幾乎不知道。目前幾乎很少知道關(guān)于從腸道傳遞到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)信號的定量性質(zhì)。

單一感覺神經(jīng)元，包括迷走神經(jīng)纖維中的那些，代表連續(xù)的物理刺激作為編碼刺激的性質(zhì)和強度的圖案化的棘波串。除此之外，刺激可以由束中的活性纖維數(shù)確定的群體代碼表示。經(jīng)由初級傳入神經(jīng)到達大腦的所有信息必須以神經(jīng)元棘波串的語言編碼。因此，知道感覺棘波串如何受到各種藥物，如共生物、益生菌株和不同物質(zhì)的影響，使得人們能夠通過它們對初級傳入放電以及以各種方式可干預(yù)這種信號傳導(dǎo)系統(tǒng)(特別是通過調(diào)節(jié)TRPV1激活作用)的新的藥物和其它化合物的影響，鑒定新的有益腸道微生物和它們的活性分子。

本文實施方案的方法被用來選擇用于經(jīng)抑制信號傳導(dǎo)通過TRPV1受體減輕或預(yù)防胃腸道疼痛的藥物。所述實施方案的方法可由此用來評價可潛在地有效預(yù)防胃腸道疼痛和/或有效減輕、抑制或治療胃腸道疼痛的藥物。因此，該方法可用來鑒定能夠調(diào)節(jié)與外周(腸)和/或中樞神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)的胃腸道疼痛的有效藥物。

因此，所述實施方案的一個方面涉及一種選擇有效于，即用于減輕或預(yù)防受試者的胃腸道疼痛的藥物的方法。所述方法包括選擇能夠減少自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的瞬時受體電位香草素1 (TRPV1)激活作用的藥物。

從而實施方案基于使用作為選擇工具的TRPV1信號傳導(dǎo)途徑，在患有涉及或引起這樣的胃腸道疼痛的疾病或障礙和可表現(xiàn)出胃腸道疼痛疾病或障礙的受試者中，鑒定有效調(diào)節(jié)，特別是預(yù)防或減輕，如抑制或治療胃腸道疼痛的藥物。

該實施方案的方法通常在體外或離體進行，如本文進一步公開的。然而，當(dāng)給予受試者時，藥物優(yōu)選地能夠在受試者中減少自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1激活作用。

所述實施方案的方法因此可用來發(fā)現(xiàn)用于不同的胃腸道疼痛障礙和疾病中減輕或預(yù)防胃腸道疼痛的合適藥物。選擇藥物以有益的方式影響受試者的TRPV1激活作用，以調(diào)節(jié)，即優(yōu)選地預(yù)防、減輕或治療胃腸道疼痛。

在一實施方案中，用通過該方法選擇的藥物來預(yù)防或治療的與胃腸道疼痛有關(guān)的障礙或疾病是胃腸道疼痛障礙或疾病。

在一實施方案中，胃腸道疼痛是胃痛。

在一實施方案中，胃腸道疼痛是內(nèi)臟疼痛。

在一實施方案中，胃腸道疼痛可存在于患有疝痛的受試者中。

在一實施方案中，胃腸道疼痛可存在于患有腸易激綜合征(IBS)的受試者中。

在一實施方案中，胃腸道疼痛可存在于患有便秘的受試者中。胃腸道疼痛可存在于患有如前定義的腸運動障礙的受試者中。

因此，在一實施方案中，受試者患有與胃腸道疼痛有關(guān)的腸道運動障礙。

所述實施方案的方法基于意外的發(fā)現(xiàn)，即包括與不同的病癥和障礙如運動障礙有關(guān)的疼痛(并表現(xiàn)為中樞或外周)的胃腸道疼痛，與TRPV1激活作用有關(guān)聯(lián)，其可通過以前未知的藥物，如乳酸細菌調(diào)節(jié)。

一類胃腸道疼痛是由腹部內(nèi)臟(器官)的傷害感受器激活作用引起的內(nèi)臟疼痛。內(nèi)臟結(jié)構(gòu)對膨脹(拉伸)、局部缺血和炎癥是高度敏感的，但對通常引起疼痛的其它刺激是相對不敏感的。內(nèi)臟痛是彌漫性的，很難定位，而且經(jīng)常涉及遠端結(jié)構(gòu)，通常為淺表結(jié)構(gòu)。其可伴有癥狀如惡心、嘔吐、生命體征的變化以及情感表現(xiàn)。疼痛可被描述為令人作嘔的、深入的、擠壓的，和隱隱的。不同的結(jié)構(gòu)損傷或生化異常只能解釋一部分患者的這種類型的疼痛。這些疾病有時被分組為胃腸神經(jīng)肌肉疾病(GINMD)。人們也可經(jīng)歷內(nèi)臟疼痛，往往在性質(zhì)上是非常強烈的，沒有對于這樣的癥狀的結(jié)構(gòu)、生物化學(xué)或組織病理學(xué)(histolopathologic)理由的任何證據(jù)。

傷害感受器是通過對特定的傷害感受性神經(jīng)元(Aδ或C)發(fā)送動作電位對潛在的破壞性刺激作出反應(yīng)的感覺受體，所述神經(jīng)元再將刺激傳遞到脊髓前外側(cè)束(加上一個小的迷走神經(jīng)突起)，然后傳遞到丘腦，和前腦包括島葉和扣帶回皮質(zhì)(cingulate cortices)。起源于腸道病理學(xué)的疼痛感知的關(guān)鍵是經(jīng)由在腸系膜傳入神經(jīng)束中傳播的外部初級傳入纖維，從腸道到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疼痛信息的激活作用。

該方法可用來篩選藥物，以選擇具有所需特性，例如降低TRPV1激活作用，用于減輕或預(yù)防胃腸道疼痛的藥物。在該方法中待測的參數(shù)，即自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1激活作用，可以不同的模型和系統(tǒng)監(jiān)測和確定。使用這種信息，可獲得用來限定特定藥物具有的對在胃腸道疼痛中的疼痛信號傳導(dǎo)的詳細的和潛在細微影響的概況。

可以該方法測定的其它參數(shù)包括一般的疼痛信號傳導(dǎo)、神經(jīng)放電活動，例如腸系膜神經(jīng)束分析，和可能使用胃腸道疼痛的不同體內(nèi)模型。

在一實施方案中，TRPV1激活作用在表達TRPV1的細胞，如背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元、CaCo2細胞或另一個標(biāo)準(zhǔn)人腸上皮細胞系中測定。可測量自發(fā)的TRPV1激活作用和通過例如辣椒堿、pH改變或溫度誘導(dǎo)后TRPV1激活作用二者。一般來說，表達TRPV1的任何細胞或組織可被用來測量依據(jù)實施方案的TRPV1激活作用。

因此，在一實施方案中，該方法包括使表達TRPV1的細胞與待測的藥物接觸。該方法也包括隨后，即在細胞與待測的藥物接觸后，測定細胞中的自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1激活作用。該方法還包括比較測定的自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1激活作用與對照TRPV1激活作用。在這個實施方案中，該方法還包括選擇待測的藥物作為有效減輕或預(yù)防胃腸道疼痛的藥物，如果測定的自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1激活作用低于對照TRPV1激活作用的話。

