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肝癌磷蛋白組學(xué)模型及其構(gòu)建方法和應(yīng)用與流程

文檔序號(hào):11946155閱讀:來(lái)源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.一種肝癌磷蛋白組學(xué)模型的構(gòu)建方法,其特征在于,包括如下步驟:

步驟S1,分別提取肝臟癌變組織細(xì)胞和相應(yīng)的癌旁組織細(xì)胞的總蛋白,得到兩組蛋白樣本;

步驟S2,分別對(duì)所述兩組蛋白樣本進(jìn)行還原烷基化處理,得到兩組蛋白樣本溶液;

步驟S3,分別向兩組蛋白樣本溶液中加入胰蛋白酶進(jìn)行酶解處理,得到兩組肽段樣本;

步驟S4,將每組肽段樣本分成兩份,得到兩份樣本,對(duì)其中一份的含有肝臟癌變組織細(xì)胞的肽段樣本和相應(yīng)的癌旁組織細(xì)胞的肽段樣本分別使用不同的標(biāo)記試劑進(jìn)行iTRAQ標(biāo)記處理,并將標(biāo)記處理后的兩組肽段樣本混合;對(duì)其中另一份的含有肝臟癌變組織細(xì)胞的肽段樣本和相應(yīng)的癌旁組織細(xì)胞的肽段樣本分別富集磷酸化的肽段后,再使用不同的標(biāo)記試劑進(jìn)行iTRAQ標(biāo)記處理,并將標(biāo)記處理后的兩組肽段樣本混合;

步驟S5,分別對(duì)兩份混合后的樣本進(jìn)行強(qiáng)陽(yáng)離子交換分離處理;

步驟S6,分別對(duì)強(qiáng)陽(yáng)離子交換分離處理后的兩份樣本進(jìn)行液相色譜分離,再將液相色譜分離得到的肽段進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析;

步驟S7,使用蛋白質(zhì)鑒定軟件對(duì)質(zhì)譜分析結(jié)果進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定,根據(jù)蛋白質(zhì)豐度水平,分析得到肝臟癌變組織細(xì)胞和相應(yīng)的癌旁組織細(xì)胞的差異表達(dá)蛋白和差異磷酸化表達(dá)蛋白模型。

2.如權(quán)利要求1所述的肝癌磷蛋白組學(xué)模型的構(gòu)建方法,其特征在于,所述步驟S2中,采用四乙基溴化銨對(duì)提取的兩組蛋白樣本的沉淀進(jìn)行還原烷基化處理,得到相應(yīng)的蛋白樣本溶液。

3.如權(quán)利要求1所述的肝癌磷蛋白組學(xué)模型的構(gòu)建方法,其特征在于,所述步驟S5中,所述強(qiáng)陽(yáng)離子交換分離處理使用島津LC-20AB液相系統(tǒng),分離柱為4.6×250mm型號(hào)的Ultremex SCX柱。

4.如權(quán)利要求1所述的肝癌磷蛋白組學(xué)模型的構(gòu)建方法,其特征在于,所述步驟S6中,進(jìn)行液相色譜分離時(shí)使用島津LC-20AD型號(hào)的納升液相色譜儀 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)分離;

所述進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析使用串聯(lián)ESI質(zhì)譜儀,設(shè)置質(zhì)譜分辨率依次為:一級(jí)70000,二級(jí)17500,挑選出電荷為2+~5+,峰強(qiáng)度在20000以上的母離子十五個(gè)進(jìn)入二級(jí)分析,對(duì)肽段使用能量為27±12%的HCD模式進(jìn)行破碎,碎片在Orbi中檢測(cè)。

5.如權(quán)利要求1所述的肝癌磷蛋白組學(xué)模型的構(gòu)建方法,其特征在于,所述步驟S7中,所述蛋白質(zhì)鑒定軟件為Mascot,分析過(guò)程中,以IPI human v3.87為數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索。

6.如權(quán)利要求1所述的肝癌磷蛋白組學(xué)模型的構(gòu)建方法,其特征在于,所述步驟S7中,在根據(jù)蛋白質(zhì)豐度水平進(jìn)行分析的過(guò)程中,當(dāng)差異倍數(shù)達(dá)到1.2倍以上,且經(jīng)統(tǒng)計(jì)假定值p-value小于0.05時(shí),為差異表達(dá)蛋白。

7.如權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的肝癌磷蛋白組學(xué)模型的構(gòu)建方法得到差異表達(dá)蛋白和差異磷酸化表達(dá)蛋白模型。

8.如權(quán)利要求7所述的差異表達(dá)蛋白和差異磷酸化表達(dá)蛋白模型,其特征在于,所述差異表達(dá)蛋白包括在肝臟癌變細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的trQ6ZNC2、spO60218AK1BA、trJ3KNB4及sp|Q2TB90|HKDC1。

9.如權(quán)利要求7所述的差異表達(dá)蛋白和差異磷酸化表達(dá)蛋白模型,其特征在于,所述差異磷酸化表達(dá)蛋白包括在肝臟癌變細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的Q7Z3D7、A8K5M4、J3QTA6及P51812。

10.如權(quán)利要求7~9所述的差異表達(dá)蛋白和差異磷酸化表達(dá)蛋白模型在制備診斷肝癌的檢測(cè)芯片或檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。

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