高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)，包括：液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)；液流系統(tǒng)使樣本細胞懸液中的細胞在系統(tǒng)鞘液流的約束下聚焦在液流的中心，逐個流過流動室的檢測窗口；光學(xué)系統(tǒng)包括光源、光路系統(tǒng)、濾光片堆棧；光源包括鹵素?zé)?、激光器；通過光路系統(tǒng)和由多個二向色鏡構(gòu)成的濾光片堆棧，所述光學(xué)系統(tǒng)產(chǎn)生一個明場細胞圖像，一個六通道熒光細胞圖像及六個不同波段的PMT光強信號。本發(fā)明將流式細胞術(shù)與熒光顯微成像結(jié)合于一身，它具有多個檢測通道，能夠?qū)νㄟ^流動室的細胞逐個采集的細胞圖像，并利用分析軟件對每個細胞圖像進行量化分析，從而提供細胞群的統(tǒng)計數(shù)據(jù)以及細胞形態(tài)學(xué)、細胞結(jié)構(gòu)和亞細胞信號分布的信息。
【專利說明】高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及流式細胞術(shù)，具體地，涉及高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)。

【背景技術(shù)】
[0002]流式細胞術(shù)是一種對液流中排成單列的細胞或其它生物微粒(如微球、細菌、小型模式生物等)逐個進行快速定量分析和分選的技術(shù)。使用傳統(tǒng)的流式細胞檢測技術(shù)，研究人員可以分析成千上萬個細胞，獲得每個細胞的散射光信號和熒光信號的數(shù)值，從而得到細胞群體的各種統(tǒng)計數(shù)據(jù)，并可以找到稀有的細胞亞群。
[0003]但是傳統(tǒng)流式細胞檢測技術(shù)仍然存在局限，那就是獲得的細胞信息很有限。細胞對研究人員來說，只是散點圖上的一個點，而不是真實的細胞圖像，缺乏細胞形態(tài)學(xué)、細胞結(jié)構(gòu)及亞細胞水平信號分布的相關(guān)信息。要想獲得細胞圖像，研究人員就必須使用顯微鏡進行觀察，但顯微鏡能夠觀察的細胞數(shù)量是非常有限的，很難提供細胞群體的量化與統(tǒng)計數(shù)據(jù)。因此，使用傳統(tǒng)的細胞分析技術(shù)，我們就只能面對這樣的兩難選擇，沒有一種技術(shù)可以既提供細胞群體的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，又獲得細胞圖像。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對目前現(xiàn)有技術(shù)中單個流式細胞儀存在的缺陷，本發(fā)明的目的是設(shè)計一個合理的光學(xué)成像系統(tǒng)，其中，能高速采集經(jīng)過鞘液室的單個細胞明場和熒光圖像是設(shè)計的重點，這樣既可以利用明場圖像來觀察細胞的形態(tài)特征，又可以利用熒光來測定細胞中的關(guān)鍵成分，實現(xiàn)流式細胞術(shù)和顯微成像的有機結(jié)合。
[0005]根據(jù)本發(fā)明提供的一種高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)，包括:液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)；
[0006]液流系統(tǒng)包括流動室,流動室用于接收注入的樣本細胞懸液和系統(tǒng)鞘液中，并使樣本細胞懸液中的細胞在系統(tǒng)鞘液流的約束下聚焦在液流的中心，逐個流過流動室的檢測窗口 ；
[0007]光學(xué)系統(tǒng)包括光源、光路系統(tǒng)、濾光片堆棧；
[0008]所述光源，用于照射通過檢測窗口的細胞，從而產(chǎn)生光信號；光源包括用于產(chǎn)生明場細胞圖像的鹵素?zé)?、用于產(chǎn)生熒光細胞圖像的激光器；