對照TPRV1激活作用可依據(jù)各個實施方案確定。例如，TRPV1激活作用可從具有激活水平的TRPV1表達細胞預(yù)先限定和確定，該水平代表對應(yīng)于例如基本上無胃腸道疼痛的正常或基線激活作用。

然而，測定對照TRPV1激活作用的優(yōu)選的實施方案是使用TRPV1表達細胞作為內(nèi)部對照。因此，在一實施方案中，該方法包括在細胞與待測的藥物接觸之前，測定細胞中的自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1激活作用。該方法也包括在細胞與待測的藥物接觸之前，基于在細胞中測定的自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1激活作用，測定對照TRPV1激活作用。

在該途徑中，自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1激活作用測量因而優(yōu)選地進行兩次：在細胞與待測的藥物接觸之前和在細胞與待測的藥物接觸之后。

或者，自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1激活作用測量可以兩次平行的實驗進行：一次用待測的藥物接觸細胞的實驗和一次細胞不與所述藥物接觸的對照實驗。用于這兩次實驗的細胞則具有相同的類型，如都是DRG神經(jīng)元、CaCo2細胞或另一個標(biāo)準(zhǔn)人腸上皮細胞系。自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1激活作用在兩個實驗中測定，然后彼此比較。

用于該方法的細胞可以是任何表達TRPV1的細胞，包括，但不限于離體制劑、表達TRPV1的細胞系，如表達TRPV1的人腸上皮細胞系，和表達TRPV1的原代細胞。

測定的自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1激活作用和對照TRPV1激活作用可一般表示為各自的參數(shù)值或度量，包括表示自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1激活作用水平的值。

在一實施方案中，原代細胞例如背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元被用來分析TRPV1激活作用。

在另一個實施方案中，表達TRPV1的細胞系如CaCo2或另一個標(biāo)準(zhǔn)人腸上皮細胞系被用來分析TRPV1激活作用。

在其它實施方案中，可市售獲得的表達TRPV1的細胞系被用來分析TRPV1激活作用，見例如來自Chantest的分類號CT6105。

用戶報告基因細胞，也表示為本領(lǐng)域的報告基因細胞，也可能用來監(jiān)測和測量TRPV1表達和/或自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1激活作用。

幾種不同的方法可用來研究TRPV1激活作用，包括，但不限于使用例如通過例如辣椒堿誘導(dǎo)的鈣流入的功能性分析和/或其通過藥物在表達TRPV1的細胞中的預(yù)防作用和自發(fā)的和/或通過例如辣椒堿誘導(dǎo)的腸系膜神經(jīng)束的放電頻率。在另一個實施方案中，使用實時PCR機器的溫度門控離子通道活性的功能性評價，如在Reubish, Emerling等., BioTechniques 2009所述，可用來分析TRPV1激活作用。在另一個實施方案中，用于TRPV1通道的報告基因小鼠可被用來研究TRPV1激活作用。各種體內(nèi)范例也可用來分析對本發(fā)明的疼痛的影響。這些方法包括例如胃脹和對心率的影響(見實施例3)和結(jié)腸直腸膨脹模型。

因此，在一實施方案中，該方法包括測定由辣椒堿或另一個能夠誘導(dǎo)TRPV1激活作用的物質(zhì)，例如辣椒堿類似物或其它能夠激活TRPV1的物質(zhì)誘導(dǎo)的在細胞中的Ca²⁺流入。同樣，使細胞暴露于選擇的物理條件可被用來誘導(dǎo)TRPV1激活作用，包括改變pH或溫度。因此，使細胞暴露于酸性pH、堿性pH和/或熱(升高的溫度，典型地高于約42℃)可誘導(dǎo)TRPV1激活作用。在這個實施方案中，在表達TRPV1的細胞中的Ca²⁺流入由此被用作代表TRPV1激活作用的參數(shù)。減少TRPV1激活作用，和特別是減少pH-誘導(dǎo)的、熱-誘導(dǎo)的和/或辣椒堿-誘導(dǎo)的TRPV1激活作用，可被測定為減少Ca²⁺流入。在另一個實施方案中，該方法包括測定細胞的溫度門控離子通道活性。在這個實施方案中，在表達TRPV1的細胞中的溫度門控離子通道活性被用作代表TRPV1激活作用的參數(shù)。溫度門控離子通道活性可以是自發(fā)的或誘導(dǎo)的，如通過升高的溫度誘導(dǎo)的。減少TRPV1激活作用然后可測定為細胞的溫度門控離子通道活性的減少。

在一實施方案中，TRPV1激活作用使用腸系膜傳入神經(jīng)束實驗測定。因此，另一個可被測定的參數(shù)是自發(fā)的和/或例如通過辣椒堿、pH改變或熱誘導(dǎo)的腸系膜傳入神經(jīng)束的放電頻率。這種技術(shù)可被用來確定由待測的不同藥物誘導(dǎo)的腸系膜神經(jīng)纖維的興奮性變化。在一實施方案中，切除有或沒有含神經(jīng)束的腸系膜神經(jīng)叢(arcade)的胃腸段，得到由用于離體神經(jīng)束記錄的脊髓和迷走神經(jīng)纖維二者組成的段(見實施例1)。

在一些實施方案中，胃腸道的區(qū)域特異性具有重要性。用于本發(fā)明的腸系膜神經(jīng)分析方法的適宜段優(yōu)選地包括適宜的神經(jīng)束，以便能夠測量腸系膜傳入神經(jīng)放電。這可方便地由具有具有連接的腸系膜組織的胃腸段提供(見實施例1)。因此，這個實施方案便利地在得自適宜的實驗動物的離體段上，例如在小鼠胃腸段(例如小鼠結(jié)腸或空腸段)上進行。進行藥物對小腸對比大腸作用的比較的能力可能是有利的，特別是取決于待治療的腸運動障礙和臨床階段及其癥狀，區(qū)域特異性的、例如對小腸或大腸的任一個有特異性的治療可能是有益的。

在一實施方案中，對腸道的特異性和選擇性部分分析傳入性腸系膜神經(jīng)脊髓通信量。已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，不同的藥物，如乳酸菌，可影響或調(diào)節(jié)一部分胃腸道疼痛信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，但不影響或調(diào)節(jié)另一部分GI-道，所述影響或調(diào)節(jié)經(jīng)由不同的神經(jīng)途徑如迷走神經(jīng)或通過背根神經(jīng)節(jié)(對于內(nèi)臟疼痛)。

因此，在一實施方案中，該方法包括用待測的藥物接觸具有連接的腸系膜組織的離體胃腸段。該方法也包括在離體胃腸道段與待測的藥物接觸后，測定離體胃腸道段的自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的腸系膜傳入放電。該方法還包括比較自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的測量的腸系膜傳入放電與對照腸系膜傳入放電。在這個實施方案中，該方法還包括選擇待測的藥物作為有效減輕或預(yù)防胃腸道疼痛的藥物，如果測定的自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的腸系膜傳入放電低于對照腸系膜傳入放電的話。

