檢測(cè)人HSP90α-1蛋白的熒光免疫層析試紙及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬于多肽化學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及人熱休克蛋白90α-1(HSP90α-1)抗原表位肽、用該抗原表位肽制備的HSP90α-1特異性抗原和相應(yīng)的單克隆抗體或多克隆抗體、所述抗體在制備人HSP90α-1體外診斷試劑盒上的應(yīng)用，人HSP90α-1體外診斷試劑盒，以及一種用于定量檢測(cè)待測(cè)物中人HSP90α-1蛋白的熒光免疫層析試紙及其制備方法。

背景技術(shù)：
近年來(lái)，對(duì)腫瘤標(biāo)志物的研究已經(jīng)引起許多研究者的注意。尋找一種可靠的、非侵入式的、能反映腫瘤的發(fā)生、增殖分化的腫瘤標(biāo)志物是眾多研究者的共同心愿。通過(guò)對(duì)血液、組織液的研究，目前發(fā)現(xiàn)一些腫瘤標(biāo)志物可以對(duì)腫瘤的發(fā)生、增殖分化進(jìn)行預(yù)測(cè)。其中，人熱休克蛋白90α-1(HSP90α-1)就是這樣的一種腫瘤標(biāo)志物。熱休克蛋白90α-1是熱休克蛋白家族中的重要蛋白之一，其作為分子伴侶來(lái)參與調(diào)控、維持細(xì)胞內(nèi)多種蛋白的構(gòu)象和功能，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡等方面發(fā)揮重要的作用。近年發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白90α-1作為伴侶蛋白對(duì)腫瘤的惡性轉(zhuǎn)變、生長(zhǎng)、增殖及侵襲有著重要的作用。有許多報(bào)道證實(shí)，人體腫瘤組織中，熱休克蛋白的表達(dá)發(fā)生了改變。在不同部位的腫瘤組織中，熱休克蛋白表達(dá)的改變并不一致。目前發(fā)現(xiàn)腫瘤病人血清中的HSP90α-1含量與腫瘤的惡性程度，尤其是轉(zhuǎn)移正相關(guān)。因此，HSP90α-1有希望作為腫瘤診斷和預(yù)后的標(biāo)志物。檢測(cè)血清中的HSP90α-1水平的最理想的方法為免疫檢測(cè)。因此，尋找合適的具有免疫原性的HSP90α-1抗原表位肽、制備特異性的HSP90α-1抗原及抗體即成了重點(diǎn)。熒光免疫層析方法測(cè)血液中的待測(cè)物操作簡(jiǎn)便、快速，只需10分鐘就能完成樣品檢測(cè)，并且檢測(cè)范圍寬，靈敏度好，能夠迅速及時(shí)地幫助診斷病情，監(jiān)測(cè)預(yù)后。中國(guó)專利申請(qǐng)No.200910117820.8公開(kāi)了一種熒光微球免疫層析試紙條的制備方法及定量檢測(cè)方法；中國(guó)專利申請(qǐng)No.200910047352.1公開(kāi)了一種熒光免疫層析試紙及其制備方法和應(yīng)用。然而，目前還沒(méi)有針對(duì)人HSP90α-1蛋白的熒光免疫層析試紙。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種用于定量檢測(cè)待測(cè)物中人HSP90α-1蛋白的熒光免疫層析試紙及其制備方法。具體而言，本發(fā)明提供了：一種用于定量檢測(cè)待測(cè)物中人HSP90α-1蛋白的熒光免疫層析試紙，該試紙通過(guò)雙抗體夾心法檢測(cè)所述人HSP90α-1蛋白，其中：所述雙抗體夾心法采用標(biāo)記有熒光微球的第一HSP90α-1單克隆抗體作為捕獲抗體，所述第一HSP90α-1單克隆抗體來(lái)源于人HSP90α-1抗原表位肽(1)和(2)中的一者；并且所述雙抗體夾心法采用第二HSP90α-1單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，所述第二HSP90α-1單克隆抗體來(lái)源于人HSP90α-1抗原表位肽(1)和(2)中的另一者；所述人HSP90α-1抗原表位肽(1)和(2)分別為：(1)Tyr-Pro-Arg-Asp-Arg-Leu-Asp-Pro-Arg-Pro-Gly-Ser-Pro-Ser-Glu-Ala-Ser；(2)Tyr-Arg-Gly-Ile-Asp-Glu-Asp-Asp-Pro-Thr-Ala-Asp-Asp-Thr-Ser-Ala-Ala-Val-Thr-Glu。