超分辨熒光壽命相關(guān)光譜系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種超分辨熒光壽命相關(guān)光譜系統(tǒng)。激光器a輸出的激光經(jīng)二向色性濾光片a濾光后匯聚至顯微物鏡，激光器b輸出的激光依次經(jīng)位相板和二向色性濾光片b濾光后入射至顯微物鏡；經(jīng)顯微物鏡匯聚的激光照射至樣品臺(tái)，得到待測(cè)樣品的熒光信號(hào)又經(jīng)顯微物鏡匯聚后經(jīng)收集透鏡收集后入射至光電探測(cè)器，光電探測(cè)器輸出的光電信號(hào)輸入至光學(xué)信號(hào)采集器；激光器a和激光器b的同步觸發(fā)信號(hào)輸入至光學(xué)信號(hào)采集器。本發(fā)明超分辨熒光壽命相關(guān)光譜系統(tǒng)，在超分辨的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)熒光壽命相關(guān)光譜，減小了探測(cè)焦斑體積，提高了熒光壽命相關(guān)光譜系統(tǒng)的最大使用濃度；由于使用了熒光壽命分離的方法，相關(guān)分析的信噪比得到了較大的提高，提高了探測(cè)弱信號(hào)的能力。
【專利說明】超分辨熒光壽命相關(guān)光譜系統(tǒng)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種超分辨熒光壽命相關(guān)光譜系統(tǒng)，屬于顯微成像領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 由于非侵入式、三維成像和可特異性標(biāo)記成像等不可替代的優(yōu)勢(shì)，光學(xué)顯微鏡 成為當(dāng)今生命科學(xué)中重要的研究工具，但是由于光學(xué)衍射的限制，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡只能 達(dá)到波長(zhǎng)量級(jí)的空間分辨率，限制了它在納米尺度對(duì)細(xì)胞內(nèi)分子結(jié)構(gòu)和功能研究中的應(yīng) 用。2006年以來各國(guó)研究人員提出了光活化定位顯微鏡（PALM)、隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微鏡 (STORM)、受激福射耗盡（Stimulated emission depletion-STED)顯微鏡等幾種突破衍射 極限的熒光成像新原理，其中STED顯微鏡以其時(shí)間分辨的優(yōu)勢(shì)在對(duì)動(dòng)態(tài)過程的成像應(yīng)用 中具有很大的前景。
[0003] STED顯微鏡作為一種超分辨的共聚焦光學(xué)顯微鏡，是一種掃描成像技術(shù)，它是在 傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡的基礎(chǔ)上，添加一路STED光束，通過調(diào)制STED光束波前在物鏡焦平面上 形成空殼形狀焦斑，將激發(fā)光衍射光斑周圍的熒光分子轉(zhuǎn)換為非輻射態(tài)，實(shí)現(xiàn)了好于50納 米的空間分辨率。目前超分辨的共聚焦光學(xué)顯微鏡的研究還處于起步階段，與其它探測(cè)技 術(shù)的結(jié)合尚未開展。
[0004] 突光相關(guān)光譜（Fluorescence Correlation Spectroscopy-FCS)是一種可以在溶 液中研究熒光標(biāo)記的單個(gè)或多個(gè)分子熒光特性的光學(xué)技術(shù)，通過對(duì)熒光強(qiáng)度波動(dòng)的自相關(guān) 分析可以得到細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記的生物大分子的濃度、擴(kuò)散系數(shù)、化學(xué)反應(yīng)速率常數(shù)等參數(shù)， 因此FCS可以應(yīng)用于研究細(xì)胞內(nèi)DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化、大分子的擴(kuò)散和旋轉(zhuǎn)、細(xì)胞膜的 流動(dòng)特性、細(xì)胞配體與受體的相互作用和化學(xué)反應(yīng)過程分析等，成為生命科學(xué)中單分子研 究的重要工具。
[0005] 但是FCS有一個(gè)很大的缺點(diǎn)是無法區(qū)分?jǐn)U散系數(shù)相近的兩個(gè)分子，而且當(dāng)溶液中 多于兩種突光分子時(shí)的相關(guān)分析更加復(fù)雜，雖然可以使用突光互相關(guān)光譜（Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy-FCCS)技術(shù)探測(cè)多顏色通道使相關(guān)分析簡(jiǎn)化，但是增加 探測(cè)通道會(huì)增加系統(tǒng)的復(fù)雜性，而且還會(huì)面臨串色等問題。
