檢測凝血酶用生物電化學傳感器其制備方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測凝血酶用生物電化學傳感器其制備方法及應用。該傳感器為三電極體系傳感器，其中對電極為鉑電極，參比電極為飽和甘汞電極，工作電極為功能化修飾的熱解石墨電極，該功能化修飾的熱解石墨電極是在熱解石墨電極表面依次修飾有聚（二烯丙基二甲基氯化銨）、金納米顆粒、葫蘆[7]脲和循環(huán)混合液；所述的循環(huán)混合液中含有：100nMMB標記的探針DNA鏈、1nM延伸DNA鏈、1nM的凝血酶適體鏈、1.6unit/μL的T4DNA連接酶和0.4unit/μL的ExoIII。本發(fā)明利用凝血酶與適體的特異性結(jié)合能力，同時，借助連接酶輔助作用引發(fā)ExoIII的循環(huán)切割反應，并結(jié)合電化學快速靈敏的檢測優(yōu)勢實現(xiàn)對凝血酶的高靈敏性檢測。
【專利說明】檢測凝血酶用生物電化學傳感器其制備方法及應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物電化學適體傳感器其制備方法及應用，特別是一種能高靈敏檢測凝血酶用生物電化學傳感器其制備方法及應用。

【背景技術(shù)】
[0002]凝血酶是在血液凝結(jié)級聯(lián)反應中發(fā)揮重要作用的一種胞外的絲氨酸蛋白酶，它催化纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，促使血液凝固，是局部止血的首選藥物。它在炎癥和血管壁的組織修復等許多生理過程中也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。此外，在血栓形成和血小板激活過程中，它具有類激素的調(diào)節(jié)作用。同時，凝血酶與骨橋蛋白表達陽性的肝細胞肝癌呈正相關(guān)，可作為治療靶點。因此，在復雜的生物樣品中對凝血酶進行高效靈敏特異性的檢測，將有助于疾病的篩選和診斷。
[0003]核酸適體是通過配體指數(shù)富集系統(tǒng)進化技術(shù)在體外篩選得到的一小段寡核苷酸序列。它可以是RNA，也可以是單鏈DNA，一般由幾十個核苷酸組成，在合適的條件下能夠折疊成發(fā)夾、莖環(huán)、G-四聚體、假結(jié)等熱力學穩(wěn)定的三維空間結(jié)構(gòu)，并通過堿基堆積力、氫鍵、結(jié)構(gòu)互補、范德華力、靜電等作用與氨基酸、金屬離子等小分子以及蛋白質(zhì)、糖類等大分子物質(zhì)特異性結(jié)合。相較于抗體，適體具有穩(wěn)定性好，變性與復性可逆；分子量小，易于在體內(nèi)滲透等優(yōu)點。這些使得適體在分子檢測中發(fā)揮越來越重要的作用。
[0004]DNA連接酶是基因工程研究中常用的一種工具酶，主要有大腸桿菌DNA連接酶和T4 DNA連接酶。其中，T4 DNA連接酶可以借助ATP提供能量催化契合的雙鏈DNA或RNA的5’ -磷酸末端和3’ -羥基末端形成磷酸二酯鍵，從而封閉DNA鏈上的缺口。而核酸外切酶是一種從DNA分子鏈末端順次水解磷酸二酯鍵使其生成單核苷酸的工具酶。其中一種核酸外切酶是核酸外切酶III (Exo III)，它的最適作用底物是平末端或3’凹陷末端的雙鏈DNA，并從3’ -羥基末端逐步催化去除單核苷酸，造成定向缺失。這些工具酶近年來都已經(jīng)突破了其在傳統(tǒng)基因工程中的應用，并越來越廣泛地應用于分子檢測等各個領(lǐng)域，特別是在信號放大方面起到了十分重要的作用。
