本發(fā)明涉及臨床體外檢測試劑
技術(shù)領域：
，特別涉及到血清中總膽紅素通過亞硝酸鈉法（氧化法）進行檢測診斷其含量。
背景技術(shù)：
：膽紅素包含游離膽紅素和直接膽紅素兩種：直接膽紅素又可稱為結(jié)合膽紅素，即血液中游離膽紅素運輸?shù)礁闻K后，迅速被肝細胞攝取，膽紅素在肝細胞胞漿中主要與Y蛋白和Z蛋白結(jié)合（以Y蛋白為主）。然后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中結(jié)合葡萄糖醛酸生成水溶性結(jié)合膽紅素；游離膽紅素亦可以成為未結(jié)合膽紅素，即沒有與葡萄糖醛酸結(jié)合，未結(jié)合的膽紅素主要是血紅素在單核吞噬系統(tǒng)細胞微粒體血紅素加氧酶的作用催化下，形成線性四吡咯的水溶性膽綠素，膽綠素進一步在細胞液中活性較強的膽綠素還原酶作用催化下，還原成膽紅素。目前對于直接膽紅素的檢測診斷方法有很多種，重氮法、高效液相色譜法（HPLC）、氧化酶法、釩酸鹽法等。重氮法是歷史最久，目前為止應用較廣的方法，但是該方法測定直接膽紅素時受到多種因素影響，結(jié)果差異性較大；高效液相色譜法（HPLC）對儀器和設備要求較高，因此不能作為常規(guī)方法使用；氧化酶法靈敏度高，抗干擾能力不是很強，主要是由于酶對溫度要求極高，活性只能在一定溫度范圍內(nèi)才能發(fā)揮最佳作用，而且該種方法試劑價格極高難于推廣；釩酸鹽法是上世紀90年代由日本學者提出的一種新型的氧化方法，但是該方法對儀器損傷較大，釩酸鹽的氧化性高于高錳酸鉀，也不利于保存鑒于以上因素，發(fā)明了一種新型的亞硝酸鈉法（氧化法）檢測試劑盒。該方法是在十幾中氧化劑中篩選出的一種高效的氧化劑。亞硝酸鈉法原理在于在適合的緩沖液中加入特定的加速劑，使得血清中膽紅素被反應介質(zhì)中新生成的亞硝酸氧化成淡綠色化合物，進而引起吸光度發(fā)生變化。通過計算得出總膽紅素在血清中的含量。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供一種亞硝酸鈉法氧化檢測試劑盒，其特點在于本發(fā)明試劑盒，檢測線性范圍較寬，穩(wěn)定性強，重復性好等?；驹砟懠t素經(jīng)檸檬酸緩沖液孵育后，被反應介質(zhì)中生成的亞硝酸氧化為淡綠色的的化合物，在450nm波長下，通過吸光度變化來檢測溶液的顏色變化，進而確定血清中膽紅素的含量，血清中膽紅素含量與吸光度變化成一定比例關(guān)系，反應液中顏色和膽紅素含量成線性關(guān)系：應用本發(fā)明改良的亞硝酸鈉（氧化法）法檢測診斷試劑盒測定血清中膽紅素含量方法如下：檢測波長為450nm，樣本量:試劑R1:試劑R2=9:240:60。本發(fā)明是一種改良的亞硝酸鈉法（氧化法）體外檢測診斷試劑盒，是由試劑R1和R2組成的雙試劑液體型檢測診斷試劑盒，其中試劑R1組成為：檸檬酸緩沖液0.1-0.2mol/L(pH2.8-3.1)十六烷基三甲基溴化銨1-5mmol/LEDTA1-10mmol/LTritonX-1000.25-1ml/L疊氮鈉0.01-0.1g/L羥基乙叉二磷酸5-10mmol/L氯化鈉0.9g/L丙三醇10-20%試劑R2組成為：亞硝酸鈉4-10mmol/L磷酸緩沖液10mmol/L（pH7.0-7.5）EDTA-Na20.5g/L碳酸鈉0.1-0.5g/LTritonX-1000.25-1ml/L疊氮鈉0.01-0.1g/L羥基乙叉二磷酸5-10mmol/L氯化鈉0.9g/L甘露醇0.1-2g/L本發(fā)明改良的亞硝酸法（氧化法）體外檢測診斷試劑盒，試劑R1和試劑R2的選擇依據(jù)是：0.1-0.2mol/L(pH2.8-3.1)檸檬酸緩沖液形成一個具有一定緩沖能力的內(nèi)部環(huán)境，正是由于這個緩沖液的緩沖能力，致使試劑R2的加入對內(nèi)部的的pH值產(chǎn)生較弱的影響，保證檢測結(jié)果的準確性，如果pH值低于2.5，膽紅素中的直接膽紅素在孵育時即能發(fā)生反應，影響結(jié)果判斷，如果pH值高于3.5之上，不利于氧化反應的進行。因此本發(fā)明控制反應pH值在2.8-3.2左右。