對照腸系膜傳入放電可如在前述中所討論的，使用離體胃腸段作為內(nèi)部對照測定。在這樣的情況下，該方法包括在離體胃腸道段與待測的藥物接觸前，測定離體胃腸道段的自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的腸系膜傳入放電。該方法也包括在離體胃腸道段與待測的藥物接觸前，基于在離體胃腸道段測定的自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的腸系膜傳入放電，測定對照腸系膜傳入放電。

或者，可進行兩次平行的實驗。在它們之一中，使離體胃腸段與待測的藥物接觸，而在另一實驗，對照實驗中，離體胃腸段不與藥物接觸。自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的腸系膜傳入放電以兩個實驗測定并彼此比較。

分析以上這些參數(shù)的一個或多個將產(chǎn)生一種選擇有效減輕或預(yù)防胃腸道疼痛的藥物的方法。

在一特定的實施方案中，離體胃腸道段選自離體結(jié)腸或空腸段。在這樣的情況下，該方法包括使具有連接的腸系膜組織的離體結(jié)腸或空腸段與待測的藥物接觸。

分析自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1激活作用的適宜的方法和設(shè)備的實例在實施例和附圖中描述。

因此，在優(yōu)選的方法中，提出的分析將給出有關(guān)自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1激活作用的數(shù)據(jù)。分析這些參數(shù)的一個或多個將導(dǎo)致一種選擇有效減輕和/或預(yù)防胃腸道疼痛的藥物的優(yōu)選方法。

所述實施方案的方法因此可通過使用本文的模型，用來尋找適合于治療、預(yù)防和/或減輕胃腸道疼痛的藥物。

提出的方法將使用不同的模型，提供有關(guān)自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1激活作用的數(shù)據(jù)。分析這種參數(shù)將導(dǎo)致一種選擇有效減輕或預(yù)防胃腸道疼痛的藥物的方法。

在一實施方案中，該方法分析藥物對TRPV1激活作用(自發(fā)的和/或由例如辣椒堿、pH改變和/或熱誘導(dǎo)的及其由藥物預(yù)防的)的影響，因此可用作胃腸道疼痛信號傳導(dǎo)，即無論是否藥物可能具有對胃腸道疼痛，例如內(nèi)臟疼痛的作用的讀出。自發(fā)的或誘導(dǎo)的(例如通過辣椒堿、pH變化和/或熱) TRPV1活性的增加或沒有顯著的影響是可能分別導(dǎo)致胃腸道疼痛增加，或?qū)ξ改c道疼痛沒有顯著作用的藥物的指示，而自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的(例如通過辣椒堿、pH變化和/或熱) TRPV1活性的下降是將減輕胃腸道疼痛的藥物的指示。因此優(yōu)選的藥物是導(dǎo)致自發(fā)的和/或(例如由辣椒堿)誘導(dǎo)的TRPV1活性下降的那些。

在另一個實施方案中，該方法通過分析自發(fā)的和/或(例如通過辣椒堿、pH變化和/或熱)誘導(dǎo)的腸系膜傳入神經(jīng)放電(疼痛信號傳導(dǎo))，分析藥物對TRPV1活性的影響，因此可用作用于胃腸道疼痛，即是否藥物可能具有對胃腸道疼痛，例如內(nèi)臟疼痛的作用的讀出。對傳入神經(jīng)放電的增加或沒有顯著的影響是可能分別導(dǎo)致胃腸道疼痛增加，或?qū)ξ改c道疼痛沒有顯著作用的藥物的指示，而傳入神經(jīng)放電的下降是將減輕胃腸道疼痛的藥物的指示。因此優(yōu)選的藥物是導(dǎo)致傳入神經(jīng)放電減少，例如傳入神經(jīng)束的自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的放電頻率下降的那些。

以任何適宜的方式，將待測的藥物加入到用于TRPV1活性分析的選擇的系統(tǒng)中。為分析藥物對疼痛信號傳導(dǎo)的影響，所述方法便利地在藥物的存在和不存在下進行。例如，方法步驟在應(yīng)用藥物之前和之后進行。因此，在這樣的方法中，將藥物的效果與適宜的對照品比較，例如將在測試藥物的存在下的結(jié)果與在測試藥物的不存在下的結(jié)果比較，例如單用緩沖劑的結(jié)果與緩沖劑加藥物的結(jié)果比較。

本發(fā)明人已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，某些乳酸菌菌株，例如DSM 17938，可減少不同的離體和體外模型的TRPV1激活作用(見實施例1和2)。因此，在優(yōu)選的實施方案中，所述藥物是細菌菌株，更優(yōu)選乳酸菌。因此，所述實施方案的方法可有利地用來測試各種乳酸菌，以鑒定和選擇一個或多個有效減輕或預(yù)防受試者的胃腸道疼痛的乳酸菌菌株，如通過按照能夠減少自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1激活作用的方法確定的。

所述實施方案的另一個方面是通過所述實施方案的方法選擇，即通過選擇方法獲得的藥物。

一種優(yōu)選的藥物是微生物，更優(yōu)選細菌菌株，優(yōu)選乳酸菌，包括其部分或代謝物。

另一個優(yōu)選的藥物是來自這樣的微生物的條件培養(yǎng)物。

所述實施方案的一個相關(guān)方面定義通過實施方案的選擇方法獲得的、用于減輕或預(yù)防受試者的胃腸道疼痛的藥物。

在一特定的實施方案中，藥物通過所述實施方案的能夠減少自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的RPTV1激活作用的選擇方法獲得，用于減輕或預(yù)防受試者的胃腸道疼痛。

在一實施方案中，為減輕或預(yù)防胃腸道疼痛，將選擇優(yōu)選地發(fā)揮降低疼痛信號傳導(dǎo)的作用的藥物，如通過監(jiān)測藥物對自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1激活作用的影響所評價的。這樣一種藥物將優(yōu)選地用于減少或降低DRG神經(jīng)元，或其它TRPV1-表達的細胞或組織的TRPV1激活作用。優(yōu)選地，所述藥物將使用不同的體外系統(tǒng)或模型包括，但不限于如前討論的表達TRPV1受體的原代細胞和細胞系，發(fā)揮降低自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的(例如通過辣椒堿、pH變化和/或熱) TRPV1活性的作用。

在一實施方案中，將選擇優(yōu)選地用來減少或降低腸系膜傳入神經(jīng)束的TRPV1激活作用的藥物。藥物將起著減少自發(fā)的和/或(例如通過辣椒堿、pH變化和/或熱)誘導(dǎo)的腸系膜傳入神經(jīng)束的放電頻率的作用。

從以上清楚地知道，所述實施方案的方法也可用來選擇或鑒定不適合于治療胃腸道疼痛的藥物，例如對減少疼痛信號傳導(dǎo)不具有有益作用的藥物。特別是對該參數(shù)不顯示出作用的那些藥物不太可能適合于減輕或預(yù)防胃腸道疼痛。此外，具有增加疼痛信號傳導(dǎo)的作用的(如通過自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1活性的增加所測定的)那些藥物不太可能適合于減輕或預(yù)防胃腸道疼痛。

