一種表面等離子體共振(spr)生物傳感芯片的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種表面等離子體共振SPR生物傳感芯片的制備方法，通過(guò)在鍍有50nm金膜的基質(zhì)玻璃片上依次組裝L-半胱氨酸、納米金和牛血清白蛋白偶聯(lián)的抗原分子，即制得SPR生物傳感芯片。本發(fā)明簡(jiǎn)單、快速，成本低，不需要繁瑣的活化處理，適合檢測(cè)三聚氰胺、鹽酸克倫特羅和氨芐青霉素等多種微量小分子物質(zhì)，再生性能好，可廣泛應(yīng)用于食品安全、環(huán)境和生物科學(xué)等領(lǐng)域。
【專利說(shuō)明】—種表面等離子體共振(SPR)生物傳感芯片的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及光學(xué)傳感器芯片制備領(lǐng)域，具體是一種表面等離子體共振SPR生物傳感芯片的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]表面等離子體共振(SPR)是一種物理光學(xué)現(xiàn)象，20世紀(jì)90年代后發(fā)展成為一種研究生物分子相互作用的新技術(shù)。其技術(shù)原理為在傳感芯片表面固定一層生物分子，當(dāng)待測(cè)樣品流過(guò)芯片表面時(shí)，樣品中與芯片表面生物分子相互作用的分子結(jié)合在一起而引起金屬膜表面折射率或厚度的變化，最終表現(xiàn)為SPR共振角度的變化，據(jù)此可以獲得目標(biāo)分析物的濃度、親和力、動(dòng)力學(xué)常數(shù)和特異性等信息。SPR技術(shù)具有靈敏度高、檢測(cè)速度快、樣品消耗量小、前處理簡(jiǎn)單、無(wú)需生物標(biāo)記等優(yōu)勢(shì)，在快速分析領(lǐng)域具有巨大的潛力，也可廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物、環(huán)境、食品、醫(yī)療、制藥等行業(yè)。
[0003]傳感芯片是SPR技術(shù)儀器的核心單元之一，決定著該儀器的操作簡(jiǎn)易性、可靠性和應(yīng)用范圍。目前市面上所用的SPR傳感芯片價(jià)格昂貴，制作工藝繁瑣且很難檢測(cè)微量小分子物質(zhì)，這無(wú)形中增加了儀器使用成本，降低了儀器利用效率，大大制約了 SPR技術(shù)的廣泛應(yīng)用。低成本、制備工藝簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、能檢測(cè)微量小分子物質(zhì)的新型SPR傳感芯片不僅使檢測(cè)成本大大降低，而且使用方便，應(yīng)用范圍將得到很大的擴(kuò)展。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種表面等離子體共振SPR生物傳感芯片的制備方法，具有制作成本低、檢測(cè)速度快、能檢測(cè)微量小分子的優(yōu)點(diǎn)。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0006]一種SPR生物傳感芯片，采用多層自組裝方式制作，芯片層次結(jié)構(gòu)從上到下依次為目標(biāo)分析物的抗原、牛血清白蛋白或抗體、納米金、L-半胱氨酸、納米金、L-半胱氨酸、金膜、玻璃基質(zhì)。
[0007]所述的SPR生物傳感芯片的制備方法，具體步驟為:
[0008]I)先在鍍有金膜的玻璃基質(zhì)表面自組裝上一層L-半胱氨酸，接著將納米金連接到L-半胱氨酸的氨基上，重復(fù)上述步驟；
[0009]2)最后將抗體或牛血清白蛋白偶聯(lián)的抗原連接到納米金上；
[0010]3)裸露的納米金用磷酸鹽緩沖液配制的牛血清白蛋白封閉，即得。
[0011]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:將鍍有金膜的玻璃基質(zhì)依次在濃度為0.5-5%的L-半胱氨酸溶液、濃度為100mg.Γ1的納米金溶液以及濃度為l_5mg.mL—1的牛血清白蛋白偶聯(lián)物溶液中浸泡或滴加，即得。