十六烷基三甲基溴化銨是一種陽離子去污劑，起到去除干擾的作用，保證檢測結(jié)果的準確性。EDTA及其鈉鹽是一種螯合劑，它可以與樣本中二價金屬離子結(jié)合形成絡合物，降低樣本中的膽紅素被氧化的機率。TritonX-100表面活性劑，不但促進樣本中各物質(zhì)的溶解，增大溶解性，減少樣本脂溶性物質(zhì)對測定結(jié)果產(chǎn)生影響，而且能夠促進膽紅素與亞硝酸鈉反應。氯化鈉，增強溶液的離子強度，產(chǎn)生原鹽效應，加快反應速率。羥基乙叉二磷酸作為一種水質(zhì)穩(wěn)定劑，增強溶液儲存時的穩(wěn)定性。疊氮鈉作為防腐劑，防止試劑在儲存過稱重腐敗變質(zhì)，影響檢測效果。磷酸鹽緩沖對，保證反應pH值不會受到較大波動，穩(wěn)定試劑R2中的氧化劑的穩(wěn)定性。碳酸鈉作為水溶性的碳酸鹽，適當?shù)脑黾恿巳芤褐蠧O32-和HCO31-的濃度，從而抑制空氣中CO2對溶液pH值產(chǎn)生波動，提高檢測準確性。甘露醇和丙三醇作為保護劑和穩(wěn)定劑，在很大程度上保證了試劑不受低溫與高溫破壞。本發(fā)明可以應用到迪瑞、邁瑞、日立、東芝等系列的全自動化分析儀中進行自動化檢測。應用本發(fā)明進行體外樣本診斷檢測時，設定波長為450nm，將吸取的樣本與反應杯中，然后加上試劑R1進行孵育。試劑R1中的表面活性劑TritonX-100促進物質(zhì)溶解，EDTA螯合樣本中的二價金屬離子，十六萬級溴化銨去除雜質(zhì)離子保證后續(xù)反應正常進行，檸檬酸緩沖液提供具有穩(wěn)定pH值的反應環(huán)境。加入試劑R2時，亞硝酸鈉首先反應生產(chǎn)亞硝酸，亞硝酸進而將樣本中的膽紅素氧化為淡綠色的化合物，繼而引起450nm波長下的吸光度變化。通過計算吸光度變化求出樣本中膽紅素的含量。本發(fā)明是一種改良的亞硝酸鈉法（氧化法）體外診斷檢測試劑盒，測定方法如下所述：樣本樣品（或者是朗道質(zhì)控品1005UN），朗道復合校準品938UN作為校準品，樣本中加入R1試劑孵育5min，充分混勻然后讀取此時的吸光度A1，加入試劑R2，37℃反應5min然后讀取此時的吸光度R2，計算ΔA，根據(jù)公式：直接膽紅素的含量=吸光度（A2-A1）*標準液濃度其中樣本用量9μL，試劑R1為240-270μL，試劑R2為40-60μL。和市場上目前流通的直接膽紅素檢測試劑盒相比，本發(fā)明的試劑盒，對于0-700μM范圍內(nèi)樣本的測量準確度較好，精密度高，重復性好，抗干擾能力強，試劑穩(wěn)定性較好，適用于全自動生化分析儀，臨床使用價值較大。附圖說明圖1本發(fā)明試劑盒與對比試劑盒相關(guān)性。具體實施方式以下結(jié)合表，實施例對本發(fā)明進行說明實施例1本發(fā)明在具體實施中，所述的試劑R1為：檸檬酸緩沖液0.1mol/L（pH2.8）TritonX-1000.3ml/LEDTA1mmol/L十六烷基三甲基溴化銨3mmol/L羥基乙叉二膦酸10mmol/L氯化鈉9g/L疊氮鈉0.05g/L丙三醇10%試劑R2為：亞硝酸鈉4mmol/L磷酸緩沖液10mmol/L（pH7.0-7.5）EDTA-Na20.5g/L碳酸鈉0.5g/LTritonX-1001ml/L疊氮鈉0.05g/L羥基乙叉二磷酸10mmol/L氯化鈉0.9g/L甘露醇2g/L實施例2試劑R1為：檸檬酸緩沖液0.2mol/L（pH2.8）TritonX-1000.5ml/LEDTA1mmol/L十六烷基三甲基溴化銨5mmol/L羥基乙叉二膦酸10mmol/L氯化鈉9g/L疊氮鈉0.05g/L丙三醇10%試劑R2為：亞硝酸鈉7mmol/L磷酸緩沖液10mmol/L（pH7.2）EDTA-Na20.5g/L碳酸鈉0.5g/LTritonX-1001ml/L疊氮鈉0.05g/L羥基乙叉二磷酸10mmol/L氯化鈉0.9g/L甘露醇1.5g/L實施例3試劑R1為：檸檬酸緩沖液0.2mol/L（pH3.0）TritonX-1000.4ml/LEDTA1mmol/L羥基乙叉二膦酸10mmol/L氯化鈉9g/L疊氮鈉0.05g/L丙三醇15%試劑R2為：亞硝酸鈉10mmol/L磷酸緩沖液10mmol/L（pH7.0）EDTA-Na20.5g/L碳酸鈉0.5g/LTritonX-1001ml/L疊氮鈉0.05g/L羥基乙叉二磷酸10mmol/L氯化鈉0.9g/L甘露醇1.0g/L本發(fā)明試劑盒性能檢測試驗：重復性實驗用本發(fā)明試劑盒與市場上流通的氧化法檢測試劑盒進行對比，以朗道938UN為校準品進行校準，朗道1005UN質(zhì)控品作為樣本進行重復性檢測，使用儀器為全自動生化分析儀BS-800。