一種檢測椰子蛋白的酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測椰子蛋白的酶聯(lián)免疫試劑盒。發(fā)明人從椰子果肉中分離純化制備得到20～25kDa，等電點為6～8的椰子特異性蛋白，其純度滿足免疫要求。同時利用該椰子特異性蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生椰子特異性蛋白抗體，并進一步制備檢測椰子蛋白的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所制備的試劑盒中椰子特異性蛋白抗體針對的抗原決定簇耐熱，可對椰子及其相關(guān)產(chǎn)品進行蛋白定量檢測，適用范圍廣，有利于消費者合法權(quán)益的保障；特異性好，靈敏度高，抗基質(zhì)干擾效果好，檢測結(jié)果準(zhǔn)確性好，重復(fù)性好；樣品的前處理簡單，檢測操作簡單，試劑均以工作液的形式提供，可方便地進行大量樣本的篩查。
【專利說明】-種檢測柳子蛋白的酶聯(lián)免疫試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及食品安全檢測領(lǐng)域，具體設(shè)及食品中挪子蛋白的快速定量檢測。

【背景技術(shù)】
[0002] 挪子蛋白飲料具備"天然、綠色、營養(yǎng)、健康"的品類特征，符合飲料市場發(fā)展潮流 和趨勢，深受消費者的喜愛，消費人群正在快速增長。不少企業(yè)看好挪子蛋白飲料的市場紛 紛進入該領(lǐng)域并取得不小的佳績。然而隨著植物蛋白飲料的快速發(fā)展，挪子蛋白飲料中植 物蛋白的含量造假的報道越來越引起關(guān)注，消費者報道雜志2014年3月18日刊文披露，部 分挪子蛋白飲料產(chǎn)品W =聚氯胺冒充蛋白，并且指出植物蛋白飲料真實的植物蛋白含量存 疑。固體飲料一一挪子粉也深陷奶精口。據(jù)中國食品安全報2014年3月14日報道，海風(fēng) 堂和春光速溶挪子粉的植物蛋白含量存在嚴(yán)重問題，挪子汁含量極低。
[0003] 造成該種亂象和質(zhì)疑的根本原因在于缺少植物蛋白飲料中所含有植物蛋白的定 量方法。國家標(biāo)準(zhǔn)GB 16322-2003《植物蛋白飲料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定植物蛋白飲料中的蛋白 質(zhì)含量應(yīng)不低于5g/L。由于技術(shù)所限，目前只能依據(jù)凱氏定氮法對其總蛋白進行定量。凱 氏定氮法是通過測定樣品中總氮的含量推算出蛋白含量。該就導(dǎo)致了不法分子可W =聚氯 胺等高氮小分子非法添加物冒充植物蛋白，或W大豆蛋白、牛奶蛋白等相對廉價的蛋白滲 偽價格較高的挪子蛋白。植物蛋白飲料對其總氮的測定不能真實反映添加的植物蛋白的含 量或者乳蛋白含量。該不僅設(shè)及到欺騙消費者，更嚴(yán)重的是滲偽過程因風(fēng)味常需要添加過 量的或非法的香精香料，極大威脅食品安全。
[0004] 目前，對于食品中的挪子蛋白含量的測定方法目前國內(nèi)外還未見相關(guān)報道。植物 生物屬性鑒定主要通過PCR法，所見報道一般用于過敏原成分的檢測。但由于DNA在細(xì)胞 中的拷貝數(shù)不一致，DNA在食品熱加工中部分?jǐn)嗔训热秉c，因此，PCR方法只適用于定性檢 巧。，定量檢測準(zhǔn)確性較差，導(dǎo)致滲偽產(chǎn)品無法鑒別。因此，為客觀準(zhǔn)確定量食品中的挪子蛋 白，迫切需要建立能檢測挪子蛋白含量的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明設(shè)及一種檢測挪子蛋白的酶聯(lián)免疫試劑盒。
[0006] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種挪子特異性蛋白的純化方法，包括W下步驟： 1) 蛋白提取；將挪子果肉用粉碎機粉碎后，取部分樣品，使用緩沖液超聲提取5?7小 時，去除雜質(zhì)后得到上清液； 2) 初次分離純化：對上清液利用等電聚焦儀進行初次分離純化，截取等電點為6?8 的組分； 3) 二次分離純化：初分離的樣品使用SDS-PA(iE聚丙締酷胺凝膠電泳分別進行濃縮和 分離，75?85V電泳1. 5?2.化后，切取分子量為20?25kDa的蛋白凝膠條帶； 4) 回收制備；將蛋白凝膠使用研鉢粉碎后，加入電洗脫儀，使用洗脫緩沖液對目標(biāo)蛋 白進行洗脫，而后透析和凍干得到目標(biāo)蛋白，記為挪子中性糖蛋白。
[0007] 進一步的，步驟1)所述的緩沖液為Tris-肥1 Buffer緩沖液，其配方為50mM Tris-HCl，P服.8,1. 5mM KC1，lOmM DTT。
