高內涵圖像流式生物顯微分析方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種高內涵圖像流式生物顯微分析方法，包括步驟：搭建并利用高內涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)對細胞進行檢測；高內涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)中，液流系統(tǒng)使細胞的聚焦在液流的中心，逐個流過流動室的檢測窗口；光學系統(tǒng)包括光源、光路系統(tǒng)、濾光片堆棧；光源包括鹵素燈、激光器；通過光路系統(tǒng)和由多個二向色鏡構成的濾光片堆棧，所述光學系統(tǒng)產(chǎn)生一個明場細胞圖像，一個六通道熒光細胞圖像及六個不同波段的PMT光強信號。本發(fā)明將流式細胞術與熒光顯微成像結合于一身，它具有多個檢測通道，能夠對通過流動室的細胞逐個采集的細胞圖像，并利用分析軟件對每個細胞圖像進行量化分析，從而提供細胞群的統(tǒng)計數(shù)據(jù)以及細胞形態(tài)學、細胞結構和亞細胞信號分布的信息。
【專利說明】高內涵圖像流式生物顯微分析方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及流式細胞術，具體地，涉及高內涵圖像流式生物顯微分析方法。
【背景技術】
[0002]流式細胞術是一種對液流中排成單列的細胞或其它生物微粒(如微球、細菌、小型模式生物等)逐個進行快速定量分析和分選的技術。使用傳統(tǒng)的流式細胞檢測技術，研究人員可以分析成千上萬個細胞，獲得每個細胞的散射光信號和熒光信號的數(shù)值，從而得到細胞群體的各種統(tǒng)計數(shù)據(jù)，并可以找到稀有的細胞亞群。
[0003]但是傳統(tǒng)流式細胞檢測技術仍然存在局限，那就是獲得的細胞信息很有限。細胞對研究人員來說，只是散點圖上的一個點，而不是真實的細胞圖像，缺乏細胞形態(tài)學、細胞結構及亞細胞水平信號分布的相關信息。要想獲得細胞圖像，研究人員就必須使用顯微鏡進行觀察，但顯微鏡能夠觀察的細胞數(shù)量是非常有限的，很難提供細胞群體的量化與統(tǒng)計數(shù)據(jù)。因此，使用傳統(tǒng)的細胞分析技術，我們就只能面對這樣的兩難選擇，沒有一種技術可以既提供細胞群體的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，又獲得細胞圖像。
【發(fā)明內容】
[0004]針對目前現(xiàn)有技術中單個流式細胞儀存在的缺陷，本發(fā)明的目的是設計一個合理的光學成像系統(tǒng)，其中，能高速采集經(jīng)過鞘液室的單個細胞明場和熒光圖像是設計的重點，這樣既可以利用明場圖像來觀察細胞的形態(tài)特征，又可以利用熒光來測定細胞中的關鍵成分，實現(xiàn)流式細胞術和顯微成像的有機結合。
[0005]根據(jù)本發(fā)明提供的一種高內涵圖像流式生物顯微分析方法，包括如下步驟:
[0006]步驟1:搭建高內涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)；
[0007]步驟2:利用所述高內涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)對細胞進行檢測；
[0008]所述高內涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)包括:液流系統(tǒng)、光學系統(tǒng)；
[0009]液流系統(tǒng)包括流動室,流動室用于接收注入的樣本細胞懸液和系統(tǒng)鞘液中，并使樣本細胞懸液中的細胞在系統(tǒng)鞘液流的約束下聚焦在液流的中心，逐個流過流動室的檢測窗口 ；
[0010]光學系統(tǒng)包括光源、光路系統(tǒng)、濾光片堆棧；
[0011]所述光源，用于照射通過檢測窗口的細胞，從而產(chǎn)生光信號；光源包括用于產(chǎn)生明場細胞圖像的鹵素燈、用于產(chǎn)生熒光細胞圖像的激光器；