本發(fā)明試劑盒采用實施例1配方進行配制。結(jié)果如表1所示：表1為本發(fā)明試劑盒與對比試劑盒重復性比較從表1以看出，本發(fā)明試劑盒的準確度較高線性范圍實驗從蘇州亞科公司購買膽紅素純品，用三氯甲烷溶解膽紅素純品配制成800μmol/L的膽紅素純品，用三氯甲烷等倍稀釋成0、100、200、400、800μmol/L的膽紅素樣本，分別用本發(fā)明試劑盒和市場上流通的某一國內(nèi)試劑盒進行對比，本發(fā)明試劑盒采用實施例2配方進行配置，使用儀器為全自動生化分析儀BS-800。結(jié)果如表2所示：表2本發(fā)明與對比試劑盒線性實驗結(jié)果理論值（μmol/L）0100200400800本發(fā)明試劑盒（μmol/L）0.09100.4203.2410.8760.6對比試劑盒（μmol/L）0.1100.7199.6412.2680.5從表2中看出，本發(fā)明試劑盒線性范圍為0-760μmol/L，比對比試劑盒高出11.78%。當樣本中直接膽紅素的量高于700μmol/L之后，對比試劑盒不能有效的檢測其濃度，線性范圍較小。由此可以看出本發(fā)明試劑盒有著較大的線性范圍測試空間。臨床樣本檢測實驗本發(fā)明試劑盒同對比試劑盒對隨進N=40個樣本進行測試，測試結(jié)果以表格的形式在下表進行體現(xiàn)，通過該表格3錄的數(shù)值，進而計算出，本發(fā)明試劑盒與市場流通的試劑盒的相關(guān)性。本發(fā)明試劑盒采用實施例2配方進行配置，檢測結(jié)果如表3所示：表3為本發(fā)明試劑盒與對比試劑盒臨床檢測相關(guān)實驗結(jié)果結(jié)合表3和附圖1說明本發(fā)明試劑盒和對比試劑盒相關(guān)性r=0.995741。準確度實驗采用朗道復合紙空品（680UE）進行準確度檢測，結(jié)果如表4所示：從表中可以明顯看出，本發(fā)明試劑盒的準確度明顯高于對比試劑盒。本發(fā)明試劑盒采用實施例2配方，對照試劑盒為市場流通氧化法總膽紅素檢測試劑盒。檢測結(jié)果如表4所示：表4本發(fā)明試劑盒與對比試劑盒準確度比較由表4可以看出本發(fā)明試劑盒的準確度較對比試劑盒偏高。穩(wěn)定性實驗購買市場上流通的總膽紅素檢測試劑盒與本發(fā)明試劑盒進行比較,組要是比較二者在不同溫度條件下儲存一定時間后是否受到影響。本發(fā)明試劑盒采用實施例3的配方進行配制。使用儀器為全自動生化分析儀BS-800，檢測結(jié)果如表5所示：表5不同溫度條件對本發(fā)明試劑盒與對照試劑盒影響通過表5可以明顯的看出，本發(fā)明試劑盒和對照試劑盒在低溫條件下都可以在保證檢測結(jié)果準確的前提下儲存很長時間，但是在37℃和75℃條件下，本發(fā)明試劑盒優(yōu)于對照試劑盒。高溫條件下15天以內(nèi)本發(fā)明試劑盒是不會對檢測結(jié)果產(chǎn)生偏差和影響的，37℃條件下本發(fā)明試劑盒在一個月內(nèi)是不會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響；與對照試劑相比優(yōu)勢更加明顯。但是不得不說明高溫條件對試劑的破壞性較強，應避免試劑長時間暴露于高溫條件下。綜上所述本發(fā)明試劑盒——改良的亞硝酸鈉（氧化法）法體外檢測診斷試劑盒在氧化法膽紅素檢測試劑盒的方法學進一步完善。擴大了其線性范圍，試劑長期穩(wěn)定，成本較低，對儀器不會產(chǎn)生腐蝕影響，操作方便，對環(huán)境幾乎沒有污染，可行性強，經(jīng)濟和社會效益巨大，是測定總膽紅素試劑上的一種創(chuàng)新。當前第1頁1 2 3