[000引進一步的，步驟3)所述的SDS-PAGE聚丙締酷胺凝膠電泳分別是4%的濃縮膠和 12%的分離膠。
[0009] 進一步的，步驟3)中的洗脫緩沖液為7M的尿素溶液，洗脫電流為10A。
[0010] 一種挪子蛋白特異性抗體，由上述方法純化得到的挪子中性糖蛋白直接或間接誘 導(dǎo)動物體產(chǎn)生。
[0011] 進一步的，所述挪子蛋白特異性抗體為單克隆抗體。
[0012] 一種檢測挪子蛋白的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括包被了挪子中性糖蛋白的酶標(biāo)板、抗 挪子中性糖蛋白酶標(biāo)抗體、底物顯色液、終止液和挪子中性糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，其特征在于：所 述酶聯(lián)免疫試劑盒中使用的抗體為權(quán)利要求5或6任意一項所述的抗體，挪子中性糖蛋白 按權(quán)利要求1?4任意一項權(quán)利要求所述的方法制備得到。
[0013] 進一步的，所述檢測挪子蛋白的酶聯(lián)免疫試劑盒中有挪子中性糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)液7 瓶，其濃度分別為 0 y g/血、1 y g/血、2 y g/血、4 y g/血、8 y g/mL、16 y g/mL、32 y g/血。
[0014] 本發(fā)明的有益效果是： 1)本發(fā)明通過超聲提取W及二次分離純化制備得到20?25kDa，等電點為6?8的挪 子特異性蛋白。
[0015] 2)本發(fā)明利用已制備的挪子特異性蛋白直接或間接誘導(dǎo)動物體產(chǎn)生挪子特異性 蛋白抗體，并進一步制備檢測挪子蛋白的酶聯(lián)免疫試劑盒。
[0016] 3)本發(fā)明所制備的試劑盒中挪子特異性蛋白抗體針對的抗原決定簇耐熱，可對 挪子及其相關(guān)產(chǎn)品進行蛋白定量檢測，適用范圍廣，有利于消費者合法權(quán)益的保障；特異性 好；和其他核果、堅果蛋白及其他植物蛋白飲料中的原料蛋白無交叉反應(yīng)；靈敏度高；最低 可識別1 yg/mL挪子中性糖蛋白；抗基質(zhì)干擾效果好，不易受到食品中其他原輔料的干擾； 檢測結(jié)果準(zhǔn)確性好，重復(fù)性好；樣品的前處理簡單，檢測操作簡單，試劑均W工作液的形式 提供，可方便地進行大量樣本的篩查。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為挪子中性糖蛋白雙向電泳蛋白圖譜； 圖2為挪子中性糖蛋白酶聯(lián)免疫檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。

【具體實施方式】
[0018] W下結(jié)合具體實驗，對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0019] 挪子特異性蛋白的分離純化 將挪子果肉部分粉碎機粉碎后，取樣品lOOg，使用Tris-肥1 Buffer(配方；50mM Tris-肥1，P服.8,1. 5mM KC1，lOmM DTT)超聲提取5?7h。離屯、取上清，使用液相等電聚焦 儀進行初次分離純化，截取等電點為6?8的組分； 初分離得到的樣品使用垂直電泳儀進行再純化；將初分離的樣品使用4%的濃縮膠和 12%的分離膠進行SDS-PA(iE聚丙締酷胺凝膠電泳，同時使用預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)品作為分子量 參照。80V電泳化后，參照預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)品切取分子量為20?25kDa的蛋白凝膠條帶。將 蛋白凝膠使用研鉢粉碎后，加入電洗脫儀，使用7M尿素10A電流洗脫她。對收集帽中的富 集蛋白進行透析，凍干。通過雙向電泳檢測分析（圖1)，目標(biāo)蛋白為22kDa蛋白，未見其他 雜蛋白，純度滿足免疫要求。純化得到的挪子特異性目標(biāo)蛋白記名為挪子中性糖蛋白。
