專利名稱：一種氨基化微球的熒光編碼方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種氨基化微球的熒光染料編碼方法。
背景技術(shù)：
流式微球陣列是既能保證信息質(zhì)量，又能提供相對(duì)高通量的分子探測(cè)平臺(tái)，與其 技術(shù)原理相同的xMAP (flexible multi-analyte profiling，又名液相芯片)技術(shù)是美國 FDA 2001年批準(zhǔn)的首個(gè)臨床型陣列分析技術(shù)。陣列分析時(shí)，微球錨定的捕獲分子(抗體或 核酸探針)捕獲靶點(diǎn)分子，熒光標(biāo)記的報(bào)道分子(抗體或核酸探針)報(bào)道靶點(diǎn)分子，一種或 兩種不同濃度熒光編碼的微球組建陣列即可進(jìn)行多參數(shù)并行分析。陣列解碼常用生物醫(yī)學(xué) 工程儀器流式細(xì)胞儀(flowcytometer)或?qū)Ｓ靡合嘈酒瑑x。流式微球陣列具有靈敏度高、 特異性強(qiáng)、數(shù)據(jù)圖像化及多任務(wù)定量的顯著優(yōu)點(diǎn)。流式微球陣列所用微球直徑在0. 5 50微米之間，由一種或兩種不同濃度的熒光 標(biāo)記微球，以此編碼微球，建立熒光微球陣列，其廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生物技術(shù)、標(biāo)準(zhǔn)計(jì) 量、食品化工、信息工程和微電子技術(shù)等領(lǐng)域。尤其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，熒光編碼的微米級(jí)功 能化聚苯乙烯微球?qū)εR床分子診斷、藥物快速發(fā)現(xiàn)、檢驗(yàn)檢疫、免疫技術(shù)、細(xì)胞學(xué)等研究和 應(yīng)用具有重要價(jià)值。利用不同濃度熒光編碼的直徑0. 5 50微米微球組建流式微球陣列， 特異性抗體識(shí)別融合蛋白或以寡核苷酸探針識(shí)別融合基因cDNA拷貝，可以實(shí)施白血病診 斷和微小殘留病監(jiān)測(cè)；流式微球陣列結(jié)合分析同步篩選配基競爭性和ATP競爭性受體酪氨 酸激酶拮抗劑，可敲除藥物抵抗先導(dǎo)物并避免放射法污染，進(jìn)而快速、準(zhǔn)確、有效地發(fā)現(xiàn)抗 腫瘤先導(dǎo)藥物；此外探測(cè)細(xì)胞ERK信號(hào)通路傳導(dǎo)的流式微球陣列也見諸報(bào)道。相比其它分 子檢測(cè)手段，基于熒光編碼微球的流式微球陣列和液相芯片具有下述突出優(yōu)點(diǎn)(1)相對(duì) 高通量?？梢圆⑿袡z測(cè)多個(gè)參數(shù)；(2)靈敏度高。檢測(cè)下限低于夾心ELISA ； (3)微量檢測(cè)。 所需樣本少，特別是臨床檢驗(yàn)只需幾微升血液樣品，即可快速完成多個(gè)并行臨床參數(shù)檢測(cè)。目前微球常用的熒光編碼方法是包埋法和乳化法。微球熒光編碼包埋法是由單 體、引發(fā)劑、交聯(lián)劑、穩(wěn)定劑、熒光染料及含氨基有機(jī)化合物組成反應(yīng)體系，經(jīng)一定時(shí)間反 應(yīng)生成氨基化微球，熒光染料以分子或離子狀態(tài)吸附在微球內(nèi)部孔穴，在微球制備過程中 直接將熒光染料包裹在微球內(nèi)部網(wǎng)狀空間中，如中國專利CN1475805在微球制備過程中 摻入熒光染料編碼微球；中國專利CN1690163利用誘導(dǎo)相變包埋量子點(diǎn)制備熒光編碼微 球，此法主要缺點(diǎn)是⑴熒光標(biāo)記不穩(wěn)定，泄露不可避免；⑵熒光強(qiáng)度不易提高；(3)量 子點(diǎn)制備技術(shù)較為繁冗，不易掌握。微球熒光編碼乳化法是將熒光素與一定量的微球、乳 化劑、增粘劑、溶劑混合組成反應(yīng)體系，溶劑可為良溶劑和不良溶劑中的一種或者多種的 混合物，體系均勻分散后在一定壓力下避光染色數(shù)小時(shí)至數(shù)天，得熒光微球，如中國專利 CN101092487使用乳化法制備熒光編碼聚苯乙烯微球，此法雖然可以有效避免熒光染料的 泄露問題，但染色反應(yīng)體系組分多，染色條件相對(duì)苛刻，微球熒光的均一性也不易控制。