[0012]光源照射細胞產(chǎn)生的光信號被物鏡收集，通過兩組楔形光柵分別收集前向光信號、側向光信號到兩個TDI相機中，然后通過光路系統(tǒng)傳遞到主要由多個二向色鏡構成的濾光片堆棧，光信號在濾光片堆棧處被分成不同波段投射到一個六通道PMT陣列上；進而所述光學系統(tǒng)產(chǎn)生一個明場細胞圖像，一個六通道熒光細胞圖像及六個不同波段的PMT光強信號。
[0013]優(yōu)選地，所述高內涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)還包括激光補光裝置，其中，所述激光補光裝置用于通過在細胞側向補光來調整光強度，降低TDI相機延遲積分的時間，減少細胞的高速流動帶來的積分時間過短造成光強偏弱的缺陷。
[0014]優(yōu)選地，所述高內涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)還包括自動對焦裝置，其中，所述自動對焦裝置用于利用激光光點法，通過測量彌散斑的邊緣和尺寸來計算細胞的聚焦位置。
[0015]優(yōu)選地，所述高內涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)還包括速度測量裝置，其中，所述速度測量裝置用于利用激光測距來測定限定時間內細胞的運動距離，折算出細胞的運動速率。所述TDI相機根據(jù)細胞的運動速率捕獲在流動室內的單細胞的圖像。
[0016]優(yōu)選地，所述高內涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)還包括分析系統(tǒng)，其中，所述分析系統(tǒng)采用熒光和明場的圖像配準方式，校正熒光和明場的成像偏差，使得光斑中心重合，并且通過多光譜PMT光信號和多光譜的熒光圖像來校正圖像的熒光強度，使得輸出的熒光強度與PMT保持一致。
[0017]優(yōu)選地，所述分析系統(tǒng)通過PMT光信號來調節(jié)熒光圖像的分割閾值，并且通過圖像微觀結構的分析來確定大量細胞中的異常細胞。
[0018]優(yōu)選地，所述物鏡的孔徑數(shù)值NA大于0.75。
[0019]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下的有益效果:
[0020]1、本發(fā)明既能提供細胞群的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，又可以獲得單個細胞的圖像，從而提供細胞形態(tài)學、細胞結構和亞細胞信號分布的信息。
[0021]2、本發(fā)明將流式細胞術與熒光顯微成像結合于一身，它具有多個檢測通道，能夠對通過流動室的細胞逐個采集的細胞圖像，并利用分析軟件對每個細胞圖像進行量化分析，從而提供細胞群的統(tǒng)計數(shù)據(jù)以及細胞形態(tài)學、細胞結構和亞細胞信號分布的信息。
[0022]3、本發(fā)明可以用于細胞信號轉導/通路分析、細胞間相互作用、分子共定位與胞內分子轉運、細胞形態(tài)學、熒光原位雜交、基因表達分析、細胞凋亡、細胞周期分析、白細胞亞群分析。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將會變得更明顯:
[0024]圖1為本發(fā)明的光路設計原理不意圖；
[0025]圖2為本發(fā)明的液流系統(tǒng)結構示意圖。
[0026]圖中:
[0027]I為多通道激光束；
[0028]2為細胞對焦器；
[0029]3為聚光鏡；
[0030]4為分光鏡；
[0031]5為濾光片；
[0032]6 為 PMT ;
[0033]7為楔形光柵；
[0034]8 為 TDI 相機；
[0035]9為分光盤；
[0036]10為二色反光鏡。
【具體實施方式】
[0037]下面結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0038]根據(jù)本發(fā)明提供的所述高內涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)，主要由液流系統(tǒng)、光學系統(tǒng)、電子系統(tǒng)、流動室等幾大部分組成。