優(yōu)選地，所述第一HSP90α-1單克隆抗體是由第一HSP90α-1抗原制備而成的，該第一HSP90α-1抗原是通過(guò)使所述人HSP90α-1抗原表位肽(1)和(2)中的一者與載體蛋白偶聯(lián)制備而成的；并且所述第二HSP90α-1單克隆抗體是由第二HSP90α-1抗原制備而成的，該第二HSP90α-1抗原是通過(guò)使所述人HSP90α-1抗原表位肽(1)和(2)中的另一者與載體蛋白偶聯(lián)制備而成的。優(yōu)選地，所述熒光微球的粒徑為320nm至400nm。優(yōu)選地，所述熒光微球上的熒光物質(zhì)為異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明或X-羅丹明等，其中優(yōu)選為X-羅丹明；所述熒光微球的微球材料為聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯的共聚物。優(yōu)選地，所述熒光微球的激發(fā)波長(zhǎng)為350～600nm，優(yōu)選為390nm；發(fā)射波長(zhǎng)為500～700nm，優(yōu)選為615nm。優(yōu)選地，所述熒光免疫層析試紙具有底板，并且在該底板上沿使用時(shí)的層析方向依次以接觸方式設(shè)置有：樣品墊、結(jié)合墊、反應(yīng)膜、吸水濾紙，所述結(jié)合墊設(shè)置有所述的標(biāo)記有熒光微球的第一HSP90α-1單克隆抗體，所述反應(yīng)膜包括檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述檢測(cè)區(qū)包被有所述第二HSP90α-1單克隆抗體，所述質(zhì)控區(qū)包被有能與所述的標(biāo)記有熒光微球的第一HSP90α-1單克隆抗體特異性結(jié)合的抗抗體。優(yōu)選地，所述反應(yīng)膜為在大于550nm的波長(zhǎng)下基本上不發(fā)熒光的硝酸纖維素膜。優(yōu)選地，所述底板基本上不具有熒光性質(zhì)。優(yōu)選地，所述抗抗體為羊抗鼠IgG單克隆抗體或兔抗鼠IgG單克隆抗體，其中優(yōu)選為羊抗鼠IgG單克隆抗體。本發(fā)明還提供了一種制備所述的用于定量檢測(cè)待測(cè)物中人HSP90α-1蛋白的熒光免疫層析試紙的方法，其包括以下步驟：1)提供標(biāo)記有熒光微球的第一HSP90α-1單克隆抗體；2)提供結(jié)合墊，其中在所述結(jié)合墊上包被所述的標(biāo)記有熒光微球的第一HSP90α-1單克隆抗體；3)提供反應(yīng)膜，其中在所述反應(yīng)膜上沿使用時(shí)的層析方向間隔固定第二HSP90α-1單克隆抗體和抗抗體，以分別形成檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)；4)在底板上沿使用時(shí)的層析方向依次以接觸方式設(shè)置樣品墊、所述結(jié)合墊、所述反應(yīng)膜、吸水濾紙，從而制成所述熒光免疫層析試紙。優(yōu)選地，所述步驟1)包括：a)用碳二亞胺活化熒光微球，優(yōu)選地，將熒光微球的水分散液或MES緩沖液分散液經(jīng)超聲波處理并與碳二亞胺混合，從而活化所述熒光微球；b)洗滌步驟a)所獲得的活化的熒光微球，優(yōu)選地，將步驟a)所獲得的活化的熒光微球用N-羥基硫代琥珀酰亞胺-檸檬酸緩沖液洗滌、分散，并經(jīng)超聲波處理；c)用步驟b)所獲得的熒光微球標(biāo)記第一HSP90α-1單克隆抗體，優(yōu)選地，將步驟b)所獲得的熒光微球與第一HSP90α-1單克隆抗體混合，用BSA-乙醇胺緩沖液封閉，離心，用BSA-吐溫水溶液分散，經(jīng)超聲波處理，從而得到標(biāo)記有熒光微球的第一HSP90α-1單克隆抗體。優(yōu)選地，在所述步驟2)中，所述的標(biāo)記有熒光微球的第一HSP90α-1單克隆抗體的包被濃度為0.5～2mg/ml。優(yōu)選地，在所述步驟3)中，所述檢測(cè)區(qū)和所述質(zhì)控區(qū)間隔3mm至8mm。優(yōu)選地，在所述步驟3)中，所述第二HSP90α-1單克隆抗體和所述抗抗體的包被濃度分別為0.5～2mg/ml。