國 外也有USP5073498、USP4157323、USP4336173等多篇專利涉及微球的制備和熒光編碼技 術(shù)，但這些專利技術(shù)均不包含本專利所要求權(quán)利的內(nèi)容。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)已有微球熒光編碼方法的不足，本發(fā)明提供了一種氨基化微球的熒光編碼方 法，可以簡潔、快速、有效地實(shí)現(xiàn)氨基化微球的不同濃度熒光標(biāo)記。本發(fā)明的技術(shù)方案如下 一種氨基化微球的熒光編碼方法，步驟如下(1)稱取無機(jī)鉀鹽或無機(jī)鈉鹽溶于雙蒸水中，使其摩爾濃度為0. 01 1M，pH4 10，制得熒光標(biāo)記緩沖液；(2)將0. 1 IOmg熒光染料溶于0. 1 IOml有機(jī)溶劑中，制得熒光染料母液；(3)將步驟(2)制得的熒光染料母液加入到步驟(1)制得的熒光標(biāo)記緩沖液中，配 制不同濃度的熒光染液，熒光染液中的熒光染料濃度范圍為0. 1 ΙΟΟΟμ g/ml ；(4)分別取相同體積的步驟(3)制得的不同濃度的熒光染液，分別加入到裝有相 同重量的氨基化微球的離心管中，得到若干組混合體系，均勻分散后在4°C 25°C條件下 搖動(dòng)并避光進(jìn)行熒光標(biāo)記0. 5 8小時(shí)，將熒光編碼的氨基化微球洗滌3次，-20 4°C、避 光保存。上述步驟(4)中所取熒光染液體積為1 100ml，離心管中氨基化微球的裝入量為 0. 1 10mg，氨基化微球的直徑為0. 5 50微米。本發(fā)明的上述方法，使用不同濃度的熒光染料標(biāo)記氨基化微球，可實(shí)現(xiàn)氨基化微 球的熒光編碼，在激發(fā)光激發(fā)下，發(fā)射不同強(qiáng)度的的發(fā)射光，能應(yīng)用于流式微球陣列。所述的無機(jī)鈉鹽選自Na2HP04、NaH2P04、NaCl、Na2S04、NaHS04、NaHS03、Na2S03、Na2C03、 NaHC03、Na2B4O7 之一或組合，所述的無機(jī)鉀鹽選自 K2HP04、KH2PO4, KC1、K2SO4, KHSO4, K2CO3> KHCO3> KHSO3> K2SO3 之一或組合。所述的熒光染料選自異硫氰酸熒光素(FITC)、Alexa Fluor 488染料之一。所述的有機(jī)溶劑選自乙醇、丙酮、乙醚、苯、二硫化碳、二氯甲烷、吡啶、二氧六環(huán)、 四氫呋喃、苯、石油醚、乙酸乙酯、含硫有機(jī)溶劑、氯仿、酰胺類溶劑中的一種或多種。所述的微球材料為聚苯乙烯、聚苯乙烯共聚物、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺共聚物、 聚丙烯酸酯、聚丙烯酸酯共聚物、聚糖或聚糖共聚物。所述的氨基化微球?yàn)樵谖⑶虿牧蟽?nèi) 部或表面攜帶氨基基團(tuán)的微球，或者是在所述的微球材料內(nèi)部及表面均攜帶氨基基團(tuán)的微 球。優(yōu)選的，所述的氨基化微球是5 10微米氨基化聚苯乙烯微球，10 15微米攜帶 氨基的聚丙烯酰胺微球，0. 5 1微米的氨基化聚丙烯酸酯微球。本發(fā)明所述的氨基化微球可以通過市場購買，也可以使用常規(guī)方法制備。如單分散法制備氨基化聚苯乙烯微球，在帶有攪拌裝置、通氮?dú)馊芤旱娜跓?中，加入穩(wěn)定劑和溶劑，升溫并攪拌成無顆粒均相體系，再加入引發(fā)劑、單體、帶有氨基基 團(tuán)(-NH2)的有機(jī)化合物、其它有機(jī)化合物和交聯(lián)劑，保持溫度、氮?dú)鈿夥蘸蛿嚢杷俣?，聚?24-72小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，將聚合得到的樣品用離心機(jī)分離，棄去上層清液，然 后洗滌下層微球，再離心，棄去上層清液，如此反復(fù)3次洗滌，干燥微球，然后收集樣品并存 貯在IOOmL棕色瓶中。制備方法參見馮愛玲，吳道澄，吳紅，楊青艷.熒光素三元共聚納米 微粒的合成及其熒光性質(zhì).第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005 ;26 (4) :325-329。