[0005]葫蘆脲是繼冠醚、穴醚、環(huán)糊精和杯芳烴之后又一類新的主體化合物，超分子化學的研究表明，它是一種具有空腔的桶狀大環(huán)，頂部和底部兩端為羰基氧，因其形狀酷似葫蘆，故用葫蘆脲(Cucurbituri I,簡稱CB)命名這種大環(huán)化合物。它的疏水空腔結(jié)構(gòu)可以包結(jié)有機分子，與烷基正離子和芳胺形成穩(wěn)定的包合物。另外，葫蘆脲的空腔由羰基所環(huán)繞，構(gòu)成陽離子鍵合位點。由于葫蘆[7]脲(CB[7])的空腔可以通過疏水作用結(jié)合亞甲基藍(MB)的雜環(huán)結(jié)構(gòu)，同時CB[7]的羰基氧可以通過離子-偶極作用結(jié)合MB的銨離子，使兩者最終形成穩(wěn)定的主-客體復合物。這就有利于實現(xiàn)MB的捕獲與固定，從而擴展MB的應用范圍。
[0006]目前，檢測凝血酶的電化學傳感器中，最普遍的仍是利用凝血酶適體與凝血酶的結(jié)合作用而設(shè)計的，然而在設(shè)計過程中，由于電極表面的固定化處理、適體鏈的標記等因素，往往會影響適體鏈與凝血酶的結(jié)合效率，從而降低檢測的靈敏度。因此，這就需要在傳感器設(shè)計上充分考慮各個因素，并盡量避免這些問題的出現(xiàn)，同時，也應該利用合理的信號放大策略來提高傳感器的檢測靈敏度。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的之一在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種高靈敏檢測凝血酶用生物電化學傳感器。
[0008]本發(fā)明的目的之二在于提供該傳感器的構(gòu)建方法。
[0009]本發(fā)明的目的之三在于提供該傳感器的檢測方法。
[0010]為達到上述目的，本發(fā)明采用如下機理:首先設(shè)計3條DNA鏈，一條是可以特異性結(jié)合凝血酶的適體鏈，另一條是5’標記有MB的探針鏈，還有一條是延伸鏈。其中延伸鏈可以和探針鏈的一部分完全互補配對，而適體鏈的一部分可以和探針鏈的另一部分互補配對。當體系中無凝血酶存在時，三條鏈可以形成一個中間帶缺口的雙鏈DNA，該缺口可以被T4 DNA連接酶識別并連接，從而生成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。此時，由于雙鏈的Tm值為48.1 V,當體系中加入Exo III后，在37 °C反應條件下，Exo III能順利的從雙鏈結(jié)構(gòu)的3’端開始切割探針鏈，產(chǎn)生游離的MB。最后，將反應液修飾到固定有CB[7]的熱解石墨電極上，由于CB[7]可以結(jié)合MB，從而可以檢測到電極上MB的電化學信號。相反，若體系中有凝血酶存在時，則適體鏈將以G-四聚體結(jié)構(gòu)結(jié)合凝血酶，其余兩條鏈互補后形成的雙鏈將不受T4 DNA連接酶影響，且Tm值僅為16.5 °C，當Exo III在37 °C作用時，延伸鏈和探針鏈由于Tm值過低將維持單鏈狀態(tài)，則Exo III無法切割探針鏈，最后由于探針鏈與CB[7]的靜電排斥作用，使得修飾在電極上的CB[7]無法結(jié)合MB，從而無法得到電化學信號響應。因此，可以通過電化學信號的強度來反映檢測體系中凝血酶的濃度，隨著凝血酶濃度的增加，電化學信號強度將逐漸降低。