[0039]液流系統(tǒng)包括流動室，液流系統(tǒng)將樣本細胞懸液和系統(tǒng)鞘液注入流動室中，流動室用于使細胞在鞘液流的約束下聚焦在液流的中心，逐個流過流動室的檢測窗口。流動室具有分選功能，當實驗設計中設定了被分選細胞的特性參數(shù)時，此類細胞在形成液滴時會被充電，使其帶有正電荷或負電荷，未被設定分選參數(shù)的細胞及空白液滴不帶電荷。帶電荷的液滴在落入電極偏轉板的高壓靜電場，依所帶電荷是正或是負而發(fā)生向右或向左道偏轉，落入指定的收集器中，完成細胞分選的目的。
[0040]光學系統(tǒng)包括光源、光路系統(tǒng)、濾光片堆棧。
[0041]光源照射通過檢測窗口的細胞，從而產(chǎn)生光信號；光源分為兩種，一種是用于產(chǎn)生明場細胞圖像的鹵素燈，另一種是用于產(chǎn)生熒光細胞圖像的激光器。
[0042]光源照射細胞產(chǎn)生的光信號被具有很大數(shù)值孔徑(NA:0.75)的物鏡收集，通過兩組楔形光柵收集前向光信號和側向光信號到兩個TDI相機中，然后通過光路系統(tǒng)傳遞到主要由二向色鏡構成的濾光片堆棧，光信號在這里被分成不同波段投射到一個六通道PMT陣列上，整個成像系統(tǒng)產(chǎn)生一個明場細胞圖像，一個六通道熒光細胞圖像及六個不同波段的PMT光強信號。該光路系統(tǒng)能夠自動調整焦距，并實時測定細胞運動速度，而冷CCD采用時間延遲積分方式進行信號采集，這些手段保證了系統(tǒng)采集到的細胞圖像的質量。
[0043]進一步地，高內涵圖像流式生物顯微分析方法的創(chuàng)新點在于光路設計，結合了流式細胞儀和顯微成像的優(yōu)點，充分融合了兩者的優(yōu)勢。系統(tǒng)中，設置了分光鏡，把前向散射光和側向散射光一分為二，一路通過光電倍增管(PMT)米集信號，另一路通過楔形光柵分解，利用延時積分CCD(TDI)采集圖像信號。實現(xiàn)了宏觀和微觀的有機結合。
[0044]該系統(tǒng)創(chuàng)新性的設計了激光補光裝置、自動對焦裝置和速度測量裝置。
[0045]激光補光裝置是為了解決激發(fā)熒光太弱導致成像不清晰，通過在細胞側向補光來調整光強度，降低延遲積分的時間，減少細胞的高速流動帶來的積分時間過短造成光強偏弱的缺陷。整個補光系統(tǒng)在初次使用時，需要做系統(tǒng)的整體校正，在限定時間內，使得選擇的不同波段的光源強度一致。
[0046]自動對焦裝置解決的是在細胞的高速流動中，選擇最佳的對準位置觸發(fā)拍照，此處用的是激光光點法，通過測量彌散斑的邊緣和尺寸來計算最佳的聚焦位置。
[0047]速度測量裝置利用的激光測距來測定限定時間內細胞的運動距離，折算出細胞的運動速率。配合TDI延遲積分相機，可以準確的捕獲在流動室內的單細胞的圖像。
[0048]進一步地，高內涵圖像流式生物顯微分析方法設計了一套強大的分析軟件，該分析軟件采用熒光和明場的圖像配準技術，校正熒光和明場的成像偏差，使得光斑中心重合，另外通過多光譜PMT光信號和多光譜的熒光圖像來校正圖像的熒光強度，使得輸出的熒光強度與PMT保持一致。該軟件采用熒光圖像和PMT光信號融合分析法，通過PMT光信號來調節(jié)熒光圖像的分割閾值，使得熒光圖像的生成結果與流式細胞儀的結果保持一致性，并且可以通過圖像微觀結構的分析來確定大量細胞中的異常細胞。該軟件可以對每個細胞分析超過500種量化參數(shù)。這些參數(shù)不僅包括細胞整體的散射光和熒光信號強度，還包括對細胞形態(tài)，細胞結構及亞細胞信號分布的分析。通過在細胞群體中對這些參數(shù)進行統(tǒng)計，分析軟件可以生成細胞群體的散點圖和柱狀圖，而這些統(tǒng)計數(shù)據(jù)與細胞圖像是完全整合的，比如點擊散點圖上的點，就可以直觀的看到這個點代表的細胞的圖像。另外，使用者還能夠根據(jù)自身研究的特殊需要，進行自定義參數(shù)的設定，進行更深入的分析。系統(tǒng)可以生成多通道熒光的混合圖像，也可以生成單通道熒光的獨立圖像，并且可以通過軟件選擇所需的熒光通道。
[0049]整個系統(tǒng)可以用于細胞信號轉導/通路分析、細胞間相互作用、分子共定位與胞內分子轉運、細胞形態(tài)學、熒光原位雜交、基因表達分析、細胞凋亡、細胞周期分析、白細胞亞群分析。