[0012]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述金膜依次在L-半胱氨酸中浸泡2-8小時(shí)，在納米金溶液浸泡2-8小時(shí)，在牛血清白蛋白偶聯(lián)物溶液中浸泡2-8小時(shí)。
[0013]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述金膜的厚度為20_100nm。
[0014]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述L-半胱氨酸溶液為L(zhǎng)-半胱氨酸的乙酸溶液。
[0015]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述納米金溶液為納米金的水溶液。
[0016]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述牛血清白蛋白偶聯(lián)物溶液由磷酸鹽緩沖液配制。
[0017]作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述納米金的直徑為15_50nm。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明對(duì)微量目標(biāo)小分子具有高靈敏性和選擇特異性；制備方法簡(jiǎn)單，造價(jià)極其低廉，反應(yīng)時(shí)間短，無(wú)毒無(wú)污染，便于推廣；再生性能好，可多次重復(fù)使用，保存時(shí)間長(zhǎng)；檢測(cè)樣品速度快；其優(yōu)秀的響應(yīng)效率和特異性使其廣泛適用于食品違法添加劑、環(huán)境污染物和生命科學(xué)目標(biāo)分子的檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)采用直接法或競(jìng)爭(zhēng)抑制法，芯片一次制備多次使用，且使用前不需要活化，這將為食品違法添加劑、環(huán)境污染物檢測(cè)和生命科學(xué)目標(biāo)分子的研究提供了技術(shù)支持和實(shí)踐依據(jù)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1是SPR生物傳感芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0020]圖2是SPR生物傳感芯片在SPR生化分析儀上的響應(yīng)圖譜；
[0021 ] 圖3是實(shí)施例2的SPR生物傳感芯片的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；
[0022]圖中:1_抗原、2-牛血清白蛋白、3-納米金、4-L-半胱氨酸、5-金膜、6-玻璃基質(zhì)、7-抗體；a為磷酸鹽緩沖液響應(yīng)曲線，b為待測(cè)樣品響應(yīng)曲線，Λ Θ為入射光角度偏移量。

【具體實(shí)施方式】
[0023]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0024]實(shí)施例1
[0025]請(qǐng)參閱圖1，本發(fā)明實(shí)施例中，一種SPR生物傳感芯片，采用多層自組裝方式制作，芯片層次結(jié)構(gòu)從上到下依次為目標(biāo)分析物的抗原1、牛血清白蛋白2或抗體7、納米金3、L-半胱氨酸4、納米金3、L-半胱氨酸4、金膜5、玻璃基質(zhì)6。其中納米金的直徑為15_50nm。
[0026]所述的SPR生物傳感芯片的制備方法，具體步驟為:
[0027]I)先在鍍有金膜5的玻璃基質(zhì)6表面自組裝上一層L-半胱氨酸4，接著將納米金3連接到L-半胱氨酸4的氨基上，重復(fù)上述步驟；
[0028]2)最后將抗體7或牛血清白蛋白2偶聯(lián)的抗原I連接到納米金3上；
[0029]3)裸露的納米金3用磷酸鹽緩沖液配制的牛血清白蛋白2封閉，即得。
[0030]所述的SPR生物傳感芯片的制備方法，具體工藝為將鍍有金膜5的玻璃基質(zhì)6依次在濃度為0.5-5%的L-半胱氨酸4溶液中浸泡2-8小時(shí)，在濃度為100mg.Γ1的納米金3溶液浸泡2-8小時(shí)，在濃度為l_5mg -πιΓ1的牛血清白蛋白2偶聯(lián)物溶液中浸泡2_8小時(shí)，其中微量液體采用滴加的方法。