攜帶氨基的聚丙烯酰胺微球，制備方法參見劉機(jī)關(guān)，倪忠斌，熊萬斌，徐亞鵬，封 姣，陳明清.聚丙烯酞胺交聯(lián)微球的制備及其粒徑影響因素.石油化工，2008;37(10) 1059-1063。本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案如下 (1)稱取無機(jī)鈉鹽溶于雙蒸水中，使摩爾濃度為0. 1M，pH 9. 0，配制熒光標(biāo)記緩沖 液；(2)將Img熒光染料溶于Iml有機(jī)溶劑中，配制熒光染料母液；(3)將步驟(2)制得的熒光染料母液加入到步驟(1)制得的熒光標(biāo)記緩沖液中，配 制成熒光染料濃度為 0. 2μ g/ml、0. 4μ g/ml、2. 5μ g/ml、5y g/ml、31. 25 μ g/ml、62. 5 μ g/ ml,781.25yg/ml的熒光染液；(4)取步驟(3)制得的不同濃度的熒光染液各Iml分別加入到裝有Img的直徑5. 4 微米氨基化微球的離心管中，得到若干組混合體系，均勻分散后在4°C條件下?lián)u動(dòng)并避光進(jìn) 行熒光標(biāo)記1小時(shí)，將熒光編碼的氨基化微球洗滌3次，4°C保存。本發(fā)明氨基化微球的熒光編碼方法，包括熒光染料、有機(jī)溶劑、熒光標(biāo)記緩沖液和 氨基化微球，其特點(diǎn)在于利用熒光標(biāo)記緩沖液和有機(jī)溶劑，不同濃度的熒光染料可以牢固 的標(biāo)記氨基化微球，實(shí)現(xiàn)氨基化微球的熒光編碼，在激發(fā)光激發(fā)下，熒光編碼微球可發(fā)射不 同強(qiáng)度的發(fā)射光，能應(yīng)用于流式微球陣列等生物技術(shù)領(lǐng)域。與現(xiàn)有方法比較，本發(fā)明的氨基 化微球的熒光編碼方法具有方法簡潔、熒光穩(wěn)定及變異系數(shù)小等顯著優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的方法是一種簡潔、有效、熒光強(qiáng)度易控、熒光結(jié)合穩(wěn)定的氨基化微球熒光 編碼方法，可廣泛應(yīng)用于流式微球陣列、液相芯片、熒光和激光共焦點(diǎn)掃描顯微鏡校準(zhǔn)品、 生物傳感器等領(lǐng)域。


圖1是0. 4 μ g/ml FITC熒光標(biāo)記的氨基化聚苯乙烯微球在激發(fā)波長=488/發(fā)射 波長=520 (Ex = 488/Em = 520)的熒光顯微鏡照片；圖2是5 μ g/ml FITC熒光標(biāo)記的氨基化聚苯乙烯微球在Ex = 488/Em = 520的 熒光顯微鏡照片；圖3是0.4yg/ml和5yg/ml FITC熒光編碼的2個(gè)氨基化聚苯乙烯微球 群流式點(diǎn)圖；圖 4 是 0. 2 μ g/ml,2. 5 μ g/ml 及 31. 25 μ g/ml Alexa Fluor 488 熒光編碼的 3 個(gè) 氨基化聚苯乙烯微球群流式點(diǎn)圖。
具體實(shí)施例方式下面給出本發(fā)明的實(shí)施例，這是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中使用的熒光染料FITC為Sigma公司產(chǎn)品，Alexa Fluor 488染料為 MolecularProbes 公司產(chǎn)品。實(shí)施例1、氨基化微球的熒光編碼方法本實(shí)施例中的氨基化微球是5. 4微米氨基化聚苯乙烯微球，是按現(xiàn)有技術(shù)制備 的，制備方法參見馮愛玲，吳道澄，吳紅，楊青艷.熒光素三元共聚納米微粒的合成及其熒光性質(zhì).第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005 ;26 (4) :325-329。稱取0. 358g Na2HPO4溶于IOml雙蒸水中，pH 9. 