[0050]以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的范圍內做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質內容。
【權利要求】
1.一種高內涵圖像流式生物顯微分析方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟1:搭建高內涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)； 步驟2:利用所述高內涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)對細胞進行檢測； 其中，所述高內涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)包括液流系統(tǒng)、光學系統(tǒng)； 液流系統(tǒng)包括流動室,流動室用于接收注入的樣本細胞懸液和系統(tǒng)鞘液中，并使樣本細胞懸液中的細胞在系統(tǒng)鞘液流的約束下聚焦在液流的中心，逐個流過流動室的檢測窗Π ； 光學系統(tǒng)包括光源、光路系統(tǒng)、濾光片堆棧； 所述光源，用于照射通過檢測窗口的細胞，從而產(chǎn)生光信號；光源包括用于產(chǎn)生明場細胞圖像的鹵素燈、用于產(chǎn)生熒光細胞圖像的激光器； 光源照射細胞產(chǎn)生的光信號被物鏡收集，通過兩組楔形光柵分別收集前向光信號、側向光信號到兩個TDI相機中，然后通過光路系統(tǒng)傳遞到主要由多個二向色鏡構成的濾光片堆棧，光信號在濾光片堆棧處被分成不同波段投射到一個六通道PMT陣列上；進而所述光學系統(tǒng)產(chǎn)生一個明場細胞圖像，一個六通道熒光細胞圖像及六個不同波段的PMT光強信號。
2.根據(jù)權利要求1所述的高內涵圖像流式生物顯微分析方法，其特征在于，所述高內涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)還包括激光補光裝置，其中，所述激光補光裝置用于通過在細胞側向補光來調整光強度，降低TDI相機延遲積分的時間，減少細胞的高速流動帶來的積分時間過短造成光強偏弱的缺陷。
3.根據(jù)權利要求1所述的高內涵圖像流式生物顯微分析方法，其特征在于，所述高內涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)還包括自動對焦裝置，其中，所述自動對焦裝置用于利用激光光點法，通過測量彌散斑的邊緣和尺寸來計算細胞的聚焦位置。
4.根據(jù)權利要求1所述的高內涵圖像流式生物顯微分析方法，其特征在于，所述高內涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)還包括速度測量裝置，其中，所述速度測量裝置用于利用激光測距來測定限定時間內細胞的運動距離，折算出細胞的運動速率，所述TDI相機根據(jù)細胞的運動速率捕獲在流動室內的單細胞的圖像。
5.根據(jù)權利要求1所述的高內涵圖像流式生物顯微分析方法，其特征在于，所述高內涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)還包括分析系統(tǒng)，其中，所述分析系統(tǒng)采用熒光和明場的圖像配準方式，校正熒光和明場的成像偏差，使得光斑中心重合，并且通過多光譜PMT光信號和多光譜的熒光圖像來校正圖像的熒光強度，使得輸出的熒光強度與PMT保持一致。
6.根據(jù)權利要求5所述的高內涵圖像流式生物顯微分析方法，其特征在于，所述分析系統(tǒng)通過PMT光信號來調節(jié)熒光圖像的分割閾值，并且通過圖像微觀結構的分析來確定大量細胞中的異常細胞。
7.根據(jù)權利要求1所述的高內涵圖像流式生物顯微分析方法，其特征在于，所述物鏡的孔徑數(shù)值NA大于0.75。
【文檔編號】G01N15/14GK104266956SQ201410443405
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月2日 優(yōu)先權日:2014年9月2日
【發(fā)明者】胡潔, 戚進, 劉超 申請人:上海凱度機電科技有限公司