[0031]請(qǐng)參閱圖2，采用SPR生化分析儀對(duì)本發(fā)明實(shí)施例制備的SPR生物傳感芯片進(jìn)行分析，其中a為磷酸鹽緩沖液響應(yīng)曲線，b為待測(cè)樣品響應(yīng)曲線，△ Θ為入射光角度偏移量。從圖2中可以看出明顯的共振峰，共振角產(chǎn)生于光的反射率明顯降低的時(shí)候。結(jié)果顯示，磷酸鹽緩沖液、待測(cè)樣品通過(guò)該SPR生物傳感芯片時(shí)的共振角分別為67.1°和67.4°。從圖中還可以看出，磷酸鹽緩沖液的入射光角度偏移量與待測(cè)樣品的入射光角度偏移量的差值即Λ Θ為0.3°，約合3000RIU的響應(yīng)，考慮采用的SPR生化分析儀的響應(yīng)靈敏度為I X 10_5RIU，說(shuō)明本發(fā)明制備的SPR生物傳感芯片靈敏度高和選擇特異性好。
[0032]實(shí)施例2
[0033]采用本發(fā)明制備的SPR生物傳感芯片檢測(cè)牛奶中三聚氰胺含量的操作方法，具體步驟如下:
[0034]⑷樣品處理方法:
[0035](Al)取50 μ L牛奶于2mL離心管中，加入950 μ L無(wú)水乙醇，旋渦混勻30s，靜置2min后，取上清液用于下一步處理；
[0036](A2)取100 μ L上述上清液于ImL離心管，70°C烘干或自然風(fēng)干后加入100 μ L磷酸鹽緩沖液(pH = 7.4)70°C充分溶解后待測(cè)。
[0037](B)儀器檢測(cè)方法
[0038](BI)將制備好的SPR生物傳感芯片插入SPR生化分析儀檢測(cè)通道；
[0039]分別進(jìn)樣0、6.25、12.5、25、50、10nM含恒定過(guò)量濃度三聚氰胺抗體的三聚氰胺溶液，記錄SPR響應(yīng)信號(hào)并制作校準(zhǔn)曲線，如圖3所示；
[0040](B2)根據(jù)㈧樣品處理方法，將待測(cè)樣品進(jìn)行預(yù)處理；
[0041](B3)將(B2)中的預(yù)處理樣品加入恒定濃度的三聚氰胺抗體混勻，37°C孵育I小時(shí)；
[0042](B4)將(B3)中混合液注入SPR生化分析儀檢測(cè)通道，記錄SPR響應(yīng)信號(hào)的相對(duì)響應(yīng)值RU ；
[0043](B5)根據(jù)樣品的SPR響應(yīng)信號(hào)即可從校準(zhǔn)曲線確定樣品中的三聚氰胺濃度；
[0044](B6)繼續(xù)往SPR生化分析儀檢測(cè)通道注射氫氧化鈉溶液，將SPR生物傳感芯片表面再生，為下一個(gè)樣品的檢測(cè)做準(zhǔn)備。
[0045]請(qǐng)參閱圖3，本發(fā)明實(shí)施例制備的SPR生物傳感芯片檢測(cè)牛奶中的三聚氰胺反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。從圖中可以看出，SPR響應(yīng)信號(hào)的相對(duì)響應(yīng)值隨著待測(cè)樣品濃度的增加而降低，具體為待測(cè)樣品三聚氰胺的濃度在O-lOOng/mL范圍內(nèi)時(shí)，兩者并不是成線性關(guān)系，根據(jù)計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的二元回歸方程為y = 0.1197x2-7.9885x+139.75，其中判定系數(shù)R2為
0.9993，即采用該二元回歸方程來(lái)表示標(biāo)準(zhǔn)曲線的精度為0.9993，誤差非常小。尤其在待測(cè)樣品三聚氰胺的濃度低時(shí)，本發(fā)明實(shí)施例制備的SPR生物傳感芯片的SPR響應(yīng)信號(hào)的相對(duì)響應(yīng)值較高，說(shuō)明該SPR生物傳感芯片能夠檢測(cè)出待測(cè)樣品中所含有的微量的三聚氰胺小分子。