[0011]根據(jù)上述機理，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種檢測凝血酶用生物電化學適體傳感器，為三電極體系傳感器，其中對電極是鉬電極，參比電極是飽和甘汞電極，工作電極為功能化的熱解石墨電極，其特征在于所述的功能化的熱解石墨電極是在熱解石墨電極表面依次修飾有聚(二烯丙基二甲基氯化銨)、金納米顆粒、葫蘆[7]脲和循環(huán)混合液；所述的循環(huán)混合液中含有:100 nM MB標記的探針DNA鏈、I nM延伸DNA鏈、I nM的凝血酶適體鏈、1.6 unit/ μ L的T4 DNA連接酶和0.4 unit/μ L的Exo III ;所述的凝血酶適體鏈為:5’ -GAGGTTGGTGTGGTTGG-3’ ；所述的延伸DNA鏈為:5’ -ATATCGCT-3’ ；所述的 MB 標記的探針 DNA 鏈為:5’ -AAAAAACCAACCTCAGCGATAT-Methylene Blue (MB) _3’。
[0012]一種制備上述的檢測凝血酶用生物電化學適體傳感器，其特征在于該方法的步驟為:
a)將熱解石墨電極依次在800目和3000目細剛玉砂紙上打磨，然后用粒度為0.05 μ m的氧化鋁粉末與水的混合物在絲綢上拋光至鏡面。再將其分別在無水乙醇、超純水中超聲清洗5 min，取出后用超純水沖洗干洗，并用氮氣吹干；
b)取含0.05 M NaCl的20 μ L的3.5 mg/mL PDDA溶液浸泡步驟a所得電極20 min,再用超純水沖洗并用氮氣吹干；然后取40 μ L直徑為7 nm的AuNPs浸泡電極I h,再用水沖洗并用氮氣吹干；最后取40 UL I mM CB[7]浸泡電極60 min，然后用超純水沖洗，再用氮氣吹干后；
C)將凝血酶適體鏈在90 °C中反應5 min，然后自然冷卻至室溫；先在100 nM MB標記的探針DNA鏈、I nM延伸DNA鏈和I nM的凝血酶適體鏈的混合溶液中加入濃度為1.6 unit/yL的T4 DNA連接酶，在16 °C下反應0.5 h，然后在65 °C下反應10 min，滅活連接酶，再加入濃度為0.4 unit/μ L的Exo III，然后在37 °C下反應20 min，再置于70 °C中反應20min,得到循環(huán)混合液；
d)取20 μ L步驟c)所得循環(huán)混合溶液，滴加到步驟b)所得熱解石墨電極表面，室溫下孵育I h ;然后，用超純水沖洗電極后，得到功能化的熱解石墨電極，與鉬電極和飽和甘汞電極組建形成三電極體系的生物電化學適體傳感器。
[0013]一種凝血酶的檢測方法，采用上述的檢測凝血酶用生物電化學適體傳感器，其特征在于該方法的具體步驟為:
a.在電解池中加入的pH=7.4的10 mM Tris-HCl溶液，再向其中通入高純氮氣；將三電極體系浸入Tris-HCl溶液中；
b.將三電極體系與電化學工作站連接，打開電化學工作站和測試電腦，啟動電化學工作站控制軟件，選擇檢測方法為方波伏安法，設(shè)定檢測參數(shù)如下:電位掃描范圍為O?-0.6 V,電位增量為4 mV，振幅為25 mV，頻率為15 Hz ;運行程序開始檢測，檢測完畢即得相應的數(shù)據(jù)圖。
[0014]本發(fā)明基于連接酶輔助的Exo III降解反應構(gòu)建了一種高靈敏檢測凝血酶的電化學適體傳感器，利用凝血酶與適體的特異性結(jié)合能力，同時，借助連接酶輔助作用引發(fā)ExoIII的循環(huán)切割反應，并結(jié)合電化學快速靈敏的檢測優(yōu)勢實現(xiàn)對凝血酶的高靈敏性檢測。對于其他有特異性適體的檢測物，理論上也能通過這種方法進行檢測，因此該方法具有廣泛的應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為三條DNA鏈分別在T4 DNA連接酶和Exo III同時存在下、只有Exo II1、沒有酶、只有T4 DNA連接酶四種情況下反應后，修飾到CB [7] /AuNPs/PDDA功能化的熱解石墨電極上，再在10 mM Tris-HCl (pH 7.4)中檢測得到的方波伏安法信號圖。電位掃描范圍:O?-0.6 V，電位增量:4 mV，振幅:25 mV，頻率:15 Hz0