[0009]光源照射細胞產(chǎn)生的光信號被物鏡收集，通過兩組楔形光柵分別收集前向光信號、側(cè)向光信號到兩個TDI相機中，然后通過光路系統(tǒng)傳遞到主要由多個二向色鏡構(gòu)成的濾光片堆棧，光信號在濾光片堆棧處被分成不同波段投射到一個六通道PMT陣列上；進而所述光學(xué)系統(tǒng)產(chǎn)生一個明場細胞圖像，一個六通道熒光細胞圖像及六個不同波段的PMT光強信號。
[0010]優(yōu)選地，還包括激光補光裝置，其中，所述激光補光裝置用于通過在細胞側(cè)向補光來調(diào)整光強度，降低TDI相機延遲積分的時間，減少細胞的高速流動帶來的積分時間過短造成光強偏弱的缺陷。
[0011]優(yōu)選地，還包括自動對焦裝置，其中，所述自動對焦裝置用于利用激光光點法，通過測量彌散斑的邊緣和尺寸來計算細胞的聚焦位置。
[0012]優(yōu)選地，還包括速度測量裝置，其中，所述速度測量裝置用于利用激光測距來測定限定時間內(nèi)細胞的運動距離，折算出細胞的運動速率。所述TDI相機根據(jù)細胞的運動速率捕獲在流動室內(nèi)的單細胞的圖像。
[0013]優(yōu)選地，還包括分析系統(tǒng)，其中，所述分析系統(tǒng)采用熒光和明場的圖像配準(zhǔn)方式，校正熒光和明場的成像偏差，使得光斑中心重合，并且通過多光譜PMT光信號和多光譜的熒光圖像來校正圖像的熒光強度，使得輸出的熒光強度與PMT保持一致。
[0014]優(yōu)選地，所述分析系統(tǒng)通過PMT光信號來調(diào)節(jié)熒光圖像的分割閾值，并且通過圖像微觀結(jié)構(gòu)的分析來確定大量細胞中的異常細胞。
[0015]優(yōu)選地，所述物鏡的孔徑數(shù)值NA大于0.75。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果:
[0017]1、本發(fā)明既能提供細胞群的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，又可以獲得單個細胞的圖像，從而提供細胞形態(tài)學(xué)、細胞結(jié)構(gòu)和亞細胞信號分布的信息。
[0018]2、本發(fā)明將流式細胞術(shù)與熒光顯微成像結(jié)合于一身，它具有多個檢測通道，能夠?qū)νㄟ^流動室的細胞逐個采集的細胞圖像，并利用分析軟件對每個細胞圖像進行量化分析，從而提供細胞群的統(tǒng)計數(shù)據(jù)以及細胞形態(tài)學(xué)、細胞結(jié)構(gòu)和亞細胞信號分布的信息。
[0019]3、本發(fā)明可以用于細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)/通路分析、細胞間相互作用、分子共定位與胞內(nèi)分子轉(zhuǎn)運、細胞形態(tài)學(xué)、熒光原位雜交、基因表達分析、細胞凋亡、細胞周期分析、白細胞亞群分析。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將會變得更明顯:
[0021]圖1為本發(fā)明的光路設(shè)計原理不意圖；
[0022]圖2為本發(fā)明的液流系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖。
[0023]圖中:
[0024]I為多通道激光束；
[0025]2為細胞對焦器；
[0026]3為聚光鏡；
[0027]4為分光鏡；
[0028]5為濾光片；
[0029]6 為 PMT ;
[0030]7為楔形光柵；
[0031]8 為 TDI 相機；
[0032]9為分光盤；
[0033]10為二色反光鏡。

【具體實施方式】
[0034]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0035]根據(jù)本發(fā)明提供的高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)，主要由液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、電子系統(tǒng)、流動室等幾大部分組成。