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果：1.本發(fā)明的人HSP90α-1抗原表位肽具有良好的抗原性，用其制備的抗原(免疫原)免疫動(dòng)物能夠產(chǎn)生高度特異性的單克隆抗體和多克隆抗體。2.用本發(fā)明制備的HSP90α-1單克隆抗體和多克隆抗體能夠高度特異地與血液樣本中的HSP90α-1結(jié)合。3.本發(fā)明的人HSP90α-1體外診斷試劑盒可以有效地檢測(cè)血清中的HSP90α-1的水平，可用來(lái)判斷腫瘤的惡性程度，并對(duì)轉(zhuǎn)移和預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)。4.本發(fā)明將熒光分析技術(shù)與快速層析免疫技術(shù)相結(jié)合，提供了一種用于定量檢測(cè)待測(cè)物中人HSP90α-1蛋白的熒光免疫層析試紙，用該試紙檢測(cè)待測(cè)物中的人HSP90α-1蛋白，操作簡(jiǎn)便、快速，只需10分鐘就能完成樣品檢測(cè)，并且檢測(cè)范圍寬、特異性高、靈敏度好，能夠迅速及時(shí)地幫助診斷病情，監(jiān)測(cè)預(yù)后。5.本發(fā)明在制備所述人HSP90α-1蛋白的熒光免疫層析試紙的過(guò)程中，通過(guò)大量的試驗(yàn)摸索，優(yōu)化了各方面的制備條件，使得用本發(fā)明的熒光免疫層析試紙進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，熒光信背比大大提高，從而提高了檢測(cè)靈敏度和結(jié)果可信度；此外，本發(fā)明還通過(guò)試紙的檢測(cè)區(qū)與質(zhì)控區(qū)的熒光強(qiáng)度比值的變化來(lái)反應(yīng)樣品中HSP90α-1的含量，這與傳統(tǒng)的層析技術(shù)只考查檢測(cè)區(qū)的絕對(duì)熒光強(qiáng)度相比，最大程度上減少了外界條件和背景等的影響，進(jìn)一步提高了檢測(cè)結(jié)果可信度。附圖說(shuō)明圖1示意性示出本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的熒光免疫層析試紙的結(jié)構(gòu)示意圖。具體實(shí)施方式以下通過(guò)具體實(shí)施方式的描述并參照附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但這并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。一、人HSP90α-1抗原表位肽本文中所述的人HSP90α-1蛋白是本領(lǐng)域已知的，其氨基酸序列是本領(lǐng)域已知的，可以在NCBI等專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)中查到。本發(fā)明提供了人HSP90α-1抗原表位肽(1)和(2)，其氨基酸序列分別如序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，為：(1)Y-P-R-D-R-L-D-P-R-P-G-S-P-S-E-A-S；和(2)Y-R-G-I-D-E-D-D-P-T-A-D-D-T-S-A-A-V-T-E。本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量的理論研究和實(shí)驗(yàn)摸索，最終篩選得到兩種具有良好的抗原性的抗原表位肽。HSP90α-1抗原表位肽(1)是人HSP90α-1(NCBI登錄號(hào)NP_001017963.2)N端第29至第45位(請(qǐng)確認(rèn))的一段含17個(gè)氨基酸的肽段。HSP90α-1抗原表位肽(2)包含人HSP90α-1蛋白(NCBI登錄號(hào)NP_001017963.2)C端第819位至第836位的肽段，并且在該肽段的N末端加上Y和R，從而構(gòu)成含20個(gè)氨基酸的HSP90α-1抗原表位肽(2)。這兩個(gè)肽段均具有親水性、抗原性強(qiáng)并且易于合成的特點(diǎn)。目前，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的HSP90α-1抗原表位肽具有如下功能：1.