一種光子晶體微球流式芯片及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種用于檢測致病菌的探針，所述探針是根據(jù)致病菌的基因設(shè)計(jì)的探針，并在5'端標(biāo)記氨基和poly(T)15。本發(fā)明還公開了一種光子晶體微球流式芯片及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明通過隨機(jī)引物對樣本核酸進(jìn)行擴(kuò)增，提高靈敏度；利用編碼小球增加檢測通量；有利于未知復(fù)雜樣本的檢測；采用一條通用引物代替多重PCR的多條特異性引物擴(kuò)增致病菌的基因組DNA，能夠擴(kuò)增出樣品中的大量未知病原菌，有助于借助芯片進(jìn)行高通量分析；替代玻璃芯片，避免空間因素的限制，使其產(chǎn)生較強(qiáng)的雜交信號；采用甲酰胺雜交緩沖液、較高的雜交溫度、較短的雜交時(shí)間和PBS多次洗滌來提高雜交特異性；避免多重PCR擴(kuò)增條件的摸索。
【專利說明】一種光子晶體微球流式芯片及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種光子晶體微球流式芯片檢測致病菌的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]病原微生物的準(zhǔn)確檢測和鑒定在臨床醫(yī)學(xué)、食品安全、環(huán)境監(jiān)督中的作用日益凸顯，傳統(tǒng)的食源性疾病的檢測方法都要經(jīng)過分離培養(yǎng)、生化鑒定等步驟，存在操作較為耗時(shí)繁瑣、檢測靈敏度低和容易出現(xiàn)假陰性等缺點(diǎn)，在應(yīng)對突發(fā)性食品安全公共事件上，不能滿足快速、準(zhǔn)確、靈敏和特異性高等要求。
[0003]隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，以PCR為基礎(chǔ)的核酸擴(kuò)增技術(shù)越來越成為生物檢測和鑒定的最有效方法，特別是基于PCR的基因芯片技術(shù)，可以對樣品中病原微生物做到一次性鑒定種屬、毒力因子和基因多態(tài)性分析，這對致病菌檢測提供了方便快速的方法。
[0004]雖然基因芯片技術(shù)在微生物檢測方面有很多獨(dú)特的優(yōu)勢，但還有不少問題和缺陷亟待解決。目前主要有以下幾個(gè)問題制約了基因芯片技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展:1)基因序列信息的缺乏遠(yuǎn)不能滿足實(shí)際檢測與診斷的需要；2)基因芯片相關(guān)技術(shù)專利的限制，減慢了基因芯片技術(shù)的普及；3)基因芯片技術(shù)是一項(xiàng)多學(xué)科交叉的技術(shù)，仍有很多技術(shù)問題需要改進(jìn)和提高；4)目前基因芯片的制備和檢測費(fèi)用都很高，只能在大型實(shí)驗(yàn)室研究，極大地限制了其開發(fā)進(jìn)展；5)無論是PCR還是基因芯片技術(shù)，均需要對目的DNA擴(kuò)增，不可避免的要求在擴(kuò)增目的基因前設(shè)置合適的引物，特別是多重PCR，對引物設(shè)計(jì)要求更為嚴(yán)格，擴(kuò)增條件更為苛刻。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]發(fā)明目的:本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供了一種用于擴(kuò)增致病菌基因組DNA的通用引物。
[0006]本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種高靈敏度、成本低、檢測時(shí)間快、特異性好的光子晶體微球流式芯片。
[0007]本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問題是提供一種光子晶體微球流式芯片的制備方法。
[0008]本發(fā)明最后所要解決的技術(shù)問題是提供光子晶體微球流式芯片檢測致病菌的方法。