[0020] 抗挪子中性糖蛋白抗體的制備和純化 1) 用挪子中性糖蛋白分別免疫6周雌性ba化/c鼠，每組3只。首次免疫注射時，取 lOOyg/mL的免疫抗原lOOyl，與等量弗氏完全佐劑充分乳化，腹腔直接注射。間隔兩周 后，取同樣的抗原100 y 1，與等量不完全佐劑乳化，同樣方法注射； 2) 在細(xì)胞融合前Id或當(dāng)天拉頸處死昆明鼠，浸泡在70%酒精中，體表消毒；用大頭針 固定昆明鼠在蠟板上，超凈工作臺上剪開腹部，用小綴子挑起腹膜，注入5mL RPMI-1640完 全培養(yǎng)液（由6181〇)1--11-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液加入15%胎牛血清而得），用手輕輕揉動腹 腔，將其體內(nèi)液體用無菌吸管移入75mL HAT完全培養(yǎng)液（由74. 25mL RPMI-1640完全培養(yǎng) 液加入0. 75血100XHAT液而得）中，用吸管混勻，鋪24孔板，每孔加0. 5血，置于37°C CA 培養(yǎng)箱中； 3) 小鼠眼眶放血，收集血清，拉頸處死，70%酒精浸泡消毒體表，無菌取出脾臟，放入 RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液（購自GIBIC0,貨號為A10491-01)中，并小屯、剔除筋膜及脂肪，剪 碎，置于100目的不誘鋼篩內(nèi)，無菌研磨，釋放出單個脾細(xì)胞，吸取含有脾細(xì)胞的液體置于 50血無園罔心官中，罔心； 4) 將骨髓瘤細(xì)胞和上述制備好的脾細(xì)胞W個數(shù)5 ;1的比例加入同一 50mL的離屯、管 中，加入37°C溫浴的RPMI-1640不完全培養(yǎng)液（購自GIBIC0,貨號為61870-036) 20血，混 合均勻，15(K)r/min離屯、6min，棄去上清，用手指輕擊離屯、管底部，使沉淀混勻如糊狀；用 移液管取37°C預(yù)熱的陽G 1血，滴入離屯、管，靜置Imin后，于37°C水浴中在2min內(nèi)滴加 RPMI-1640完全培養(yǎng)液10血，100化/min離屯、6min，棄去上清，加75血HAT培養(yǎng)液，輕輕混 勻，將混勻懸液分裝于有飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板中，每孔0. 5111以于37°C、5% C〇2飽和濕度的培 養(yǎng)箱中解育； 5) 融合后6?9d，用HAT培養(yǎng)液半量換液1次，在12?14d后根據(jù)增殖情況改用 RPMI-1640完全培養(yǎng)液；待細(xì)胞貼壁至占板孔1/3時，計雜交瘤細(xì)胞生長的孔數(shù)及細(xì)胞總 數(shù)，取上清液，間接化ISA選擇效價高和間接競爭化ISA選擇藥物抑制強的陽性雜交瘤細(xì) 胞； 6) 采用間接化ISA和間接競爭化ISA法進行陽性雜交瘤細(xì)胞篩選，顯示陽性并出現(xiàn)競 爭抑制反應(yīng)的孔為產(chǎn)挪子中性糖蛋白抗體的孔，并可用于進一步的亞克隆； 7) 無菌條件下，洗脫陽性孔內(nèi)的細(xì)胞，用彎頭吸管將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至預(yù)先W飼養(yǎng)細(xì)胞鋪板 的96孔培養(yǎng)板中，每個原始孔克隆成8孔，待細(xì)胞貼壁長滿1/2?1/3孔底后，取上清液， 間接化ISA檢測；取呈陽性強的亞克隆，如此反復(fù)2?5次，待所克隆的8個孔上清液中抗 體陽性率為100%時，挑取單細(xì)胞克隆，檢測為全陽性者轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板或25mL細(xì) 胞培養(yǎng)瓶擴大培養(yǎng)，建株并W分裝、凍存。提前一周注射0. 5mL降植燒至Ba化/c小鼠腹腔。 取凍存細(xì)胞株，復(fù)蘇后，經(jīng)大量培養(yǎng)繁殖，收集細(xì)胞，用不完全培養(yǎng)基洗漆二次后，再用lOmL 不完全培養(yǎng)基懸浮，計數(shù)；將細(xì)胞（每只小鼠1111以含3. IX 1〇7個細(xì)胞）腹腔注射小鼠腹部， 10?15d后，待小鼠腹部明顯膨大時用16號注射器無菌采集腹水；200化/min離屯、lOmin， 去除上層脂肪和下層纖維蛋白及細(xì)胞，收集中層，分裝-7〇°C凍存?zhèn)溆茫?8)取腹水離屯、后的中層部分3mL，加入2倍體積的0. 06mol/L、抑4. 5醋酸鋼緩沖 液。將正辛酸逐滴慢慢加入樣品中，至終濃度33 y g/血腹水，邊加邊攬拌，加完后繼續(xù)攬 拌30min，4°C下1000化/min離屯、30min，去沉淀（白蛋白和其它非IgG蛋白）。取上清 經(jīng) 0. 45ym 微孔膜過濾，與 1/10 體積 10XPBS 混合（10XPBS 由 80gNaCl、2g KCl、11.5g 化2冊04、2肖皿2?04、0. 5845g邸TA用950血蒸饋水溶解后，調(diào)抑至7. 4并定容至1000血而 得），用Imol/L化OH溶液調(diào)抑值到7. 4。上清冷卻到4°C，加硫酸錠至終濃度為0. 277g/ 血。攬拌30min，4°C下100(K)r/min離屯、30min，棄上清。用少量PBS溶液溶解沉淀，用50? 100倍體積的PBS透析過夜，換液3次。得到純化后的抗挪子中性糖蛋白抗體，4°C下貶藏備 用。