所述實施方案的進一步的方面涉及一種包含通過實施方案的方法選擇的藥物和至少一種另外的組分的組合物。因此至少一種另外的組分優(yōu)選地選自藥學(xué)上可接受的載體、藥學(xué)上可接受的稀釋劑、藥學(xué)上可接受的賦形劑、食品、食物補充劑和另一種預(yù)防劑或治療劑。

因此，一個實施方案涉及一種包含通過所述實施方案的選擇方法獲得的藥物和至少一種另外的組分的組合物，所述組分選自藥學(xué)上可接受的載體、藥學(xué)上可接受的稀釋劑、藥學(xué)上可接受的賦形劑、食品、食物補充劑和另一種預(yù)防劑或治療劑，用于減輕或預(yù)防受試者的胃腸道疼痛。

至少一種另外的組分可以與依據(jù)實施方案選擇的藥物一起給予或可分開給予。此外，至少一種另外的組分可在與依據(jù)實施方案選擇的藥物的相同時間或在不同的時間點給予。合適的給藥方案和時間選擇可通過技術(shù)人員根據(jù)提及的另外組分容易地確定。

在一實施方案中，至少一種另外的組分是任何適宜的營養(yǎng)成分，例如食物或食物補充劑。

在一實施方案中，另一種預(yù)防劑或治療劑可以是任何另外的藥物，其可用于預(yù)防或減輕，如治療所提及的胃腸道疼痛。

在另一個實施方案中，另一種預(yù)防劑或治療劑是能夠影響胃腸運動和/或混合的藥物。另一種預(yù)防劑或治療劑則優(yōu)選地能夠調(diào)節(jié)(增加或減輕，取決于待治療的病癥，如本領(lǐng)域已知的和以下描述的)胃腸運動和/或混合。

在一個進一步的實施方案中，所述實施方案的藥物可具有雙重功能，即具有對胃腸道疼痛和胃腸運動和/或混合的雙重功能。

依據(jù)本實施方案選擇的、具有有效減輕或預(yù)防胃腸道疼痛的目的的藥物也可經(jīng)受另一個或另外的、具有測定藥物在調(diào)節(jié)胃腸道運動和/或混合中是否是額外有效的目的的分析或選擇方法。這樣一種藥物對用來預(yù)防或治療例如運動障礙可能是有意義的，因為它解決了胃腸道疼痛和運動改變二者的結(jié)合。分析運動和/或混合的方式是本領(lǐng)域已知的。要分析的參數(shù)包括，但不限于，MMC頻率、MMC速度、管腔內(nèi)壓力如PPr和其它功能性模型。

在運動分析中，經(jīng)藥物誘導(dǎo)的胃腸運動的變化可例如被檢測為運動模式或收縮幅度的變化。一些藥物將沒有任何作用。可增加胃腸運動，例如通過增加MMC頻率和/或MMC速度和/或管腔內(nèi)壓力如PPr的藥物將可能用于治療與胃腸道疼痛有關(guān)的障礙如便秘和疝痛，其中增加沿消化管的推進運動將是有利的。

或者，如果例如，要治療的腸運動障礙是其中需要增加轉(zhuǎn)運材料通過腸的時間的障礙，例如涉及快速通道轉(zhuǎn)運的障礙，如IBS或腹瀉，則提及的藥物除了其對胃腸道疼痛調(diào)節(jié)的作用外，還將例如通過降低MMC頻率或MMC速度或管腔內(nèi)壓力，例如PPr，降低胃腸運動。優(yōu)選的藥物將降低至少MMC速度。優(yōu)選的藥物將降低這些參數(shù)的兩個或更多個，例如將降低MMC速度和MMC頻率或?qū)⒔档蚆MC頻率和管腔內(nèi)壓力(例如PPr)或?qū)⒔档蚆MC速度和管腔內(nèi)壓力(例如PPr)。最優(yōu)選的藥物將降低所有這些參數(shù)，例如將降低MMC頻率、MMC速度和管腔內(nèi)壓力(例如PPr)。運動分析可在來自小腸或大腸(例如對于小腸的空腸段或?qū)τ诖竽c的結(jié)腸段)的適宜的胃腸段上評價。在一些實施方案中，使用大腸(例如結(jié)腸)段是優(yōu)選的。

所述實施方案的進一步的方面涉及通過實施方案的方法選擇的藥物或如上定義的組合物，其用于減輕或預(yù)防受試者的胃腸道疼痛。

所述實施方案的一個相關(guān)方面定義通過實施方案的方法選擇的，例如通過依據(jù)實施方案的選擇方法可獲得的藥物，或如上定義的組合物在制備用于減輕或預(yù)防受試者的胃腸道疼痛的藥物、食物產(chǎn)品或食物補充劑產(chǎn)品中的用途。

所述實施方案的另一個相關(guān)方面定義一種減輕或預(yù)防受試者的胃腸道疼痛的方法。該方法包括給予受試者有效量的通過所述實施方案的方法選擇的，例如通過依據(jù)實施方案的選擇方法可獲得的藥物，或如上定義的組合物。

在這些方面的一實施方案中，所述藥物是細菌菌株，優(yōu)選乳酸菌菌株和更優(yōu)選路氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)菌株，如能夠減少自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1激活作用的菌株，優(yōu)選地能夠減少自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1激活作用的乳酸菌菌株和更優(yōu)選能夠減少自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1激活作用的路氏乳桿菌菌株。

在這些方面的一個實施方案中，所述藥物優(yōu)選地為路氏乳桿菌DSM 17938。在其它實施方案中，所述藥物是另一種乳酸菌菌株，即藥物是并非路氏乳桿菌DSM 17938的乳酸菌菌株，優(yōu)選并非路氏乳桿菌DSM 17938的路氏乳桿菌菌株。

在這些方面的一個實施方案中，所述藥物是一種來自細菌菌株，優(yōu)選地來自乳酸菌菌株和更優(yōu)選地來自路氏乳桿菌菌株的條件培養(yǎng)物，如來自能夠減少自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1激活作用的細菌菌株、優(yōu)選地來自能夠減少自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1激活作用的乳酸菌菌株和更優(yōu)選來自能夠減少自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1激活作用的路氏乳桿菌菌株的條件培養(yǎng)物。

在一實施方案中，所述藥物是來自乳酸菌菌株，優(yōu)選來自路氏乳桿菌DSM 17938或并非路氏乳桿菌DSM 17938的路氏乳桿菌菌株的條件培養(yǎng)物。用于這樣的條件培養(yǎng)物的培養(yǎng)基可以是適合于本領(lǐng)域已知的培養(yǎng)乳酸菌菌株的任何培養(yǎng)基。在一實施方案中，MRS (de Man, Rogosa & Sharpe)培養(yǎng)基被用作生產(chǎn)來自乳酸菌菌株，優(yōu)選來自路氏乳桿菌DSM 17938的條件培養(yǎng)物的起始原料。在本發(fā)明的一個實施方案中，來自乳酸菌菌株、優(yōu)選來自路氏乳桿菌DSM 17938的條件培養(yǎng)物，在被引入組合物或用作組合物之前被冷凍干燥。