0，混勻，配制熒光標(biāo)記緩沖液；將 ImgFITC溶于Iml 二甲基亞楓中，配制FITC母液；再將一定量的FITC母液加入到熒光標(biāo)記 緩沖液中，配制0. 4 μ g/ml和5 μ g/ml FITC染液，分別取Iml FITC染液加入含Img氨基化 聚苯乙烯微球的離心管中，混勻，避光、室溫、搖動(dòng)染色2小時(shí)，制得2群熒光編碼微球，計(jì)數(shù) 備用。由本實(shí)施例制備的兩群熒光編碼微球，可被488nm激發(fā)光激發(fā)，發(fā)射520nm發(fā)射光， 得到亮度不同的熒光顯微鏡照片(250x)圖1為0. 4μ g/ml FITC熒光標(biāo)記的氨基化聚苯 乙烯微球在Ex = 488/Em = 520的熒光顯微鏡照片；圖2為5 μ g/ml FITC熒光標(biāo)記的氨基 化聚苯乙烯微球在Ex = 488/Em = 520的熒光顯微鏡照片；圖3為0. 4 μ g/ml和5 μ g/ml FITC熒光編碼的R2和R3氨基化聚苯乙烯微球群流式點(diǎn)圖，在FL2 vs FLl流式點(diǎn)圖中FLl 的熒光強(qiáng)度分別為15. 29和38. 93。實(shí)施例2、氨基化微球同實(shí)施例1。氨基化微球的熒光編碼方法，步驟如下 稱取0. 084g NaHCO3溶于IOml雙蒸水中，pH 8.0,混勻，配制熒光標(biāo)記緩沖液；將 AlexaFluor 488 Img溶于Iml 二甲基亞楓中，配制Alexa Fluor 488母液；使用一定量的 Alexa Fluor488母液溶于熒光標(biāo)記緩沖液中，配制0. 2 μ g/ml、2. 5 μ g/ml及31. 25 μ g/ml Alexa Fluor 488染液，分別取Iml Alexa Fluor 488染液加入含Img氨基化聚苯乙烯微球 的離心管中，混勻，避光、室溫、搖動(dòng)染色2小時(shí)，制得3群熒光編碼微球，計(jì)數(shù)備用。由本實(shí) 施例制備的三群熒光編碼微球，可被流式細(xì)胞儀488nm激發(fā)光激發(fā)，發(fā)射520nm發(fā)射光，得 到亮度不同的微球群圖 4 為 0. 2 μ g/ml、2. 5 μ g/ml 及 31. 25 μ g/ml Alexa Fluor 488 熒 光編碼的R2、R3和R4氨基化聚苯乙烯微球群流式點(diǎn)圖，在FL2 vs FLl流式點(diǎn)圖中FLl的 熒光強(qiáng)度分別為12. 5,56. 96和162. 13。實(shí)施例3、氨基化微球的熒光編碼方法本實(shí)施例中的氨基化微球是直徑10微米攜帶氨基的聚丙烯酰胺微球，制備方法 參見劉機(jī)關(guān)，倪忠斌，熊萬斌，徐亞鵬，封姣，陳明清.聚丙烯酰胺交聯(lián)微球的制備及其粒 徑影響因素.石油化工，2008 ;37 (10) :1059-1063。稱取0. Ig Na2CO3溶于IOml雙蒸水中，pH 9. 0，混勻，配制熒光標(biāo)記緩沖液；將Img FITC溶于Iml 二甲基亞楓中，配制FITC母液；再將一定量的FITC母液加入到熒光標(biāo)記緩 沖液中，配制0. 2 μ g/ml和5 μ g/ml FITC染液，分別取Iml FITC染液加入含Img攜帶氨基 聚丙烯酰胺微球的離心管中，混勻，避光、室溫、搖動(dòng)染色1小時(shí)，制得2群熒光編碼微球，計(jì) 數(shù)備用。由本實(shí)施例制備的兩群熒光編碼微球，可被流式細(xì)胞儀488nm激發(fā)光激發(fā)，發(fā)射 520nm發(fā)射光，0. 2 μ g/ml和5 μ g/ml FITC熒光標(biāo)記的2個(gè)攜帶氨基聚丙烯酰胺微球群在 FL2 vs FLl流式點(diǎn)圖中FLl的熒光強(qiáng)度分別為10. 61和40. 28。實(shí)施例4、氨基化微球的熒光編碼方法本實(shí)施例中的氨基化微球是直徑0. 5微米的氨基化聚丙烯酸酯微球，購自深圳 納微科技有限公司。稱取0. Ig Na2CO3溶于IOml雙蒸水中，pH 9. 