[0016]圖2 為三條 DNA 鏈和不同濃度凝血酶(O MUOO fM、l pM、10 pM、100 pM、l nM、10nM)經(jīng)T4 DNA連接酶和Exo III作用后，修飾到CB[7]/AuNPs/roDA功能化的熱解石墨電極上，再在10 mM Tris-HCl (pH 7.4)中檢測得到的方波伏安法信號圖。電位掃描范圍:0?-0.6 V,電位增量:4 mV，振幅:25 mV，頻率:15 Hz0
[0017]圖3 為不同凝血酶濃度(O MUOO fM、l pM、10 pM、100 pM、l nM、10 nM)與峰電流值的關(guān)系曲線。其中插入圖為凝血酶濃度在100 fM到I nM范圍內(nèi)的對數(shù)值與峰電流值的線性關(guān)系曲線。
[0018]圖4為三條DNA鏈分別在I nM凝血酶、10 nM BSA、無凝血酶四種情況下經(jīng)T4 DNA連接酶和Exo III作用后，修飾到CB [7] /AuNPs/PDDA功能化的熱解石墨電極上，再在10 mMTris-HCl (pH 7.4)中檢測得到的方波伏安法信號圖。電位掃描范圍:0?-0.6 V，電位增量:4 mV，振幅:25 mV，頻率:15 Hz0

【具體實施方式】
[0019]實施例一:檢測凝血酶用生物電化學適體傳感器的制備
將熱解石墨電極依次在800目和3000目細剛玉砂紙上打磨，然后用粒度為0.05 ym的氧化鋁粉末與水的混合物在絲綢上拋光至鏡面。再將其分別在無水乙醇、超純水中超聲清洗5 min，取出后用超純水沖洗干洗，并用氮氣吹干。隨后取20 μ L的3.5 mg/mL PDDA溶液(含0.05 M NaCl)浸泡電極20 min，再用超純水沖洗并用氮氣吹干。然后取40 μ L直徑為7 nm的AuNPs浸泡電極I h，再用水沖洗并用氮氣吹干。最后取40 μ L I mM CB[7]浸泡電極60 min，然后用超純水沖洗，再用氮氣吹干后，取20 μ L循環(huán)反應后的混合溶液，滴加到該熱解石墨電極表面，室溫下孵育I h。然后，用超純水沖洗電極后，加上鉬電極和飽和甘汞電極一起組建成三電極體系的生物電化學適體傳感器。
[0020]其中，循環(huán)反應液的制備過程如下:
實驗中溶解DNA和凝血酶所用的緩沖分別是TE緩沖(10 mM Tris-HCl,0.1 mM EDTA,pH 7.4)和凝血酶溶解緩沖(10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 50 mM KCl, 0.1% BSA,pH 7.5)。實驗前，先將凝血酶適體鏈在90 °C中反應5 min，然后自然冷卻至室溫，從而保證適體能以正確的形式結(jié)合凝血酶。再依次進行以下反應:在含有100 nM MB標記的探針DNA鏈、I nM延伸DNA鏈和I nM的凝血酶適體鏈和I X酶反應緩沖(10 mM Bis Tris propane-HCl,10 mM MgCl2,1 mM ATP, I mM DTT, pH 7.0)的混合溶液中加入濃度為 1.6 unit/μ L 的 Τ4DNA連接酶，在16 °C下反應0.5 h，然后在65 °C下反應10 min，滅活連接酶。之后在上述混合液中加入濃度為0.4 unit/yL的Exo III，然后在37 °C下反應20 min，再置于70 V中反應20 min以實現(xiàn)對Exo III的滅活。反應結(jié)束后，即得循環(huán)反應液。
[0021]實施例二:檢測凝血酶用生物電化學適體傳感器的檢測方法