[0036]液流系統(tǒng)包括流動室，液流系統(tǒng)將樣本細胞懸液和系統(tǒng)鞘液注入流動室中，流動室用于使細胞在鞘液流的約束下聚焦在液流的中心，逐個流過流動室的檢測窗口。流動室具有分選功能，當(dāng)實驗設(shè)計中設(shè)定了被分選細胞的特性參數(shù)時，此類細胞在形成液滴時會被充電，使其帶有正電荷或負電荷，未被設(shè)定分選參數(shù)的細胞及空白液滴不帶電荷。帶電荷的液滴在落入電極偏轉(zhuǎn)板的高壓靜電場，依所帶電荷是正或是負而發(fā)生向右或向左道偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器中，完成細胞分選的目的。
[0037]光學(xué)系統(tǒng)包括光源、光路系統(tǒng)、濾光片堆棧。
[0038]光源照射通過檢測窗口的細胞，從而產(chǎn)生光信號；光源分為兩種，一種是用于產(chǎn)生明場細胞圖像的鹵素?zé)?，另一種是用于產(chǎn)生熒光細胞圖像的激光器。
[0039]光源照射細胞產(chǎn)生的光信號被具有很大數(shù)值孔徑(NA:0.75)的物鏡收集，通過兩組楔形光柵收集前向光信號和側(cè)向光信號到兩個TDI相機中，然后通過光路系統(tǒng)傳遞到主要由二向色鏡構(gòu)成的濾光片堆棧，光信號在這里被分成不同波段投射到一個六通道PMT陣列上，整個成像系統(tǒng)產(chǎn)生一個明場細胞圖像，一個六通道熒光細胞圖像及六個不同波段的PMT光強信號。該光路系統(tǒng)能夠自動調(diào)整焦距，并實時測定細胞運動速度，而冷CCD采用時間延遲積分方式進行信號采集，這些手段保證了系統(tǒng)采集到的細胞圖像的質(zhì)量。
[0040]進一步地，高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)的創(chuàng)新點在于光路設(shè)計，結(jié)合了流式細胞儀和顯微成像的優(yōu)點，充分融合了兩者的優(yōu)勢。系統(tǒng)中，設(shè)置了分光鏡，把前向散射光和側(cè)向散射光一分為二，一路通過光電倍增管(PMT)米集信號，另一路通過楔形光柵分解，利用延時積分CCD(TDI)采集圖像信號。實現(xiàn)了宏觀和微觀的有機結(jié)合。
[0041]該系統(tǒng)創(chuàng)新性的設(shè)計了激光補光裝置、自動對焦裝置和速度測量裝置。
[0042]激光補光裝置是為了解決激發(fā)熒光太弱導(dǎo)致成像不清晰，通過在細胞側(cè)向補光來調(diào)整光強度，降低延遲積分的時間，減少細胞的高速流動帶來的積分時間過短造成光強偏弱的缺陷。整個補光系統(tǒng)在初次使用時，需要做系統(tǒng)的整體校正，在限定時間內(nèi)，使得選擇的不同波段的光源強度一致。
[0043]自動對焦裝置解決的是在細胞的高速流動中，選擇最佳的對準(zhǔn)位置觸發(fā)拍照，此處用的是激光光點法，通過測量彌散斑的邊緣和尺寸來計算最佳的聚焦位置。
[0044]速度測量裝置利用的激光測距來測定限定時間內(nèi)細胞的運動距離，折算出細胞的運動速率。配合TDI延遲積分相機，可以準(zhǔn)確的捕獲在流動室內(nèi)的單細胞的圖像。
[0045]進一步地，高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)設(shè)計了一套強大的分析軟件，該分析軟件采用熒光和明場的圖像配準(zhǔn)技術(shù)，校正熒光和明場的成像偏差，使得光斑中心重合，另外通過多光譜PMT光信號和多光譜的熒光圖像來校正圖像的熒光強度，使得輸出的熒光強度與PMT保持一致。該軟件采用熒光圖像和PMT光信號融合分析法，通過PMT光信號來調(diào)節(jié)熒光圖像的分割閾值，使得熒光圖像的生成結(jié)果與流式細胞儀的結(jié)果保持一致性，并且可以通過圖像微觀結(jié)構(gòu)的分析來確定大量細胞中的異常細胞。該軟件可以對每個細胞分析超過500種量化參數(shù)。這些參數(shù)不僅包括細胞整體的散射光和熒光信號強度，還包括對細胞形態(tài)，細胞結(jié)構(gòu)及亞細胞信號分布的分析。通過在細胞群體中對這些參數(shù)進行統(tǒng)計，分析軟件可以生成細胞群體的散點圖和柱狀圖，而這些統(tǒng)計數(shù)據(jù)與細胞圖像是完全整合的，比如點擊散點圖上的點，就可以直觀的看到這個點代表的細胞的圖像。另外，使用者還能夠根據(jù)自身研究的特殊需要，進行自定義參數(shù)的設(shè)定，進行更深入的分析。系統(tǒng)可以生成多通道熒光的混合圖像，也可以生成單通道熒光的獨立圖像，并且可以通過軟件選擇所需的熒光通道。