具有抗原性；2.與載體蛋白連接后作為免疫原刺激動(dòng)物產(chǎn)生特異性的抗體；3.用抗原表位肽制備的抗體可特異性地與人HSP90α-1結(jié)合。本發(fā)明的HSP90α-1抗原表位肽的制備方法可用化學(xué)合成法：利用美國(guó)ABI431A型多肽自動(dòng)合成儀，通過(guò)固相法合成抗原表位肽。本發(fā)明的抗原表位肽(1)和(2)的分子量分別為1898.91、2483.39，可用質(zhì)譜進(jìn)行確定，并通過(guò)多肽序列測(cè)定鑒定所合成的抗原表位肽序列。肽段的純度可用薄層色譜和高效液相色譜進(jìn)行評(píng)定，并測(cè)定抗原表位肽的濃度。二、HSP90α-1抗原本發(fā)明還提供了HSP90α-1抗原，其通過(guò)使本發(fā)明的人HSP90α-1抗原表位肽(1)和(2)中的一者與載體蛋白偶聯(lián)制備而成。具體而言，本發(fā)明提供了HSP90α-1抗原(1)和(2)，所述HSP90α-1抗原(1)通過(guò)使本發(fā)明的人HSP90α-1抗原表位肽(1)與載體蛋白偶聯(lián)制備而成；所述HSP90α-1抗原(2)通過(guò)使本發(fā)明的人HSP90α-1抗原表位肽(2)與載體蛋白偶聯(lián)制備而成。本發(fā)明的HSP90α-1抗原具有免疫原性和特異性，是一種免疫原，可用來(lái)免疫動(dòng)物從而制備特異性的HSP90α-1抗體。在本發(fā)明中，可用的載體蛋白的例子包括KLH(鑰孔血藍(lán)蛋白)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH(鑰孔血藍(lán)蛋白)免疫原性強(qiáng)，結(jié)合位點(diǎn)多，免疫效果較好，并且與免疫動(dòng)物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，用其作為載體蛋白不易引起交叉反應(yīng)，因此是優(yōu)選的。三、HSP90α-1單克隆抗體、HSP90α-1多克隆抗體和人HSP90α-1體外診斷試劑盒本發(fā)明還提供了人HSP90α-1單克隆抗體和人HSP90α-1多克隆抗體，所述抗體可以各自利用本發(fā)明的HSP90α-1抗原(1)或(2)(免疫原)免疫動(dòng)物制備而得。制備方法可采用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，具體可參見(jiàn)實(shí)施例2。本發(fā)明的HSP90α-1單克隆抗體和多克隆抗體可以用于制備人HSP90α-1體外診斷試劑盒，該試劑盒可以基于免疫方法對(duì)人體組織、細(xì)胞或體液中的HSP90α-1進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)選對(duì)血液標(biāo)本中的HSP90α-1進(jìn)行檢測(cè)。因此，本發(fā)明提供了一種人HSP90α-1體外診斷試劑盒，其包含本發(fā)明的人HSP90α-1單克隆抗體或多克隆抗體。目前已知可用于臨床檢驗(yàn)的免疫實(shí)驗(yàn)方法主要包括以下幾種：ELISA法、化學(xué)發(fā)光法、熒光層析法、膠體金免疫測(cè)定法等。而ELISA法包括以下幾種類(lèi)型：雙抗體夾心法檢測(cè)抗原、雙抗原夾心法檢測(cè)抗體、間接法測(cè)抗體、競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體、競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原、捕獲包被法測(cè)抗體等。本發(fā)明的人HSP90α-1體外診斷試劑盒優(yōu)選采用ELISA雙抗體夾心法來(lái)檢測(cè)HSP90α-1蛋白。該試劑盒可以包含包被抗體、結(jié)合抗體、酶標(biāo)記的第二抗體和/或必要的工具和試劑等。優(yōu)選的是，所述人HSP90α-1體外診斷試劑盒采用本發(fā)明的人HSP90α-1單克隆抗體作為包被抗體。在此，術(shù)語(yǔ)“包被抗體”是指包被于固相的酶標(biāo)板上的抗體。