[0021] 挪子蛋白酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的構(gòu)建 1) 預(yù)包被酶標(biāo)板： 將0. ImL Img/L的目標(biāo)抗原（挪子中性糖蛋白）加入高吸附酶標(biāo)板，包被過夜，采用封 閉液封閉2h，封閉液的配方為（1 %牛血清白蛋白，1 %牛酪蛋白，0. 5 %大豆蛋白粉，0. 05% 吐溫-80,溶于0. 01M抑7. 4PBS)，封閉后洗版真空干燥； 2) 抗挪子中性糖蛋白酶標(biāo)抗體： 稱取5mg辣根過氧化物酶溶解于ImL蒸饋水中，加入0. 2mL新配的0. 1M化1〇4溶液， 室溫下避光攬拌20分鐘。將上述溶液裝入透析袋中，對ImM PH4. 4的醋酸鋼緩沖液透析， 4°C過夜。加20 y 1 0. 2M PH9. 5碳酸鹽緩沖液，抑升高到9. 0?9. 5,然后立即加入lOmg 抗挪子中性糖蛋白單克隆抗體在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攬拌2小時。 加0. 1血新配的4mg/ml化抓4液，混勻，再置4°C 2小時。將上述液裝入透析袋中，對0. 15M pH7. 4PBS透析，4°C過夜，加入1 %的牛血清白蛋白，0. 05 %吐溫-80和15mM的疊氮化鋼分 裝14mL至每個試劑盒； 3) 底物顯色液： 由顯色劑A和顯色劑B等體積混勻而得；稱取23mg四甲基聯(lián)苯胺，加ImL DMS0溶解， 然后加0. 1M抑5. 5己酸-醋酸鋼緩沖液66mL，得到顯色劑A ;取雙蒸水lOOmL，加過氧化脈 10 y g，得到顯色劑B。將顯色液A和顯色液B按體積比1:1混合，分裝14血至每個試劑盒； 4) 終止液：為2M硫酸溶液，分裝7mL至每個試劑盒； 本發(fā)明提供的挪子蛋白免疫檢測試劑盒包括：挪子中性糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)液7瓶，濃度分別 為0 y g/血、1 y g/血、2 y g/血、4 y g/血、8 y g/血、16 y g/血、32 y g/血；抗挪子中性糖蛋白 酶標(biāo)抗體；包被了挪子中性糖蛋白的酶標(biāo)板，底物顯色液，終止液。
[0022] 本發(fā)明提供的挪子蛋白免疫檢測試劑盒在4°C環(huán)境下貶藏，可保質(zhì)1年W上。
[0023] 挪子蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒對挪子相關(guān)產(chǎn)品進行檢測 1)樣品前處理： 挪子飲料：將挪子飲料均質(zhì)，稱取Ig，加入20mL 0. 01M pH7. 4的PBS超聲連續(xù)提取 2min，離屯、，取上清液為樣品檢測溶液，如果樣品檢測溶液的檢測結(jié)果超過線性范圍上限， 需再酌情稀釋； 含有挪子成分的固體食品；將固體樣品研磨至粉狀，稱取0. Ig，加入lOmL 0.01M pH7. 4的PBS超聲連續(xù)提取2min，離屯、，取上清液稀釋1000倍后，得到樣品檢測溶液； 2) 挪子蛋白酶聯(lián)免疫檢測試劑盒進行檢測： 將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，在室溫下平衡30min W上，各種試劑使用前均須搖勻； 加系列濃度的挪子中性糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或樣品檢測溶液50ul到相應(yīng)的微孔中，標(biāo)準(zhǔn)液 均需做2個平行試驗，然后加50 y 1酶標(biāo)抗體工作液，室溫避光反應(yīng)30分鐘； 小屯、揭開蓋板膜，棄去微孔中液體，并將微孔中剩余殘液在吸水紙上拍干，往微孔中注 滿洗漆液，輕輕振蕩，放置2分鐘，棄去微孔中液體，并在吸水紙上拍干，重復(fù)洗漆4次或機 洗5次； 加100 y 1底物顯色液到相應(yīng)的微孔中，并在室溫下避光反應(yīng)15分鐘； 加50 y 1終止液到相應(yīng)的微孔中，使用酶標(biāo)儀于450nm波長下測定OD值； 3) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線： 根據(jù)挪子中性糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)液的實驗數(shù)據(jù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程R2〉0. 99,說明OD值與挪子中性糖蛋白濃 度具有很好的線性關(guān)系。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程，計算出樣品中的挪子中性糖蛋白 含量，將此含量乘W系數(shù)6. 5,得到挪子全蛋白含量。