[0046]整個系統(tǒng)可以用于細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)/通路分析、細胞間相互作用、分子共定位與胞內(nèi)分子轉(zhuǎn)運、細胞形態(tài)學(xué)、熒光原位雜交、基因表達分析、細胞凋亡、細胞周期分析、白細胞亞群分析。
[0047]以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。
【權(quán)利要求】
1.一種高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)，其特征在于，包括:液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)； 液流系統(tǒng)包括流動室,流動室用于接收注入的樣本細胞懸液和系統(tǒng)鞘液中，并使樣本細胞懸液中的細胞在系統(tǒng)鞘液流的約束下聚焦在液流的中心，逐個流過流動室的檢測窗Π ； 光學(xué)系統(tǒng)包括光源、光路系統(tǒng)、濾光片堆棧； 所述光源，用于照射通過檢測窗口的細胞，從而產(chǎn)生光信號；光源包括用于產(chǎn)生明場細胞圖像的鹵素?zé)簟⒂糜诋a(chǎn)生熒光細胞圖像的激光器； 光源照射細胞產(chǎn)生的光信號被物鏡收集，通過兩組楔形光柵分別收集前向光信號、側(cè)向光信號到兩個TDI相機中，然后通過光路系統(tǒng)傳遞到主要由多個二向色鏡構(gòu)成的濾光片堆棧，光信號在濾光片堆棧處被分成不同波段投射到一個六通道PMT陣列上；進而所述光學(xué)系統(tǒng)產(chǎn)生一個明場細胞圖像，一個六通道熒光細胞圖像及六個不同波段的PMT光強信號。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)，其特征在于，還包括激光補光裝置，其中，所述激光補光裝置用于通過在細胞側(cè)向補光來調(diào)整光強度，降低TDI相機延遲積分的時間，減少細胞的高速流動帶來的積分時間過短造成光強偏弱的缺陷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)，其特征在于，還包括自動對焦裝置，其中，所述自動對焦裝置用于利用激光光點法，通過測量彌散斑的邊緣和尺寸來計算細胞的聚焦位置。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)，其特征在于，還包括速度測量裝置，其中，所述速度測量裝置用于利用激光測距來測定限定時間內(nèi)細胞的運動距離，折算出細胞的運動速率，所述TDI相機根據(jù)細胞的運動速率捕獲在流動室內(nèi)的單細胞的圖像。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)，其特征在于，還包括分析系統(tǒng)，其中，所述分析系統(tǒng)采用熒光和明場的圖像配準(zhǔn)方式，校正熒光和明場的成像偏差，使得光斑中心重合，并且通過多光譜PMT光信號和多光譜的熒光圖像來校正圖像的熒光強度，使得輸出的熒光強度與PMT保持一致。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)，其特征在于，所述分析系統(tǒng)通過PMT光信號來調(diào)節(jié)熒光圖像的分割閾值，并且通過圖像微觀結(jié)構(gòu)的分析來確定大量細胞中的異常細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高內(nèi)涵圖像流式生物顯微分析系統(tǒng)，其特征在于，所述物鏡的孔徑數(shù)值NA大于0.75。
【文檔編號】G01N15/14GK104266955SQ201410443148
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月2日
【發(fā)明者】胡潔, 戚進, 劉超 申請人:上海凱度機電科技有限公司