此外，所述人HSP90α-1體外診斷試劑盒還優(yōu)選包含人HSP90α-1多克隆抗體以作為結(jié)合抗體，其中，當(dāng)所述結(jié)合抗體來(lái)源于本發(fā)明的人HSP90α-1抗原表位肽(1)和(2)中的一者時(shí)，所述包被抗體來(lái)源于所述抗原表位肽(1)和(2)中的另一者。在此，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合抗體”是指試劑盒中可與待測(cè)抗原及酶標(biāo)記第二抗體結(jié)合的特異性抗體。所述試劑盒還可以包含酶標(biāo)記的第二抗體，該第二抗體可以為羊抗兔IgG抗體，所述酶標(biāo)記可以為辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等。在本發(fā)明的試劑盒中，還可以包含檢測(cè)所需的任何試劑或工具，例如預(yù)包被板、洗滌液、顯色劑、終止液等。四、用于定量檢測(cè)人HSP90α-1蛋白的熒光免疫層析試紙本發(fā)明還提供了一種用于定量檢測(cè)待測(cè)物中人HSP90α-1蛋白的熒光免疫層析試紙，該試紙通過(guò)雙抗體夾心法檢測(cè)所述人HSP90α-1蛋白，其中：所述雙抗體夾心法采用標(biāo)記有熒光微球的第一HSP90α-1單克隆抗體作為捕獲抗體，所述第一HSP90α-1單克隆抗體來(lái)源于人HSP90α-1抗原表位肽(1)和(2)中的一者；并且所述雙抗體夾心法還采用第二HSP90α-1單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，所述第二HSP90α-1單克隆抗體來(lái)源于人HSP90α-1抗原表位肽(1)和(2)中的另一者；所述人HSP90α-1抗原表位肽(1)和(2)分別為：(1)Tyr-Pro-Arg-Asp-Arg-Leu-Asp-Pro-Arg-Pro-Gly-Ser-Pro-Ser-Glu-Ala-Ser；(2)Tyr-Arg-Gly-Ile-Asp-Glu-Asp-Asp-Pro-Thr-Ala-Asp-Asp-Thr-Ser-Ala-Ala-Val-Thr-Glu。在本發(fā)明中，在雙抗體夾心法熒光免疫層析試紙中，“捕獲抗體”是指能夠首先特異性識(shí)別待測(cè)抗原的抗體，其通常設(shè)置在結(jié)合墊上；“檢測(cè)抗體”是指另一種能夠特異性識(shí)別待測(cè)抗原的抗體，其與捕獲抗體分別識(shí)別待測(cè)抗原分子上的不同的抗原表位，其通常固定在反應(yīng)膜的檢測(cè)區(qū)上。在本發(fā)明中，所述第一HSP90α-1單克隆抗體可以由第一HSP90α-1抗原制備而成，該第一HSP90α-1抗原可以通過(guò)使所述人HSP90α-1抗原表位肽(1)和(2)中的一者與載體蛋白偶聯(lián)制備而成；并且所述第二HSP90α-1單克隆抗體可以由第二HSP90α-1抗原制備而成，該第二HSP90α-1抗原可以通過(guò)使所述人HSP90α-1抗原表位肽(1)和(2)中的另一者與載體蛋白偶聯(lián)制備而成。在本發(fā)明中，可用的載體蛋白的例子包括KLH(鑰孔血藍(lán)蛋白)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH(鑰孔血藍(lán)蛋白)免疫原性強(qiáng)，結(jié)合位點(diǎn)多，免疫效果較好，并且與免疫動(dòng)物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，用其作為載體蛋白不易引起交叉反應(yīng)，因此是優(yōu)選的。優(yōu)選地，本發(fā)明的熒光免疫層析試紙中所用的熒光微球的粒徑為320nm至400nm，優(yōu)選為360nm，熒光微球上的熒光物質(zhì)可為異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明或X-羅丹明等，其中優(yōu)選為X-羅丹明(可購(gòu)自上海晶純公司)。熒光微球的微球材料可以為聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或由甲基丙烯酸甲酯與其它單體共聚形成的共聚物，其它單體的例子為苯乙烯等。熒光微球的激發(fā)波長(zhǎng)可以為350～600nm，優(yōu)選為390nm；發(fā)射波長(zhǎng)可以為500～700nm，優(yōu)選為615nm。