在電解池中加入適量(5 mL左右)的10 mM Tris-HCl (pH 7.4)溶液，再向其中通入高純氮氣并維持至少10 min ;將三電極體系浸入Tris-HCl溶液中，同時，繼續(xù)維持一定流速的氮氣，直至檢測結(jié)束。將三電極體系與電化學工作站(型號:chi660c ;中國上海辰華儀器有限公司)連接，打開電化學工作站和測試電腦，啟動電化學工作站控制軟件，選擇檢測方法為方波伏安法，設(shè)定檢測參數(shù)如下:電位掃描范圍為O?-0.6 V，電位增量為4 mV，振幅為25 mV，頻率為15 Hz ;運行程序開始檢測，檢測完畢即得相應的數(shù)據(jù)圖。
[0022]如圖1所示，當體系中有連接酶輔助再經(jīng)Exo III循環(huán)切割之后，可以在-0.28 V位置處檢測得到一個明顯的電化學信號響應。而當沒有酶參與只有DNA鏈存在時，檢測得到的電化學信號則明顯降低。這個結(jié)果和實驗預期是一樣的。同時，也能發(fā)現(xiàn)，若體系中只有一種酶參與反應時，則無論是連接酶還是Exo III，都得不到很強的電化學信號，且信號值和空白對照基本一樣。因此，可以看出此反應體系設(shè)計上的可行性。
[0023]實施例三:檢測凝血酶用生物電化學適體傳感器對不同濃度凝血酶的檢測
首先，將不同濃度的凝血酶溶液5 μ L和10 ηΜ適體DNA鏈5 μ L加入到22.5 μ L凝血酶結(jié)合緩沖(10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM KCl, pH 7.4)中，于 37 °C 中反應 I h，然后加入10 ηΜ的延伸鏈5 μ L、1 μ M的探針鏈5 μ LUO X酶反應緩沖(100 mM BisTris propane-HCl, 100 mM MgCl2,10 mM ATP, 10 mM DTT，pH 7.0)5 μ L 和 400 unit/μ L的T4 DNA連接酶0.2 μ L，混勻后于16 °C中反應0.5 h，再于65 °C反應10 min以滅活連接酶。再往溶液中加入100 unit/μ L的Exo III 0.2 μ L，于37 °C條件下反應20 min，然后在70 °C下反應20 min以滅活Exo III。反應結(jié)束后,取20 μ L反應后的混合溶液,滴加到功能化熱解石墨電極表面，室溫下孵育I h，再進行電化學檢測。
[0024]如圖2所示，隨著凝血酶濃度的升高，電化學信號逐漸降低，這是因為凝血酶濃度增加后，越來越多的適體鏈與凝血酶結(jié)合，則與另兩條鏈形成的雙鏈結(jié)構(gòu)則越來越少，之后經(jīng)Exo III切割后產(chǎn)生的游離的MB也越來越少，最終產(chǎn)生的電化學信號就越來越低。
[0025]將凝血酶濃度與電化學信號的峰電流值作圖即得圖3，同時，圖3的插入圖顯示，凝血酶濃度在100 fM到I ηΜ范圍內(nèi)的對數(shù)值與峰電流值之間具有良好的線性關(guān)系，這可以做為凝血酶定量檢測的依據(jù)。根據(jù)3倍信噪比可得該方法的檢測限為33 fM，大大地提高了凝血酶檢測的靈敏度，具有良好的應用前景。
[0026]實施例四:檢測凝血酶用生物電化學適體傳感器的特異性研究
為了驗證該傳感器在檢測凝血酶過程中的特異性，我們隨機選用了另一種蛋白——牛血清蛋白(BSA)來進行對照實驗。在實施例三的實驗過程中，用10 nM BSA代替凝血酶進行實驗，最后檢測得到的電化學信號如圖4所示。從圖中可以看出，加入BSA得到的電化學信號與不加凝血酶時的電化學信號接近，而明顯高于有凝血酶存在時的電化學信號。因此，說明該傳感器對于凝血酶具有很高的選擇性和特異性。