在另一個實施方案中，來自乳酸菌菌株，優(yōu)選來自路氏乳桿菌DSM 17938的條件培養(yǎng)物的一個或多個組分，被分離并作為純化的和/或富含的組分，以合適的組合物形式給予受試者。這樣的組分的實例包括優(yōu)選地從乳酸菌菌株分泌到培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)、肽、酶和其它分子。也從乳酸菌菌株直接提取的這樣的組分可依據(jù)實施方案使用。

藥物或組合物的適宜的給藥模式和制劑，根據(jù)疾病的部位選擇。優(yōu)選的給藥模式是口服，然而，同樣對于一些治療而言，靜脈注射或肌肉注射將是適宜的。

藥物或組合物的適宜的劑量可容易地由技術(shù)人員根據(jù)待治療的障礙，給藥模式和有關(guān)的制劑選擇或確定。

在一個實施方案中，TRPV1受體被局部調(diào)節(jié)，例如通過采用經(jīng)口給予的、可選擇性地在具有胃腸道疼痛的受試者的GI道中調(diào)節(jié)TRPV1激活作用的乳酸細菌而被局部調(diào)節(jié)，從而最大限度地減少在所述受試者中的任何不利影響。相信這種優(yōu)選的給予藥物，特別是通過實施方案的方法選擇的乳酸菌菌株的途徑，將主要在局部，即在胃腸系統(tǒng)內(nèi)影響TRPV1激活作用。因此，藥物將具有預(yù)防或減輕胃腸道疼痛的有益作用，同時使在胃腸系統(tǒng)外的任何不需要的TRPV1調(diào)節(jié)最小化。

在本文描述的本實施方案的方法和用途中，術(shù)語"增加"、"降低"、"減少"等，指水平的可測量的變化，優(yōu)選水平的顯著變化，更優(yōu)選統(tǒng)計學(xué)意義的顯著變化，優(yōu)選具有≤0.05的概率值。

優(yōu)選的受試者是哺乳動物，更優(yōu)選是人。

當(dāng)待治療的與胃腸道疼痛有關(guān)的腸運動障礙是便秘時，則優(yōu)選的受試者是老年患者或孕婦。老年患者通常被理解為是年齡70或70以上的患者。

當(dāng)待治療的與胃腸道疼痛有關(guān)的腸運動障礙是疝痛時，優(yōu)選這是嬰兒疝痛。

依據(jù)所述實施方案的方法選擇的所述藥物，優(yōu)選乳酸菌菌株的用途包括減輕、預(yù)防或緩解相關(guān)障礙或障礙的癥狀(例如可導(dǎo)致疾病癥狀的調(diào)節(jié))。其障礙或癥狀的這樣的減輕、預(yù)防或緩解可通過任何適宜的分析法測定。

實施方案的一個目的是尋找藥物，如乳酸菌，包括其部分或代謝物，如存在于條件培養(yǎng)基中或從條件培養(yǎng)基中提取，其在例如特異性運動障礙和/或其它胃腸道疼痛障礙/疾病中，通過使用本文的基于藥物對自發(fā)的和/或誘導(dǎo)的TRPV1活性的作用，適合于治療、減輕、預(yù)防或調(diào)節(jié)胃腸道疼痛。

在一實施方案中，目的是選擇益生菌菌株，如乳酸菌菌株，其可有效預(yù)防或減輕與人(特別是老年受試者或孕婦)的便秘有關(guān)的胃腸道疼痛。

在一實施方案中，目的是選擇藥物，例如乳酸菌菌株，其可有效預(yù)防或減輕與嬰兒疝痛有關(guān)的胃腸道疼痛。

在一實施方案中，目的是選擇藥物，例如乳酸菌菌株，其可有效治療、預(yù)防或減輕腸易激綜合征(IBS)的胃腸道疼痛癥狀。

以下是實施方案的一些實施例，其并不意味著限制本文實施方案的用途，而是顯示出本發(fā)明可如何應(yīng)用的詳細的實踐實施例。實施例1涉及顯示DSM 17938抑制腸系膜神經(jīng)放電頻率的腸系膜神經(jīng)束實驗。實施例2顯示，DSM 17938阻斷DRG原代培養(yǎng)物中辣椒堿-誘導(dǎo)的鈣流入。實施例3證實DSM 17938抑制由胃脹誘導(dǎo)的心率減慢。

實施例

實施例1

腸系膜神經(jīng)束實驗

細胞外記錄

成年雄性Swiss Webster小鼠(20-30 g)得自Charles River Laboratories (Wilmington, MA)。通過頸椎脫位處死小鼠。所有隨后的程序都是離體的。

從剛處死的動物取出具有連接的腸系膜組織的遠端空腸段(~2.5 cm)并放在Sylgard-包被的陪替氏培養(yǎng)皿中，所述培養(yǎng)皿填充有用卡波金(carbogen) (95 % O₂ - 5 % CO₂)鼓泡通入的Krebs緩沖劑(單位mM)：118 NaCl、4.8 KCl、25 NaHCO₃、1.0 NaH₂PO₄、1.2 MgSO₄、11.1葡萄糖和2.5 CaCl₂。每段的口和肛門兩端插入塑料管并排空。將組織固定于Sylgard，并暴露腸系膜神經(jīng)束。將陪替氏培養(yǎng)皿放在倒置顯微鏡的鏡臺上并用氧處理的Krebs或含有添加劑的Krebs，以0.5-1 ml/min重力灌注腔(Perez-Burgos A., Wang B等., American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2013; 304: G211-20)。用預(yù)熱(34℃)的Krebs，以3-5 ml/min分別灌注漿膜室。神經(jīng)束被輕輕地吸到連接到膜片鉗電極夾持器的玻璃吸管中(CV-7B；Molecular Devices, Sunnyvale, CA)，和細胞外神經(jīng)記錄使用多夾具700B放大器和Digidata 1440A信號轉(zhuǎn)換器(Molecular Devices)進行。電信號以0.1-2 kHz帶通濾波，在20 kHz采樣，并存儲在運行pClamp 10軟件的個人計算機上(Molecular Devices)。重復(fù)擴張段通過提高腔內(nèi)壓力在2 hPa以上制得。將48 hPa的恒重力壓頭應(yīng)用于灌注腔的Krebs中并將通過關(guān)閉流出管1 min升高壓力至最多3個連續(xù)的拉伸。允許所述段在各拉伸之間放松9 min。組成性多單位電活動(Constitutive multiunit electrical activity)在腔內(nèi)正壓的不存在下記錄。

迷走神經(jīng)切斷術(shù)

膈下迷走神經(jīng)切斷術(shù)如前所述進行(van der Kleij H, O’Mahony C等. American journal of physiology Regulatory, integrative and comparative physiology 2008; 295: R1131-7)。使動物恢復(fù)10-14天，然后收獲空腸和腸系膜組織用于電生理實驗。在3只動物中進行假迷走神經(jīng)切斷術(shù)。手術(shù)后，每日測量小鼠的體重和一般健康狀況。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)沒有證據(jù)顯示在迷走神經(jīng)切斷的或者假-處理的動物中，手術(shù)后1周的體重增加有顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。在每次實驗后通過記錄對縮膽囊肽(CCK)的漿膜應(yīng)用的反應(yīng)，測試所有的迷走神經(jīng)切斷的小鼠的手術(shù)完整性。當(dāng)CCK不增加腸系膜神經(jīng)放電速率時，迷走神經(jīng)切斷術(shù)才被認為是有效的(Perez-Burgos A., Wang B等., American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2013;304:G211-20)。