在本發(fā)明中，熒光微球的最大激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)差值較大，說(shuō)明熒光微球有較大的斯托克斯(Stokes)位移，這樣，熒光試紙的背景干擾較低，以該微球做免疫層析標(biāo)記物有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的熒光免疫層析試紙具有底板，并且在該底板上沿使用時(shí)的層析方向依次以接觸方式設(shè)置有：樣品墊、結(jié)合墊、反應(yīng)膜、吸水濾紙，所述樣品墊用于在使用時(shí)加載待測(cè)樣品，所述結(jié)合墊設(shè)置有所述的標(biāo)記有熒光微球的第一HSP90α-1單克隆抗體，所述反應(yīng)膜包括檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，所述檢測(cè)區(qū)包被有所述第二HSP90α-1單克隆抗體，所述質(zhì)控區(qū)包被有能與所述的標(biāo)記有熒光微球的第一HSP90α-1單克隆抗體特異性結(jié)合的抗抗體。優(yōu)選地，本發(fā)明的熒光免疫層析試紙的樣品墊、結(jié)合墊、反應(yīng)膜、吸水濾紙可以沿使用時(shí)的層析方向依次搭接設(shè)置在底板上(參見(jiàn)圖1)。反應(yīng)膜上間隔設(shè)置的檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)可以為，但不限于，線、帶、塊等形式，檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)優(yōu)選間隔3mm至8mm。在本發(fā)明中，反應(yīng)膜優(yōu)選為在大于550nm的波長(zhǎng)下基本上不發(fā)熒光的硝酸纖維素膜(例如可購(gòu)自上海杰一，型號(hào)GFCP203000)。在本文中，“基本上不發(fā)熒光”的含義是指在相應(yīng)波長(zhǎng)(例如大于550nm的波長(zhǎng))的光照下不發(fā)射熒光，或者僅發(fā)射微量的、不實(shí)質(zhì)上影響檢測(cè)結(jié)果的熒光。此外，底板優(yōu)選基本上不具有熒光性質(zhì)，例如為基本上不具有熒光性質(zhì)的PVC背板(例如可購(gòu)自上海杰一，型號(hào)HF000MC100)。在本文中，“基本上不具有熒光性質(zhì)”是指不具有熒光性質(zhì)，或者僅具有低的、不實(shí)質(zhì)上影響檢測(cè)結(jié)果的熒光性質(zhì)。通常，常規(guī)的層析試紙組件(反應(yīng)膜、底板等)在550nm波長(zhǎng)下具有較明顯的熒光背景，這對(duì)熒光信號(hào)的檢測(cè)產(chǎn)生很大干擾。本發(fā)明通過(guò)采用在大于550nm的波長(zhǎng)下基本上不發(fā)熒光的硝酸纖維素膜和低熒光性質(zhì)的底板，從而克服了常規(guī)熒光試紙的缺陷。此外，本發(fā)明所用的熒光物質(zhì)X-羅丹明可產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號(hào)，從而進(jìn)一步大大提高了熒光信背比，使得能夠很好地區(qū)分信號(hào)和背景，進(jìn)而提高檢測(cè)靈敏度。在本發(fā)明中，樣品墊和結(jié)合墊的材料可采用本領(lǐng)域通常使用的材料，例如，樣品墊和結(jié)合墊可以為玻璃纖維。本發(fā)明所采用的能與標(biāo)記有熒光微球的第一HSP90α-1單克隆抗體特異性結(jié)合的抗抗體可以為羊抗鼠IgG單克隆抗體或兔抗鼠IgG單克隆抗體，其中優(yōu)選為羊抗鼠IgG單克隆抗體，與多克隆抗體相比，單克隆抗體特異性更高。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的熒光免疫層析試紙?jiān)谑褂脮r(shí)，在樣品墊上滴加樣品液(如含有HSP90α-1的血樣)，在毛細(xì)管作用下，樣品液向吸水濾紙一端移動(dòng)，在結(jié)合墊處與所述的標(biāo)記有熒光微球的第一HSP90α-1單克隆抗體形成免疫復(fù)合物，該免疫復(fù)合物進(jìn)一步移動(dòng)，在檢測(cè)線上與所述第二HSP90α-1單克隆抗體結(jié)合形成雙抗體夾心的免疫復(fù)合物，而未形成免疫復(fù)合物的標(biāo)記有熒光微球的第一HSP90α-1單克隆抗體則與質(zhì)控線上的抗抗體結(jié)合。