0，混勻，配制熒光標(biāo)記緩沖液；將Img FITC溶于Iml 二甲基亞楓中，配制FITC母液；再將一定量的FITC母液加入到熒光標(biāo)記緩沖 液中，配制0. 2 μ g/ml和5 μ g/ml FITC染液，分別取Iml FITC染液加入含Img氨基化聚丙 烯酸酯微球的離心管中，混勻，避光、室溫、搖動(dòng)染色2小時(shí)，制得2群熒光編碼微球，計(jì)數(shù)備用。由本實(shí)施例制備的兩種熒光編碼微球，可被流式細(xì)胞儀488nm激發(fā)光激發(fā)，發(fā)射520nm 發(fā)射光，0.2yg/ml和5yg/ml FITC熒光標(biāo)記的2個(gè)氨基化聚丙烯酸酯微球群在FL2vs FLl 流式點(diǎn)圖中FLl的熒光強(qiáng)度分別為9. 53和44. 76 。
權(quán)利要求
一種氨基化微球的熒光編碼方法，步驟如下(1)稱取無機(jī)鉀鹽或無機(jī)鈉鹽溶于雙蒸水中，使其摩爾濃度為0.01～1M，pH4～10，制得熒光標(biāo)記緩沖液；(2)將0.1～10mg熒光染料溶于0.1～10ml有機(jī)溶劑中，制得熒光染料母液；(3)將步驟(2)制得的熒光染料母液加入到步驟(1)制得的熒光標(biāo)記緩沖液中，配制不同濃度的熒光染液，熒光染液中的熒光染料濃度范圍為0.1～1000μg/ml；(4)分別取相同體積的步驟(3)制得的不同濃度的熒光染液分別加入到裝有相同重量的氨基化微球的離心管中，得到若干組混合體系，均勻分散后在4℃～25℃條件下?lián)u動(dòng)并避光進(jìn)行熒光標(biāo)記0.5～8小時(shí)，將熒光編碼的氨基化微球洗滌3次，-20～4℃、避光保存。
2.如權(quán)利要求1所述的氨基化微球的熒光編碼方法，其特征在于所述的無機(jī)鈉鹽選自 Na2HPO4, NaH2PO4, NaCUNa2SO4, NaHSO4, NaHS03、Na2S03、Na2C03、NaHCO3> Na2B4O7 之一或組合。
3.如權(quán)利要求1所述的氨基化微球的熒光編碼方法，其特征在于所述的無機(jī)鉀鹽選自 K2HPO4, KH2PO4, KCUK2SO4, KHSO4, K2CO3> KHCO3> KHSO3> K2SO3 之一或組合。
4.如權(quán)利要求1所述的氨基化微球的熒光編碼方法，其特征在于所述的熒光染料選自 異硫氰酸熒光素(FITC)、Alexa Fluor 488染料之一。
5.如權(quán)利要求1所述的氨基化微球的熒光編碼方法，其特征在于所述的有機(jī)溶劑選 自乙醇、丙酮、乙醚、苯、二硫化碳、二氯甲烷、吡啶、二氧六環(huán)、四氫呋喃、苯、石油醚、乙酸乙 酯、含硫有機(jī)溶劑、氯仿、酰胺類溶劑中的一種或多種。
6.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的氨基化微球的熒光編碼方法，其特征在于所述的微球 材料為聚苯乙烯、聚苯乙烯共聚物、聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺共聚物、聚丙烯酸酯或聚丙烯 酸酯共聚物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種氨基化微球的熒光編碼方法，利用熒光標(biāo)記緩沖液和熒光染料母液配制的不同濃度的熒光染料可以牢固的標(biāo)記氨基化微球，實(shí)現(xiàn)氨基化微球的熒光編碼，在激發(fā)光激發(fā)下，熒光編碼微球可發(fā)射不同強(qiáng)度的發(fā)射光，能應(yīng)用于流式微球陣列等生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的氨基化微球的熒光編碼方法具有方法簡潔、熒光穩(wěn)定及變異系數(shù)小等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C09K11/06GK101846676SQ20101016637
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月10日
發(fā)明者蘭文軍, 王海燕 申請(qǐng)人:山東輕工業(yè)學(xué)院