藥物和細菌

DSM 17938由BioGaia AB (Stockholm, Sweden)捐贈，而鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosu) JB-1得自McMaster大學(xué)的Brian-Body Institute (安大略，加拿大)的儲備液。所有的程序都像以前報道的那樣(Kunze WA, Mao YK等., Journal of cellular and molecular medicine 2009; 13: 2261-70, Ma X, Mao YK等., American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2009; 296: G868-75, Wang B, Mao YK, FASEB雜志：美國實驗協(xié)會聯(lián)合會的官方出版物(FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology) 2010;24:4078-88)。細菌數(shù)經(jīng)光學(xué)測定，并檢查在生長培養(yǎng)基瓊脂平板平鋪后的生存能力。從冷凍的儲備液解凍細菌，以2000 rpm離心15 min，并使顆粒懸浮在Krebs中，再次離心并重懸浮。使用前，用Krebs將細菌稀釋至工作濃度?？s膽囊肽(25-33)硫酸鹽(CCK)從AnaSpec (Fremont, CA)獲得；尼卡地平、辣椒堿和6-碘代降二氫辣椒堿從Sigma-Aldrich獲得，和ω-芋螺毒素GVIA (ω-Cg-GVIA)和ω-芋螺毒素MVIIC (ω-Cg-MVIIC)從Alomone Labs (Jerusalem, Israel)獲得。使6-碘代降二氫辣椒堿和CCK溶于DMSO；使辣椒堿溶于乙醇以制備原液等分液。在實驗當(dāng)天，使等分液在Krebs中稀釋至具有最終DMSO和乙醇濃度分別為≤ 0.01 %和≤ 0.1 %的工作濃度。

離線數(shù)據(jù)分析

使用Clampfit 10.2 (Molecular Devices)和Origin 8.5 (Northampton, MA)軟件測量多-和單-單位自發(fā)的放電頻率。多-和單-單位棘波記錄通常被用來測定通過使腸道暴露于不同的刺激或藥物誘導(dǎo)的腸系膜神經(jīng)纖維放電速率的變化(Perez-Burgos A., Wang B等., American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2013; 304: G211-20)。多單位記錄中的棘波的時間使用Clampfit峰值檢測模塊確定，和平均放電頻率從棘波間的間隔計算。單-單位通過利用Clampfit的穗形模板檢測工具的穗形匹配(計算機波形分析)，從多單位信號提取。運行模板檢測算法后，單-單位棘波辨別總是通過目測檢查，而棄去未匹配的棘波事件(<0.2 %) (Perez-Burgos A., Wang B等., American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2013; 304: G211-20)。

統(tǒng)計學(xué)

數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±SE，而N 指從多單位記錄記錄的空腸段總數(shù)，和n 指從多單位記錄提取的單一纖維活動數(shù)。發(fā)明人從各多單位記錄提取最多6個單-單位。Wilcoxon或未配對t檢驗分別用于配對或未配對數(shù)據(jù)比較；合適時，采用單-向和雙向ANOVA與Bonferroni’s事后檢驗比較多組。因為自發(fā)活動的大的變化可在多單位神經(jīng)系統(tǒng)活動中的一個準(zhǔn)備和另一個之間發(fā)生，進行治療記錄前后比較的配對，其中每一個神經(jīng)束用作其自身對照，以保證在各治療或藥物劑量中的顯著變化。對以上基線頻率對比辣椒堿濃度(在細菌的存在或不存在下)放電增加的百分率作圖并用邏輯的劑量-反應(yīng)方程[Y = 底 + (頂 – 底/1 + 10^LogEC50-X)]擬合。描述邏輯擬合的參數(shù)使用額外的平方和F檢驗進行比較。所有的統(tǒng)計學(xué)檢驗使用Prism軟件5.0 (GraphPad software, San Diego, CA)進行。

DSM 17938對腸系膜神經(jīng)自發(fā)的放電頻率的影響

內(nèi)腔DSM 17938影響腸系膜神經(jīng)的自發(fā)性多單位放電(Perez-Burgos A., Wang B等., American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2013; 304: G211-20)。1x10⁹ cfu/ml管腔內(nèi)DSM 17938引起自發(fā)的多單位放電頻率降低22 %，即從36.3 ± 8.4降至28.2 ± 7.2 Hz (N = 7, P = 0.02, 圖1A)；DSM 17938在1x10⁸ cfu/ml時自發(fā)性放電變化19 %，即從21.6 ± 5.1降至17.6 ± 6 Hz (N = 6, P = 0.09, 圖1B)。DSM 17938條件培養(yǎng)物(1:5)也降低自發(fā)性放電37 %，即從22.6 ± 4.2降至14.17 ± 2.4 Hz (N= 7, P= 0.03, 圖1C)。然而，γ–輻照的殺死的DSM 17938或肉湯單獨并沒有降低傳入興奮性：分別從17.84 ± 5.3至18.25 ± 4.1 Hz (N= 6, P= 0.84)，和從20.48 ± 1.6至21.49 ± 2.8 Hz (N= 6, P= 0.10) (圖1D-E)。

迷走神經(jīng)切斷術(shù)和肌肉麻痹不抑制由DSM 17938減少的腸系膜神經(jīng)自發(fā)放電

發(fā)明人研究了DSM 17938 1x10⁹ cfu/ml對自發(fā)性放電的影響是否被之前的迷走神經(jīng)切斷術(shù)廢止。為控制DSM 17938對平滑肌細胞的可能的直接作用，發(fā)明人在此和在所有的自發(fā)性放電的后續(xù)實驗中加入L-型Ca²⁺通道阻斷劑尼卡地平(3μM)，其抑制肌肉收縮。因此，在迷走神經(jīng)切斷術(shù)和加入尼卡地平后，DSM 17938減少多單位放電頻率達18 %，即從16.72 ± 1.9降至13.77 ± 1.9 Hz (N = 17, P = 0.001, 圖2A, 2C)。然后就單-單位放電速率分析來自迷走神經(jīng)切斷的動物和麻痹的肌肉的數(shù)據(jù)。DSM 17938減少單-單位放電頻率達19 %，即從0.36 ± 0.05降至0.29 ± 0.03 Hz (n = 30, P = 0.02, 圖2B, 2C)；在這些纖維中，大多數(shù)(20/30)顯示出36 %頻率的降低，即從0.42 ± 0.06降至0.27 ± 0.04 Hz (P < 0.0001)，但較小部分的剩余纖維增加它們的放電速率達29 %，即從0.24 ± 0.04增加至0.31 ± 0.06 Hz (n = 10/30, P = 0.006)。

