一種蚯蚓血細(xì)胞涂片的制作方法
【專利摘要】一種蚯蚓血細(xì)胞涂片的制作方法，涉及一種土壤污染生態(tài)毒理診斷涂片的制作方法，所述方法包括蚯蚓取血、涂片、染色、觀察；將具環(huán)帶的活體蚯蚓用蒸餾水洗凈后，放入培養(yǎng)皿中逐滴加入無水乙醇進(jìn)行麻醉，然后用手術(shù)剪刀在蚯蚓環(huán)帶下方且靠近環(huán)帶的腹部將腹血管剪破，血滴在載玻片；并將其置于血滴的前方，向后移動(dòng)并觸及血滴，待血均勻附著于兩玻片之間時(shí)，自然晾干；將Giemsa染液滴在血膜上，用蒸餾水把染液沖掉，用濾紙吸去多余的水，自然風(fēng)干后，即可清晰地觀察到蚯蚓血細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞的形態(tài)。為土壤污染生態(tài)毒理診斷提供方法和技術(shù)支持。
【專利說明】一種蚯蚓血細(xì)胞涂片的制作方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種土壤污染生態(tài)毒理診斷涂片的制作方法，特別是涉及一種蚯蚓血細(xì)胞涂片的制作方法。

【背景技術(shù)】
[0002]土壤生態(tài)系統(tǒng)中，蚯蚓是最重要的棲息者之一。蚯蚓在土壤的形成過程中，在土壤結(jié)構(gòu)和土壤肥力的保持等方面具有獨(dú)特的作用，蚯蚓能夠改善土壤的通氣、保水和排水，提高土壤的養(yǎng)分循環(huán)速度，調(diào)節(jié)土壤微生物區(qū)系的組成，改善土壤生態(tài)系統(tǒng)的功能。另外，蚯蚓在陸地生態(tài)系統(tǒng)中具有特殊地位，很多動(dòng)物鼠、鳥類等可以攝食蚯蚓，從某種意義上，它連接了土壤圈與大氣圈，溝通了土壤生物同地上生物之間的聯(lián)系。
[0003]在土壤污染生態(tài)毒理診斷研究中，由于蚯蚓分布廣泛，對(duì)土壤污染脅迫比較敏感，蚯蚓成為目前土壤污染狀況檢測(cè)的重要生物指標(biāo)之一，以及許多生態(tài)毒理國際標(biāo)準(zhǔn)中推薦使用的模式生物。在有關(guān)蚯蚓的毒性研究中，大多是以不同污染狀態(tài)下蚯蚓生存、生長(zhǎng)和繁殖的響應(yīng)指標(biāo)(如蚯蚓急性致死率和慢性體質(zhì)量抑制率)為研究對(duì)象，檢驗(yàn)土壤污染的狀況。但隨著土壤污染生態(tài)毒理診斷研究的深入，這些指標(biāo)已經(jīng)不能滿足低劑量污染條件下土壤生態(tài)毒理診斷的需要，而蚯蚓遺傳毒理學(xué)方面的研究逐漸成為污染指標(biāo)的研究熱點(diǎn)。
[0004]微核法是國際上公認(rèn)的致癌危險(xiǎn)性及其他遺傳危害的短期測(cè)試的有效方法，而在蚯蚓血細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)中最主要也是最關(guān)鍵的步驟就是蚯蚓血涂片的制作。在血涂片的制作方面，大多集中于脊椎動(dòng)物和植物，對(duì)無脊椎動(dòng)物卻不多見，尤其是體型較小的蚯蚓，而且蚯蚓血細(xì)胞涂片制作的好壞直接影響血細(xì)胞的形態(tài)觀察及鑒定結(jié)果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種蚯蚓血細(xì)胞涂片的制作方法，該方法能準(zhǔn)確、快速的取到蚯蚓的血液，并能制作出薄而且均勻的血涂片，所使用的染色劑亦能將蚯蚓血細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞均勻染色，染色效果良好，能清晰地觀察到蚯蚓血細(xì)胞內(nèi)的各種細(xì)胞，為土壤污染生態(tài)毒理診斷提供方法和技術(shù)支持。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
1.一種蚯蚓血細(xì)胞涂片的制作方法，所述方法包括以下制作過程:
a、蚯蚓取血:將具環(huán)帶的活體蚯蚓用蒸餾水洗凈后，放入培養(yǎng)皿中逐滴加入無水乙醇進(jìn)行麻醉，3分鐘后，用鑷子觸碰蚯蚓，待其不作出反應(yīng)后取出，并用濾紙吸去蚯蚓表面的水分，然后用手術(shù)剪刀在蚯蚓環(huán)帶下方且靠近環(huán)帶的腹部將腹血管剪破，使血自然流出，勿擠壓，取潔凈的載玻片，讓血滴在離載玻片一端4飛毫米處，勿觸及蚯蚓體表；