[0009]本發(fā)明的原理為:光子晶體微球(編碼小球)表面用雙氧水:濃硫酸溶液進(jìn)行羥基化修飾，用Y-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)環(huán)氧基修飾，然后與5端經(jīng)氨基修飾的特異性探針偶聯(lián)，牛血清蛋白(BSA)封閉。偶聯(lián)的探針與5端經(jīng)FAM熒光素標(biāo)記的通用引物擴(kuò)增所得的擴(kuò)增產(chǎn)物特異性結(jié)合。用熒光顯微鏡拾取微球的熒光信號，用微球的反射光譜的有無和強(qiáng)弱來判斷檢測樣本中是否存在某種致病菌以及含量的多少。
[0010]技術(shù)方案:為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種用于檢測致病菌的探針，所述探針是根據(jù)致病菌的基因設(shè)計(jì)的探針，并在5’端標(biāo)記氨基和poly (T) 15。
[0011]一種光子晶體微球流式芯片，它包含上述的探針。
[0012]一種光子晶體微球流式芯片的制備方法，包括以下步驟:
O光子晶體微球的制備；
2)光子晶體微球表面的修飾；
3)探針偶聯(lián):將上述的探針偶聯(lián)于經(jīng)步驟2)表面修飾的光子晶體微球表面得到光子晶體微球流式芯片。
[0013]其中，上述步驟I)具體步驟為:首先將甲基硅油倒入培養(yǎng)皿中，175°C加熱lOmin，然后冷卻至室溫備用。內(nèi)裝二氧化硅單分散乳液的I號注射器和內(nèi)裝甲基硅油的2號注射器中的液體通過三通管連接，利用兩蠕動泵分別將甲基硅油和二氧化硅單分散乳液混合包裹進(jìn)入已經(jīng)處理好的盛有甲基硅油培養(yǎng)皿，在界面力的作用下二氧化硅單分散乳液會形成球狀結(jié)構(gòu)；以不同納米二氧化硅顆粒自組裝技術(shù)制備上述的粒徑相同的光子晶體微球，各微球具有不同的光反射光譜；將制備好的微球放入70°C烘箱中加熱9h，其中的水分完全蒸發(fā)的同時(shí)也會使納米微球進(jìn)一步組裝。微球成型后，使用正己烷多次清洗小球，每次沖洗前先浸泡lOmin，接著用無水乙醇沖洗3次，然后再放入馬弗爐中進(jìn)行煅燒，升溫(2°C /min)至 300°C后恒溫 3h,降溫(1.5°C /min)。
[0014]其中，上述步驟2)包括以下步驟:將步驟I)得到的光子晶體微球置于體積比1:5飛:I雙氧水與濃硫酸中對微球表面進(jìn)行羥基化修飾，再用0.01%-20% Y -縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)的甲苯溶液對微球表面進(jìn)行環(huán)氧基修飾；具體步驟如下:將光子晶體微球置于食人魚洗液中(濃硫酸:雙氧水=2:1體積比)6h，利用去離子水清洗微球3次，并用氮?dú)獯蹈桑蝗缓笾糜? % GPTMS甲苯溶液，常溫過夜；利用甲苯清洗3次，乙醇清洗3次，滅菌水清洗3次，去除殘留硅烷，氮?dú)獯蹈伞?br> [0015]其中，上述步驟3)探針偶聯(lián)與封閉具體步驟如下:將洗凈后的光子晶體微球與5μ Κ?ΟΟμΜ)的探針4°C偶聯(lián)過夜，10 X PBS清洗3次，去離子水清洗2次，氮?dú)獯蹈伞?br> [0016]將微球置于5% BSA的PBS buffer (PBS,0.05 M,pH 7.4)溶液中，室溫血液混勻器振蕩30min，PBS清洗3次，去離子水清洗2次，晾干，準(zhǔn)備5份微球，用于金黃色葡萄球菌DNA的雜交。
[0017]上述的一種光子晶體微球流式芯片在檢測致病菌方面的應(yīng)用。
[0018]一種檢測致病菌的方法，將上述的光子晶體微球流式芯片對待測樣品進(jìn)行檢測，然后用熒光顯微鏡對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行檢測并觀察。
[0019]其中，上述對待測樣品進(jìn)行檢測步驟為:準(zhǔn)備多個(gè)光子晶體微球流式芯片，與致病菌基因組DNA擴(kuò)增雜交，雜交后進(jìn)行洗滌和鏡檢。
[0020]其中，上述雜交步驟具體如下:將致病菌基因組DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置于95°C下熱變性5min，90°C下熱變性lmin，取變性后的擴(kuò)增產(chǎn)物4.0ul與16.0 μ I 4Χ SSC于PCR反應(yīng)管中，將PCR反應(yīng)管置于包被有錫箔紙的離心管中置于血液混勻器上45°C混勻雜交lh。
[0021]洗滌與鏡檢:
取20 μ I 10XPBS緩沖液加入上述PCR管中，緩慢搖勻洗滌2min，每管重復(fù)洗滌3次，將雜交后的光子晶體微球置于薄片上，熒光顯微鏡拍照檢測。