DSM 17938通過TRPV1受體的不可克服的部分拮抗作用，減少脊髓單-單位放電頻率和對辣椒堿的應(yīng)答

發(fā)明人檢驗DSM 17938是否可在從先前迷走神經(jīng)切斷的小鼠取出的組織中，修改辣椒堿-誘導(dǎo)的對單-單位激發(fā)的放電頻率增加。應(yīng)用于漿膜室的辣椒堿以劑量依賴的方式增加自發(fā)的多-和單-單位放電速率，伴有~60秒的起始潛伏期。鑒于TRPV1辣椒堿敏感的受體脫敏，和激動劑的后續(xù)應(yīng)用可能會引起減少的作用，發(fā)明人檢查各空腸段對一系列辣椒堿劑量(100 nM-100μM)的應(yīng)答。發(fā)明人在腔內(nèi)應(yīng)用DSM 17938 1x10⁹ cfu/ml (對于每條曲線N=25，5段/每一濃度；對每一段分析~6個脊髓單-單位)之前20 min這樣做或不在之前20 min這樣做。對放電頻率對比辣椒堿濃度或辣椒堿加DSM 17938濃度的百分比增加作圖并用形式Y =底 + (頂-底)/(1+10^LogEC50-X)的3-參數(shù)邏輯方程擬合。對于單獨辣椒堿的EC50是200 nM，與之對比的是在DSM 17938的存在下，對于辣椒堿的EC50是500 nM (P = 0.71)。用辣椒堿獲得的最大應(yīng)答(頂)是238.4 ± 27.5 %，而與之對比的是用辣椒堿加DSM 17938獲得的應(yīng)答是129 ± 17 % (P = 0.004, 圖3A)。與以前的報告一致，一些脊髓纖維不被辣椒堿激發(fā)。發(fā)明人檢驗了辣椒堿是否直接激發(fā)脊髓纖維，或激發(fā)是否取決于從腸神經(jīng)元至神經(jīng)節(jié)內(nèi)脊髓末梢的壁內(nèi)突觸傳遞。在通過加入各500 nM的Ca²⁺阻斷劑ω-Cg-GVIA和ω-Cg-MVIIC，阻斷壁內(nèi)突觸傳遞后，發(fā)明人將1μM辣椒堿加入漿膜室。壁內(nèi)突觸阻斷沒有減少辣椒堿-誘導(dǎo)的激發(fā)，其在芋螺毒素的不存在下是187.5 ± 42.9 % (n = 17)，而在它們的存在下是219.1 ± 72.6 (n = 12) (P = 0.947, 圖3B)。發(fā)明人得出結(jié)論是DSM 17938對脊髓傳入神經(jīng)的作用不涉及壁內(nèi)的突觸傳遞。

含DSM 17938細菌釋放產(chǎn)物的DSM 17938條件培養(yǎng)物的效果減少辣椒堿對脊髓纖維的作用

發(fā)明人檢驗了DSM 17938細菌產(chǎn)物是否構(gòu)成對腸系膜傳入神經(jīng)的TRPV1拮抗作用的基礎(chǔ)。鑒于DSM 17938-誘導(dǎo)的減少自發(fā)放電頻率的百分比在有和沒有前述迷走神經(jīng)切斷術(shù)的情況下是非常類似的(分別為18 %對比22 %)，在腸系膜傳入神經(jīng)中的DSM 17938靶主要是脊髓纖維；然后，發(fā)明人應(yīng)用1 μM辣椒堿于非-迷走神經(jīng)切斷的腸系膜纖維，其接收先前的DSM 17938條件培養(yǎng)物的腔內(nèi)應(yīng)用20 min。DSM 17938條件培養(yǎng)物(1:5)抑制辣椒堿-誘導(dǎo)的對腸系膜單一纖維的放電頻率增加(%)，即從187.5 ± 43 % (對照組，N= 17)至74.89 ± 22 % (N= 14)，并類似于用1×10⁹ cfu/ml DSM 17938處理的、在脊髓纖維上由辣椒堿誘導(dǎo)的百分比增加(80.29 ± 22 %, N= 17) (P= 0.02, 單向ANOVA檢驗；圖7)。

DSM 17938或TRPV1拮抗作用減少膨脹-誘導(dǎo)的放電

在使肌肉收縮的尼卡地平的不存在下，發(fā)明人記錄了被認為是傷害感受器的纖維的多-和單-單位放電頻率(Grundy D, Gut 2004; 53 Suppl 2: ii5-8)。發(fā)明人檢驗了DSM 17938是否可減少通過提高腔內(nèi)壓力至傷害感受強度48 hPa (36 mmHg)誘導(dǎo)的它們的興奮性應(yīng)答(Perez-Burgos A., Wang B等., American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2013; 304: G211-20)。這些纖維對腸道膨脹的首次反應(yīng)通常高于隨后膨脹獲得的反應(yīng)，但對至多3次另外的膨脹維持穩(wěn)定(Perez-Burgos A., Wang B等., American journal of physiology Gastrointestinal and liver physiology 2013; 304: G211-20)。因此，發(fā)明人使用3個連續(xù)膨脹的第二個用于比較。在膨脹期間多單位放電是111.5 ± 16.7 Hz，但加入DSM 17938 20 min后，膨脹增加放電至僅僅86.5 ± 10.6 Hz (N = 5, P = 0.31)。在膨脹期間脊髓單-單位放電頻率是3.01 ± 0.44 Hz，但在DSM 17938的存在下，在膨脹期間放電是1.71 ± 0.16 (n = 28, P = 0.008, 圖4A)。對于對照對比加入的DSM 17938，前-膨脹放電頻率是0.31 ± 0.05對比0.25 ± 0.07 Hz (n = 28, P = 0.053, 圖4A)。TRPV1拮抗劑6-碘代降二氫辣椒堿(10μM)通過降低對膨脹的應(yīng)答從3.26 ± 0.73至2.23 ± 0.50 Hz，模擬DSM 17938對單-單位應(yīng)答的影響(n = 13, P = 0.0002, Wilcoxon檢驗, 圖4B，在尼卡地平的不存在下)。

實施例2

DSM 17938阻斷在DRG神經(jīng)元原代培養(yǎng)物中由辣椒堿誘導(dǎo)的Ca²⁺升高

背根神經(jīng)節(jié)(DRG)原代培養(yǎng)物

從身體移出脊柱，轉(zhuǎn)移至含有冰冷的Krebs的燒杯中，并縱向切成兩半。暴露DRG并從胸腰椎水平收集。全部DRG用無菌Leibovitz’s L-15培養(yǎng)基(GIBCO, Gaithersburg, MD)洗滌兩次，并在1型膠原酶(按1 mg/ml) (Sigma-Aldrich；Oakville, ON, Canada)和0.5 ml胰蛋白酶(0.25 %, GIBCO)的20 ml L-15中于37℃溫育40 min。在進一步加入含10 %胎牛血清的5 ml L-15 (FBS, GIBCO)后，將神經(jīng)節(jié)(ganglia)以1,000 rpm離心5 min，然后用生長培養(yǎng)基(L-15, 含10 % FBS、1 %青霉素/鏈霉素/谷氨酰胺、1 % HEPES和1 %丙酮酸鈉)洗滌兩次。將DRG放在2 ml生長培養(yǎng)基中并研磨10次。然后將神經(jīng)節(jié)以500 rpm離心10 s并將上清液轉(zhuǎn)移至無菌管中。使它們再懸浮于2 ml生長培養(yǎng)基中，重復(fù)研磨直至轉(zhuǎn)移的上清液體積是10 ml，以1,000 rpm離心5 min，并使最終的沉淀再懸浮于3 ml生長培養(yǎng)基中。將神經(jīng)元平鋪到3塊涂布有聚-d-賴氨酸的玻璃底陪替氏培養(yǎng)皿(MatTek, Ashland, MA)上。在30 min后，將另外1.5 ml生長培養(yǎng)基加入到各培養(yǎng)皿中并全部于37℃用卡波金(carbogen)培養(yǎng)24 h。