[0024] 挪子蛋白酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的特異性 使用挪子蛋白酶聯(lián)免疫檢測試劑盒對食品其他常見蛋白進行檢測，結(jié)果如表1所示。 從表1可知，挪子蛋白酶聯(lián)免疫檢測試劑盒與食品中其他蛋白成分無交叉反應(yīng)，特異性好， 檢測結(jié)果不會受影響。
[0025] 表1挪子蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒與食品中其他蛋白成分的交叉反應(yīng)

【權(quán)利要求】
1. 一種椰子特異性蛋白的純化方法，包括以下步驟： 1) 蛋白提?。簩⒁庸庥梅鬯闄C粉碎后，取部分樣品，使用緩沖液超聲提取5?7小 時，去除雜質(zhì)后得到上清液； 2) 初次分離純化：對上清液利用等電聚焦儀進行初次分離純化，截取等電點為6?8的 組分； 3) 二次分離純化：初分離的樣品使用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分別進行濃縮和 分離，75?85V電泳1. 5?2. 5h后，切取分子量為20?25kDa的蛋白凝膠條帶； 4) 回收制備：將蛋白凝膠使用研缽粉碎后，加入電洗脫儀，使用洗脫緩沖液對目標(biāo)蛋白 進行洗脫，而后透析和凍干得到目標(biāo)蛋白，記為椰子中性糖蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種椰子特異性蛋白的純化方法，其特征在于：步驟1)所 述的緩沖液為 Tris-HCl Buffer 緩沖液，其配方為 50mM Tris-HCl，pH8. 8，1.5mM KCl，10mM DTT〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種椰子特異性蛋白的純化方法，其特征在于：步驟3)所述 的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分別是4%的濃縮膠和12%的分離膠。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種椰子特異性蛋白的純化方法，其特征在于：步驟3)中的 洗脫緩沖液為7M的尿素溶液，洗脫電流為10 A。
5. -種椰子蛋白特異性抗體，由權(quán)利要求1?4任意一項權(quán)利要求所述方法純化得到 的椰子中性糖蛋白直接或間接誘導(dǎo)動物體產(chǎn)生。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的椰子蛋白特異性抗體，其特征在于：所述抗體為單克隆抗體。
7. -種檢測椰子蛋白的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括包被了椰子中性糖蛋白的酶標(biāo)板、抗椰 子中性糖蛋白酶標(biāo)抗體、底物顯色液、終止液和椰子中性糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，其特征在于：所述 酶聯(lián)免疫試劑盒中使用的抗體為權(quán)利要求5或6任意一項所述的抗體，椰子中性糖蛋白按 權(quán)利要求1?4任意一項權(quán)利要求所述的方法制備得到。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于：所述酶聯(lián)免疫試劑盒中有椰 子中性糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)液7瓶，其濃度分別為0 y g/mL、l y g/mL、2 y g/mL、4 y g/mL、8 y g/mL、 16 y g/mL、32 y g/mL〇
【文檔編號】G01N33/531GK104502582SQ201410767465
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月12日
【發(fā)明者】賴曉芳, 張世偉, 賴心田, 李碧芳, 黃靜敏, 王士峰, 馮榮虎, 唐棟, 馬廣東, 楊國武 申請人:深圳市計量質(zhì)量檢測研究院