b、涂片:取一塊邊緣光滑的載玻片做推片，并將其置于血滴的前方，向后移動(dòng)并觸及血滴，待血均勻附著于兩玻片之間時(shí)，使兩玻片呈3(Γ45度的角度，向另一端以一定的速度平穩(wěn)地推出，角度要保持不變，用力均勻地推出血膜，自然晾干；
C、染色:將Giemsa (姬姆薩)染液滴在血膜上，至染液淹沒全部血膜，染3分鐘后，加等量pH值為7.17的磷酸鹽緩沖液與染液混合再染10分鐘，用洗耳球輕輕吹動(dòng)，使染液與緩沖液混合均勻，最后用蒸餾水把染液沖掉，用濾紙吸去多余的水，自然風(fēng)干后，即可觀察；d、顯微鏡觀察:將制好的血涂片放在顯微鏡上觀察，觀察時(shí)顯微鏡的倍數(shù)由低到高，即可清晰地觀察到蚯蚓血細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞的形態(tài)。
[0007]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與效果是:
本發(fā)明能準(zhǔn)確、快速的取到蚯蚓的血液，并能制作出薄而且均勻的血涂片，所使用的染色劑亦能將蚯蚓血細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞均勻染色，染色效果良好，能清晰地觀察到蚯蚓血細(xì)胞內(nèi)的各種細(xì)胞。該發(fā)明還有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，將在蚯蚓血細(xì)胞微核檢測(cè)方面發(fā)揮重要作用。

【具體實(shí)施方式】
[0008]下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。
[0009]實(shí)施例1
1、蚯蚓取血:將具環(huán)帶的活體赤子愛勝蚯蚓用蒸餾水洗凈后，放入培養(yǎng)皿中逐滴加入無水乙醇進(jìn)行麻醉，3分鐘后，用鑷子觸碰蚯蚓，待其不作出反應(yīng)后取出，并用濾紙吸去蚯蚓表面的水分，然后用手術(shù)剪刀在蚯蚓環(huán)帶下方且靠近環(huán)帶的腹部將腹血管剪破，使血自然流出，勿擠壓，取潔凈的載玻片，讓血滴在離載玻片一端4毫米處，勿觸及蚯蚓體表。
[0010]2、涂片:取一塊邊緣光滑的載玻片做推片，并將其置于血滴的前方，向后移動(dòng)并觸及血滴，待血均勻附著于兩玻片之間時(shí)，使兩玻片約呈30度的角度，向另一端以一定的速度平穩(wěn)地推出，角度要保持不變，用力均勻地推出血膜，自然晾干。
[0011]3、染色:將Giemsa (姬姆薩)染液滴在血膜上，至染液淹沒全部血膜，染3分鐘后，加等量PH值為7.17的磷酸鹽緩沖液與染液混合再染10分鐘，用洗耳球輕輕吹動(dòng)，使染液與緩沖液混合均勻，最后用蒸餾水把染液沖掉，用濾紙吸去多余的水，自然風(fēng)干后，即可觀察。
[0012]4、顯微鏡觀察:將制好的血涂片放在顯微鏡上觀察，觀察時(shí)顯微鏡的倍數(shù)由低到高，可以清晰地觀察到蚯蚓血細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞的形態(tài)。
[0013]實(shí)施例2
1、蚯蚓取血:將具環(huán)帶的活體赤子愛勝蚯蚓用蒸餾水洗凈后，放入培養(yǎng)皿中逐滴加入無水乙醇進(jìn)行麻醉，3分鐘后，用鑷子觸碰蚯蚓，待其不作出反應(yīng)后取出，并用濾紙吸去蚯蚓表面的水分，然后用手術(shù)剪刀在蚯蚓環(huán)帶下方且靠近環(huán)帶的腹部將腹血管剪破，使血自然流出，勿擠壓，取潔凈的載玻片，讓血滴在離載玻片一端5毫米處，勿觸及蚯蚓體表。
[0014]2、涂片:取一塊邊緣光滑的載玻片做推片，并將其置于血滴的前方，向后移動(dòng)并觸及血滴，待血均勻附著于兩玻片之間時(shí)，使兩玻片約呈35度的角度，向另一端以一定的速度平穩(wěn)地推出，角度要保持不變，用力均勻地推出血膜，自然晾干。
[0015]3、染色:將Giemsa (姬姆薩)染液滴在血膜上，至染液淹沒全部血膜，染3分鐘后，加等量PH值為7.17的磷酸鹽緩沖液與染液混合再染10分鐘，用洗耳球輕輕吹動(dòng)，使染液與緩沖液混合均勻，最后用蒸餾水把染液沖掉，用濾紙吸去多余的水，自然風(fēng)干后，即可觀察。
[0016]4、顯微鏡觀察:將制好的血涂片放在顯微鏡上觀察，觀察時(shí)顯微鏡的倍數(shù)由低到高，可以清晰地觀察到蚯蚓血細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞的形態(tài)。
[0017]實(shí)施例3