[0046]本發(fā)明對(duì)微量目標(biāo)小分子具有高靈敏性和選擇特異性；制備方法簡(jiǎn)單，造價(jià)極其低廉，反應(yīng)時(shí)間短，無(wú)毒無(wú)污染，便于推廣；再生性能好，可多次重復(fù)使用，保存時(shí)間長(zhǎng)；檢測(cè)樣品速度快；其優(yōu)秀的響應(yīng)效率和特異性使其廣泛適用于食品違法添加劑、環(huán)境污染物和生命科學(xué)目標(biāo)分子的檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)采用直接法或競(jìng)爭(zhēng)抑制法，芯片一次制備多次使用，且使用前不需要活化，這將為食品違法添加劑、環(huán)境污染物檢測(cè)和生命科學(xué)目標(biāo)分子的研究提供了技術(shù)支持和實(shí)踐依據(jù)。
[0047]對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無(wú)論從哪一點(diǎn)來(lái)看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說(shuō)明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
[0048]此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說(shuō)明書按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說(shuō)明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見(jiàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說(shuō)明書作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。
【權(quán)利要求】
1.一種SPR生物傳感芯片，其特征在于，采用多層自組裝方式制作，芯片層次結(jié)構(gòu)從上到下依次為目標(biāo)分析物的抗原(I)、牛血清白蛋白(2)或抗體(7)、納米金(3)、L-半胱氨酸(4)、納米金(3)、L-半胱氨酸⑷、金膜(5)、玻璃基質(zhì)(6)。
2.一種如權(quán)利要求1所述的SPR生物傳感芯片的制備方法，其特征在于，具體步驟為: 1)先在鍍有金膜(5)的玻璃基質(zhì)(6)表面自組裝上一層L-半胱氨酸(4)，接著將納米金(3)連接到L-半胱氨酸(4)的氨基上，重復(fù)上述步驟； 2)最后將抗體(7)或牛血清白蛋白(2)偶聯(lián)的抗原(I)連接到納米金(3)上； 3)裸露的納米金(3)用磷酸鹽緩沖液配制的牛血清白蛋白(2)封閉，即得。
3.—種如權(quán)利要求2所述的SPR生物傳感芯片的制備方法，其特征在于，將鍍有金膜(5)的玻璃基質(zhì)(6)依次在濃度為0.5-5%的L-半胱氨酸(4)溶液、濃度為100mg -Γ1的納米金⑶溶液以及濃度為l-Smg.!!^1的牛血清白蛋白(2)偶聯(lián)物溶液中浸泡或滴加，即得。
4.一種如權(quán)利要求2所述的SPR生物傳感芯片的制備方法，其特征在于，所述金膜(5)依次在L-半胱氨酸(4)中浸泡2-8小時(shí)，在納米金(3)溶液浸泡2-8小時(shí)，在牛血清白蛋白(2)偶聯(lián)物溶液中浸泡2-8小時(shí)。
5.—種如權(quán)利要求2所述的SPR生物傳感芯片的制備方法,其特征在于,所述金膜(5)的厚度為20-100nm。
6.一種如權(quán)利要求2所述的SPR生物傳感芯片的制備方法，其特征在于，所述L-半胱氨酸(4)溶液為L(zhǎng)-半胱氨酸(4)的乙酸溶液。
7.—種如權(quán)利要求2所述的SPR生物傳感芯片的制備方法，其特征在于，所述納米金(3)溶液為納米金(3)的水溶液。
8.—種如權(quán)利要求2所述的SPR生物傳感芯片的制備方法，其特征在于，所述牛血清白蛋白(2)偶聯(lián)物溶液由磷酸鹽緩沖液配制。
9.一種如權(quán)利要求2所述的SPR生物傳感芯片的制備方法，其特征在于，所述納米金(3)的直徑為15-50nm。
【文檔編號(hào)】G01N21/552GK104359870SQ201410699155
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月28日
【發(fā)明者】蘇暉, 崔政, 閆安, 隗瑋, 鄧紹立, 廉雙秋, 蘇宇梵 申請(qǐng)人:北京中龍益誠(chéng)科技有限公司