Ca²⁺成像

于37℃，將DRG神經(jīng)元放置在一個有機玻璃的記錄培養(yǎng)皿中并裝載在Krebs中用0.1 %普流羅尼克酸(pluronic acid) (在DMSO中)稀釋的Ca²⁺指示劑Fluo-4-AM (8μM) 60 min。將培養(yǎng)皿放進記錄室并用新鮮的Krebs (~34℃)灌注15 min以使染料被洗掉。細胞在倒置顯微鏡(Nikon eclipse TE 2000-S, Melville, NY)下觀察并使用Rolera-XR照相機(Surrey, BC, Canada)成像。各神經(jīng)元中的熒光強度通過簡單PCI 6軟件(Compix Inc, Imaging systems, Sewickley, PA)記錄。經(jīng)由附接于電子控制壓力脈沖發(fā)出器的微吸液管(Picospritzer II；General Valve, Fairfield, NJ) (自細胞的尖嘴<100μm)遞送藥物。圖像，以0.9幀/秒記錄，存儲在本地硬盤驅(qū)動器上。使用圖像J軟件(NIH, USA, http://imagej.nih.gov/ij)，離線分析圖像文件。當(dāng)應(yīng)用辣椒堿時，F(xiàn)luo-4 Ca²⁺的增加被測定為在辣椒堿之后(F)的熒光強度除以辣椒堿之前(F₀)的強度的比率(F/F₀)。細菌和藥物如在實施例1中所述處理。

結(jié)果

通過檢測細菌抑制TRPV1受體激動劑辣椒堿的反應(yīng)的能力，進一步研究DSM 17938對脊髓神經(jīng)元的作用的特異性。在這些實驗中，也包括JB-1。JB-1 (鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus))先前已顯示減輕疼痛和由胃脹誘導(dǎo)的DRG單一纖維的放電(Duncker等.，Journal of Nutrition 2011)。因為TRPV1通道的開放升高細胞內(nèi)Ca²⁺濃度，發(fā)明人使用DRG神經(jīng)元原代培養(yǎng)物的Ca²⁺成像用于這些實驗。在~30 s內(nèi)，將1μM辣椒堿噴到DRG神經(jīng)元誘導(dǎo)細胞內(nèi)Ca²⁺的增加(圖5A)。因為TRPV1通道可用反復(fù)的配體暴露來脫敏，發(fā)明人僅應(yīng)用辣椒堿于各培養(yǎng)皿一次。發(fā)明人在應(yīng)用辣椒堿之前30 min加入DSM 17938或者JB-1。1x10⁹ cfu/ml的DSM 17938降低熒光升高率從2.36 ± 0.31 (對照組，N = 14)至1.25 ± 0.04 F/F₀。但1x10⁸ cfu/ml DSM 17938改變F/F₀至2.67 ± 0.35和1x10^8.5cfu/ml DSM 17938改變F/F₀至2.07 ± 0.27。加入1×10⁹ cfu/ml的JB-1具有極少的作用并改變F/F0比率至2.48 ± 0.19 (N= 9)，其類似于用辣椒堿單獨獲得的比率(圖5B)。這些結(jié)果證實，DSM 17938可阻斷由辣椒堿誘導(dǎo)的在DRG神經(jīng)元原代培養(yǎng)物中的Ca²⁺升高。

實施例3

DSM 17938抑制由胃脹誘導(dǎo)的心率減慢

將總共17只大鼠分配到2個組。一旦到達，使大鼠適應(yīng)1周，接著處理1周(10 min/d)，以在實驗期間盡量減少緊張效應(yīng)。用在Krebs中的0.2 ml (1x10⁹ cfu/ml)活DSM 17938或者僅用作為對照(媒介)的Krebs，于每天早晨管飼大鼠9天。用于GD的方法先前已經(jīng)公開(Tougas, Wang, American Journal of Physiology 1999;277:R272-8)。簡言之，使大鼠禁食過夜，用鹽酸氯胺酮(ketamine hydrochloride) (75 mg/kg體重)和甲苯噻嗪(xylazine) (10 mg/kg體重)的混合物經(jīng)腹膜內(nèi)給予麻醉。必要時給予補充麻醉。中線剖腹術(shù)后，由一個附接于聚四氟乙烯導(dǎo)管(20 cm)的球形胃氣球(2-cm i.d.)組成的膨脹裝置通過十二指腸近端的小切口被插入到胃中并連接到恒壓系統(tǒng)(Distender, G&J Electronic, Toronto, Canada)。測定心響應(yīng)，同時用空氣充氣氣球至40和60 mm Hg壓力達60秒。每次膨脹后允許10分鐘的休息以便恢復(fù)。只有一套膨脹應(yīng)用于每只大鼠，以避免可能的補償機制并在獲得意識之前，經(jīng)測量后處死大鼠。通過由施加于左和右肩和右后腿的3針電極組成的體表心電圖進行心率的連續(xù)記錄。將信號放大，并使用商業(yè)數(shù)據(jù)采集程序(Experimenter’s Workbench, DataWave Technologies, Loveland, CO)記錄在個人電腦上。在每次膨脹之前、期間和之后測定心率60 s，總共180 s。由于水平麻醉的變化，在每次膨脹前允許校正心率(HR)記錄的可能的基線變化，并確保任何心率響應(yīng)都可能與膨脹有關(guān)。為控制GD隨著時間推移的效果，數(shù)據(jù)被表示為使用在膨脹期間10 s (10、20、30、40、50和60 s)時間段記錄的平均HR，從靜息HR (100 % =靜息)獲得的平均變化。在每次膨脹(40和60 mm Hg)的60 s期間，使用在相同組的所有大鼠中的平均HR改變(靜息HR的百分率)比較各組。細菌和藥物如在實施例1中所述處理。

結(jié)果

由40 mm Hg誘導(dǎo)的心率降低不受管飼DSM 17938的改變(P = 0.121, 圖6A) (N = 8和9，分別用媒介和DSM 17938)。具有60 mm Hg的膨脹在10 s內(nèi)降低心率，這在膨脹期間持續(xù)30 s (圖6B)。在檢測之前用DSM 17938管飼9 d調(diào)節(jié)響應(yīng)至60 mm Hg (P = 0.028，未配對t-檢驗，圖6A, 6B)。對于胃脹壓力為40或60 mm Hg，在用媒介或DSM 17938處理的動物之間，胃依從性(容量/壓力)沒有不同(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果證實通過細菌的抗傷害感受作用。