[0022]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下: 1)通過隨機(jī)引物對樣本核酸進(jìn)行擴(kuò)增，提高靈敏度；同時(shí)利用編碼小球增加檢測通量；有利于未知復(fù)雜樣本的檢測；
2)采用一條通用引物代替多重PCR的多條特異性引物擴(kuò)增病原微生物的基因組DNA，能夠擴(kuò)增出樣品中的大量未知病原菌，有助于借助芯片進(jìn)行高通量分析；
3)替代玻璃芯片，避免了空間因素的限制，使其產(chǎn)生了較強(qiáng)的雜交信號；
4)采用甲酰胺雜交緩沖液、較高的雜交溫度、較短的雜交時(shí)間和PBS多次洗滌來提高雜交特異性；
5)無需設(shè)計(jì)多對特定引物，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本，避免了多重PCR擴(kuò)增條件的摸索。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖l、phi29 DNA聚合酶恒溫?cái)U(kuò)增金黃色葡萄球菌基因組DNA ; 4和M分別表示金黃色葡萄球菌、marker DL2000 ；
圖2金黃色葡萄球菌DNA基于phi29 DNA聚合酶恒溫?cái)U(kuò)增雜交結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0024]實(shí)施例1:擴(kuò)增反應(yīng) UDNA的提取
取ImL生理鹽水稀釋的LB培養(yǎng)基上生長48h的金黃色葡萄球菌菌落于1.5mLEP管中，12000r/min 離心 1min,棄上清，向沉淀中加入 100 μ I I XTE buffer, 10CTC煮沸 1min 后冰浴5min, 12000r/min離心5min后取上清進(jìn)行擴(kuò)增。
[0025]2、試劑
金黃色葡萄球菌來源于ATCC，DNA聚合酶購自深圳華因康基因科技有限公司。其它試劑為國產(chǎn)分析純。
[0026]3、引物和探針的合成
phi29DNA聚合酶和隨機(jī)擴(kuò)增所采用的引物均為隨機(jī)十聚體，并在引物5’端標(biāo)記FAM熒光素，引物序列為:5’ -FAM-N*NNNNNNNNN-3’ (其中N為隨機(jī)核苷酸)；根據(jù)金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶(nuc)基因設(shè)計(jì)探針，并在5’端標(biāo)記氨基和poly (T) 15，探針序列為:
5’ -NH2-TTTTTTTTTTTTTTTCGTTGTCTTCGCTCCAAAT-3’
弓I物探針由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
[0027]4、引物的擴(kuò)增反應(yīng)
phi29DNA聚合酶擴(kuò)增PCR反應(yīng)管中加入如下組分，各基因組DNA 2.0 μ 1，10XPhi29反應(yīng)緩沖液2.5 μ 1，100 μ M隨機(jī)引物2.0μ1，去離子雙蒸水16.75μ1。95°C變性5min，冰浴冷卻 5min 后加入 dNTP (1mM each ), 100XBSA 0.25 μ l，phi29DNA 聚合酶 0.5 μ I。35°C反應(yīng)15h后65°C終止15min，用2%瓊脂糖凝膠電泳測擴(kuò)增效果。(參見圖1)
由圖1可知:基于phi29 DNA聚合酶恒溫?cái)U(kuò)增方法能成功擴(kuò)增出金黃色葡萄球菌的基因組DNA，phi29 DNA聚合酶恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)生單一高分子量DNA，分子量大于2000bp，絕大多數(shù)DNA滯留于膠孔內(nèi)。
[0028]實(shí)驗(yàn)所使用的DNA Marker為Takara公司的DL2, 000 DNA Marker,圖1中第一孔道為 DNA Marker，從上往下依次為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、lOObp。
[0029]實(shí)施例2:
1.光子晶體微球的處理與雜交