[0027]以上結(jié)果表明，本發(fā)明設(shè)計的高靈敏檢測凝血酶的電化學適體傳感器一方面實驗操作簡便，檢測靈敏度很高，另一方面對凝血酶具有很高的選擇性和特異性，具有很好的應用前景，同樣的原理可以推廣到其他與適體特異性結(jié)合的檢測物中，應用范圍廣泛。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測凝血酶用生物電化學適體傳感器，為三電極體系傳感器，其中對電極是鉬電極，參比電極是飽和甘汞電極，工作電極為功能化的熱解石墨電極，其特征在于所述的功能化的熱解石墨電極是在熱解石墨電極表面依次修飾有聚(二烯丙基二甲基氯化銨)、金納米顆粒、葫蘆[7]脲和循環(huán)混合液；所述的循環(huán)混合液中含有:100 nM MB標記的探針DNA鏈、1 nM延伸DNA鏈、1 nM的凝血酶適體鏈、1.6 unit/ μ L的T4 DNA連接酶和0.4 unit/μ L的Εχο III ;所述的凝血酶適體鏈為:5’ -GAGGTTGGTGTGGTTGG-3’ ；所述的延伸DNA鏈為:5’ -ATATCGCT-3’ ；所述的 MB 標記的探針 DNA 鏈為:5’ -AAAAAACCAACCTCAGCGATAT-Methylene Blue (MB) _3’。
2.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測凝血酶用生物電化學適體傳感器，其特征在于該方法的步驟為: a)將熱解石墨電極依次在800目和3000目細剛玉砂紙上打磨，然后用粒度為0.05 μ m的氧化鋁粉末與水的混合物在絲綢上拋光至鏡面；再將其分別在無水乙醇、超純水中超聲清洗5 min，取出后用超純水沖洗干洗，并用氮氣吹干； b)取含0.05M NaCl的20 μ L的3.5 mg/mL TODA溶液浸泡步驟a所得電極20 min,再用超純水沖洗并用氮氣吹干；然后取40 μ L直徑為7 nm的AuNPs浸泡電極1 h,再用水沖洗并用氮氣吹干；最后取40 uL 1 mM CB[7]浸泡電極60 min，然后用超純水沖洗，再用氮氣吹干后； c)將凝血酶適體鏈在90°C中反應5 min，然后自然冷卻至室溫；先在100 nM MB標記的探針DNA鏈、1 nM延伸DNA鏈和1 nM的凝血酶適體鏈的混合溶液中加入濃度為1.6 unit/yL的T4 DNA連接酶，在16 °C下反應0.5 h，然后在65 °C下反應10 min，滅活連接酶，再加入濃度為0.4 unit/μ L的Εχο III，然后在37 °C下反應20 min，再置于70 °C中反應20min,得到循環(huán)混合液； d)取20μ L步驟c)所得循環(huán)混合溶液，滴加到步驟b)所得熱解石墨電極表面，室溫下孵育1 h ;然后，用超純水沖洗電極后，得到功能化的熱解石墨電極，與鉬電極和飽和甘汞電極組建形成三電極體系的生物電化學適體傳感器。
3.—種凝血酶的檢測方法，采用根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測凝血酶用生物電化學適體傳感器，其特征在于該方法的具體步驟為: a.在電解池中加入的pH=7.4的10 mM Tris-HCl溶液，再向其中通入高純氮氣；將三電極體系浸入Tris-HCl溶液中； b.將三電極體系與電化學工作站連接，打開電化學工作站和測試電腦，啟動電化學工作站控制軟件，選擇檢測方法為方波伏安法，設(shè)定檢測參數(shù)如下:電位掃描范圍為0?-0.6 V，電位增量為4 mV，振幅為25 mV，頻率為15 Hz ;運行程序開始檢測，檢測完畢即得相應的數(shù)據(jù)圖。
【文檔編號】G01N33/68GK104267192SQ201410462190
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月6日
【發(fā)明者】李根喜, 趙婧, 吳吉光, 仲衛(wèi)冬, 辛美玲 申請人:上海大學