此過(guò)程需要10分鐘至15分鐘，之后，用熒光檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，如果質(zhì)控線處未出現(xiàn)條帶，則說(shuō)明試紙失效；如果質(zhì)控線處出現(xiàn)條帶，而檢測(cè)線處未出現(xiàn)條帶，則說(shuō)明樣品中不含人HSP90α-1蛋白；如果在質(zhì)控線和檢測(cè)線上均出現(xiàn)條帶，則說(shuō)明樣品中含有人HSP90α-1蛋白。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種制備用于定量檢測(cè)待測(cè)物中人HSP90α-1蛋白的熒光免疫層析試紙的方法，其包括以下步驟：1)提供標(biāo)記有熒光微球的第一HSP90α-1單克隆抗體；2)提供結(jié)合墊，其中在所述結(jié)合墊上包被所述的標(biāo)記有熒光微球的第一HSP90α-1單克隆抗體；3)提供反應(yīng)膜，其中在所述反應(yīng)膜上沿使用時(shí)的層析方向間隔固定第二HSP90α-1單克隆抗體和抗抗體，以分別形成檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)；和4)在底板上沿使用時(shí)的層析方向依次以接觸方式設(shè)置樣品墊、所述結(jié)合墊、所述反應(yīng)膜、吸水濾紙，從而制成所述熒光免疫層析試紙。本發(fā)明的方法還可以包括將制成的熒光免疫層析試紙切割成適當(dāng)寬度的步驟5)。本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)大量的試驗(yàn)摸索，優(yōu)化了制備本發(fā)明的用于檢測(cè)人HSP90α-1蛋白的熒光免疫層析試紙的方法的各個(gè)步驟的條件，從而使得本發(fā)明的熒光免疫層析試紙能夠針對(duì)人HSP90α-1蛋白獲得符合臨床檢測(cè)要求的結(jié)果，即，檢測(cè)范圍寬、特異性高、靈敏度好。因此，優(yōu)選的是，在本發(fā)明的方法中，所述步驟1)包括：a)用碳二亞胺活化熒光微球，優(yōu)選地，將熒光微球的水分散液或MES緩沖液分散液經(jīng)超聲波處理并與碳二亞胺混合，從而活化所述熒光微球；b)洗滌步驟a)所獲得的活化的熒光微球，優(yōu)選地，將步驟a)所獲得的活化的熒光微球用N-羥基硫代琥珀酰亞胺-檸檬酸緩沖液洗滌、分散，并經(jīng)超聲波處理；c)用步驟b)所獲得的熒光微球標(biāo)記第一HSP90α-1單克隆抗體，優(yōu)選地，將步驟b)所獲得的熒光微球與第一HSP90α-1單克隆抗體混合，用BSA-乙醇胺緩沖液封閉，離心，用BSA-吐溫水溶液分散，經(jīng)超聲波處理，從而得到標(biāo)記有熒光微球的第一HSP90α-1單克隆抗體。在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述步驟1)包括：a)取1(w/v)％的熒光微球水分散液，10000rpm至15000rpm低溫(例如10℃)離心5至10分鐘，去上清，將沉淀物分散到500μl的蒸餾水或初洗緩沖液(0.1M的MES水溶液)中，超聲波(240W)處理1至2分鐘，重復(fù)以上過(guò)程三次，加入碳二亞胺10mg至50mg，攪拌10～15分鐘，從而活化所述熒光微球；b)洗滌步驟a)所獲得的活化的熒光微球，優(yōu)選地，將步驟a)所獲得的活化的熒光微球在1000rpm至15000rpm下離心5至10分鐘，將沉淀物分散到1ml偶聯(lián)緩沖液(20～100mM的N-羥基硫代琥珀酰亞胺-檸檬酸緩沖液))中，超聲波(240W)處理1至2分鐘，重復(fù)以上過(guò)程三次；c)用步驟b)所獲得的熒光微球標(biāo)記第一HSP90α-1單克隆抗體，優(yōu)選地，按照1μl至3μl抗體(8mg/ml)/100μl所述活化的熒光微球的比例，將步驟b)所獲得的熒光微球與第一HSP90α-1單克隆抗體混合，室溫(25℃)下攪拌1.5～3小時(shí)(優(yōu)選2小時(shí))，加入1...