親水處理:將光子晶體微球置于食人魚洗液中(濃硫酸:雙氧水=2:1體積比)6h，利用去離子水清洗微球3次，并用氮?dú)獯蹈?；然后置?% GPTMS甲苯溶液，常溫過夜；利用甲苯清洗3次，乙醇清洗3次，滅菌水清洗3次，去除殘留硅烷，氮?dú)獯蹈伞?br> [0030]探針的偶聯(lián):將洗凈后的光子晶體微球與5μ1(100μΜ)的探針4°C偶聯(lián)過夜，10XPBS清洗3次，去離子水清洗2次，氮?dú)獯蹈伞?br> [0031]封閉:將微球置于5% BSA的PBS buffer (PBS, 0.05 M, pH 7.4)溶液中，室溫血液混勻器振蕩30min，PBS清洗3次，去離子水清洗2次，晾干，制備5份微球，用于金黃色葡萄球菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交。
[0032]雜交:將金黃色葡萄球菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)物置于95°C下熱變性5min，90°C下熱變性lmin，取各變性后的擴(kuò)增產(chǎn)物4.0μ I與16.0 μ I 4 X SSC于上述PCR管中，將PCR反應(yīng)管置于包被有錫箔紙的離心管中置于血液混勻器上45°C混勻雜交lh。
[0033]洗滌與鏡檢:取20 μ I 10XPBS緩沖液加入上述PCR管中，緩慢搖勻洗滌2min，每管重復(fù)洗滌3次，將雜交后的光子晶體微球置于薄片上，熒光顯微鏡拍照檢測。參見圖2，
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出:對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測致病菌的探針，所述探針是根據(jù)致病菌的基因設(shè)計(jì)的探針，并在5’端標(biāo)記氨基和poly(T) 15。
2.一種光子晶體微球流式芯片，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的探針。
3.權(quán)利要求2所述的一種光子晶體微球流式芯片的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: O光子晶體微球的制備； 2 )光子晶體微球表面的修飾； 3)探針偶聯(lián):將權(quán)利要求2所述的探針偶聯(lián)于經(jīng)步驟2)表面修飾的光子晶體微球表面得到光子晶體微球流式芯片。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種光子晶體微球流式芯片的制備方法，其特征在于，所述步驟2)包括以下步驟:將步驟I)得到的光子晶體微球置于體積比1:5飛:I雙氧水與濃硫酸中對微球表面進(jìn)行羥基化修飾，再用0.01%-20%y-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液對微球表面進(jìn)行環(huán)氧基修飾。
5.權(quán)利要求2所述的一種光子晶體微球流式芯片在檢測致病菌方面的應(yīng)用。
6.一種檢測致病菌的方法，其特征在于，將權(quán)利要求2或3所述的光子晶體微球流式芯片對待測樣品進(jìn)行檢測，然后用熒光顯微鏡對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行檢測并觀察。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種檢測致病菌的方法，其特征在于，所述對待測樣品進(jìn)行檢測步驟為:準(zhǔn)備多個(gè)光子晶體微球流式芯片，與致病菌基因組DNA擴(kuò)增雜交，雜交后進(jìn)行洗滌和鏡檢。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種檢測致病菌的方法，其特征在于，所述雜交步驟具體如下:將致病菌基因組DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置于95°C下熱變性5min，9(TC下熱變性lmin，取變性后的擴(kuò)增產(chǎn)物4.0ul與16.0 μ I 4X SSC于PCR反應(yīng)管中，將PCR反應(yīng)管置于包被有錫箔紙的離心管中置于血液混勻器上45°C混勻雜交lh。
【文檔編號】G01N21/64GK104390949SQ201410724752
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月3日
【發(fā)明者】張春東, 韓東成, 周其洋, 黃寶福, 淳林 申請人:南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司