1、蚯蚓取血:將具環(huán)帶的活體赤子愛勝蚯蚓用蒸餾水洗凈后，放入培養(yǎng)皿中逐滴加入無水乙醇進(jìn)行麻醉，3分鐘后，用鑷子觸碰蚯蚓，待其不作出反應(yīng)后取出，并用濾紙吸去蚯蚓表面的水分，然后用手術(shù)剪刀在蚯蚓環(huán)帶下方且靠近環(huán)帶的腹部將腹血管剪破，使血自然流出，勿擠壓，取潔凈的載玻片，讓血滴在離載玻片一端4毫米處，勿觸及蚯蚓體表。
[0018]2、涂片:取一塊邊緣光滑的載玻片做推片，并將其置于血滴的前方，向后移動(dòng)并觸及血滴，待血均勻附著于兩玻片之間時(shí)，使兩玻片呈40度的角度，向另一端以一定的速度平穩(wěn)地推出，角度要保持不變，用力均勻地推出血膜，自然晾干。
[0019]3、染色:將Giemsa (姬姆薩)染液滴在血膜上，至染液淹沒全部血膜，染3分鐘后，加等量PH值為7.17的磷酸鹽緩沖液與染液混合再染10分鐘，用洗耳球輕輕吹動(dòng)，使染液與緩沖液混合均勻，最后用蒸餾水把染液沖掉，用濾紙吸去多余的水，自然風(fēng)干后，即可觀察。
[0020]4、顯微鏡觀察:將制好的血涂片放在顯微鏡上觀察，觀察時(shí)顯微鏡的倍數(shù)由低到高，可以清晰地觀察到蚯蚓血細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞的形態(tài)。
[0021]實(shí)施例4
1、蚯蚓取血:將具環(huán)帶的活體赤子愛勝蚯蚓用蒸餾水洗凈后，放入培養(yǎng)皿中逐滴加入無水乙醇進(jìn)行麻醉，3分鐘后，用鑷子觸碰蚯蚓，待其不作出反應(yīng)后取出，并用濾紙吸去蚯蚓表面的水分，然后用手術(shù)剪刀在蚯蚓環(huán)帶下方且靠近環(huán)帶的腹部將腹血管剪破，使血自然流出，勿擠壓，取潔凈的載玻片，讓血滴在離載玻片一端5毫米處，勿觸及蚯蚓體表。
[0022]2、涂片:取一塊邊緣光滑的載玻片做推片，并將其置于血滴的前方，向后移動(dòng)并觸及血滴，待血均勻附著于兩玻片之間時(shí)，使兩玻片呈45度的角度，向另一端以一定的速度平穩(wěn)地推出，角度要保持不變，用力均勻地推出血膜，自然晾干。
[0023]3、染色:將Giemsa (姬姆薩)染液滴在血膜上，至染液淹沒全部血膜，染3分鐘后，加等量PH值為7.17的磷酸鹽緩沖液與染液混合再染10分鐘，用洗耳球輕輕吹動(dòng)，使染液與緩沖液混合均勻，最后用蒸餾水把染液沖掉，用濾紙吸去多余的水，自然風(fēng)干后，即可觀察。
[0024]4、顯微鏡觀察:將制好的血涂片放在顯微鏡上觀察，觀察時(shí)顯微鏡的倍數(shù)由低到高，可以清晰地觀察到蚯蚓血細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞的形態(tài)。
【權(quán)利要求】
1.一種蚯蚓血細(xì)胞涂片的制作方法，其特征在于，所述方法包括以下制作過程: 1蚯蚓取血:將具環(huán)帶的活體蚯蚓用蒸餾水洗凈后，放入培養(yǎng)皿中逐滴加入無水乙醇進(jìn)行麻醉，3分鐘后，用鑷子觸碰蚯蚓，待其不作出反應(yīng)后取出，并用濾紙吸去蚯蚓表面的水分，然后用手術(shù)剪刀在蚯蚓環(huán)帶下方且靠近環(huán)帶的腹部將腹血管剪破，使血自然流出，勿擠壓，取潔凈的載玻片，讓血滴在離載玻片一端4飛毫米處，勿觸及蚯蚓體表； I涂片:取一塊邊緣光滑的載玻片做推片，并將其置于血滴的前方，向后移動(dòng)并觸及血滴，待血均勻附著于兩玻片之間時(shí)，使兩玻片呈30?45度的角度，向另一端以一定的速度平穩(wěn)地推出，角度要保持不變，用力均勻地推出血膜，自然晾干； 匕染色:將以6！11% (姬姆薩)染液滴在血膜上，至染液淹沒全部血膜，染3分鐘后，加等量邱值為7.17的磷酸鹽緩沖液與染液混合再染10分鐘，用洗耳球輕輕吹動(dòng)，使染液與緩沖液混合均勻，最后用蒸餾水把染液沖掉，用濾紙吸去多余的水，自然風(fēng)干后，即可觀察； 己、顯微鏡觀察:將制好的血涂片放在顯微鏡上觀察，觀察時(shí)顯微鏡的倍數(shù)由低到高，即可清晰地觀察到蚯蚓血細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞的形態(tài)。
【文檔編號(hào)】G01N1/30GK104390824SQ201410652146
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月17日
【發(fā)明者】宋雪英, 梁茹晶, 胡曉鈞, 胡爽, 李玉雙, 侯永俠, 楊繼松 申請(qǐng)人:沈陽大學(xué)