[0006] 為了降低FCCS系統(tǒng)的復(fù)雜性和不確定性，熒光壽命相關(guān)光譜（Fluorescence Lifetime Correlation Spectroscopy-FLCS)技術(shù)被提出來，F(xiàn)LCS系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)是可以 使用一路激發(fā)光和一路探測(cè)裝置，通過熒光壽命的不同從混合溶液中分離出不同的熒光分 子，F(xiàn)LCS可以實(shí)現(xiàn)熒光自相關(guān)和互相關(guān)分析。FLCS系統(tǒng)不僅可以實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)FCCS的功能， 而且簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)FCCS裝置，降低了背景信號(hào)的干擾，所以成為了生命科學(xué)中重要的研究工 具。
[0007] FLCS是基于共聚焦顯微術(shù)的，探測(cè)熒光的區(qū)域?yàn)橐粋€(gè)光學(xué)衍射極限下的艾里斑體 積，F(xiàn)LCS系統(tǒng)獲得的光強(qiáng)波動(dòng)來自于此焦斑內(nèi)所有熒光分子輻射熒光的統(tǒng)計(jì)平均值，由于 衍射極限的限制，共聚焦顯微鏡的有效焦斑體積大于〇. 1飛升，為了獲得信噪比較好的相 關(guān)曲線，通常探測(cè)體積內(nèi)的平均分子數(shù)應(yīng)小于10個(gè)，因此需要溶液濃度小于0. 1微摩爾每 升數(shù)量級(jí)，而細(xì)胞中的許多大分子通常是濃稠的，這嚴(yán)重限制了 FLCS在研究細(xì)胞內(nèi)分子的 運(yùn)動(dòng)中的應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種超分辨熒光壽命相關(guān)光譜系統(tǒng)，通過在共聚焦光學(xué)顯微 鏡中加入第二路調(diào)制光，實(shí)現(xiàn)超分辨的共聚焦光學(xué)顯微成像，突破傳統(tǒng)的光學(xué)衍射極限的 限制；在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)的熒光壽命相關(guān)光譜可以在探測(cè)體積小于共聚焦衍射斑體積下探測(cè) 熒光強(qiáng)度的波動(dòng)，提高了 FLCS可探測(cè)的最大濃度。
[0009] 本發(fā)明所提供的超分辨熒光壽命相關(guān)光譜系統(tǒng)中，激光器a輸出的激光經(jīng)二向色 性濾光片a濾光后匯聚至顯微物鏡，激光器b輸出的激光依次經(jīng)位相板和二向色性濾光片b 濾光后入射至所述顯微物鏡；經(jīng)所述顯微物鏡匯聚的激光照射至樣品臺(tái)，得到待測(cè)樣品的 熒光信號(hào)又經(jīng)所述顯微物鏡匯聚后經(jīng)收集透鏡收集后入射至光電探測(cè)器，所述光電探測(cè)器 輸出的光電信號(hào)輸入至光學(xué)信號(hào)米集器；
[0010] 所述激光器a和所述激光器b的同步觸發(fā)信號(hào)輸入至所述光學(xué)信號(hào)采集器。
[0011] 上述的超分辨突光壽命相關(guān)光譜系統(tǒng)中，所述激光器a輸出和所述激光器b輸出 的激光在匯聚至所述顯微物鏡之前均經(jīng)一反射鏡，以調(diào)整光路對(duì)準(zhǔn)。
[0012] 上述的超分辨熒光壽命相關(guān)光譜系統(tǒng)中，所述待測(cè)樣品的熒光信號(hào)在入射至所述 收集透鏡之前經(jīng)過一反射鏡和一濾波片，分別用于對(duì)準(zhǔn)光路和濾除激發(fā)光。
[0013] 上述的超分辨熒光壽命相關(guān)光譜系統(tǒng)中，所述光學(xué)信號(hào)采集器與控制采集處理軟 件相連接，由所述控制采集處理軟件進(jìn)行重構(gòu)和處理獲得超分辨熒光顯微圖像和相關(guān)曲 線。
[0014] 上述的超分辨熒光壽命相關(guān)光譜系統(tǒng)中，所述控制采集處理軟件與位移控制器相 連接，所述位移控制器與所述樣品臺(tái)相連接，用于控制所述樣品臺(tái)的移動(dòng)。
[0015] 本發(fā)明提供的超分辨熒光壽命相關(guān)光譜系統(tǒng)具有以下有益效果：
[0016] 1、在一套成像平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)光學(xué)超分辨成像，提高了傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡成像的分辨 率。
[0017] 2、在超分辨的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)熒光壽命相關(guān)光譜，減小了探測(cè)焦斑體積，提高了熒光 壽命相關(guān)光譜系統(tǒng)的最大使用濃度。
[0018] 3、由于使用了熒光壽命分離的方法，相關(guān)分析的信噪比得到了較大的提高，提高 了探測(cè)弱信號(hào)的能力。
[0019] 4、相比較于傳統(tǒng)的FCS，熒光壽命相關(guān)光譜技術(shù)使用了分離熒光強(qiáng)度再做互相關(guān) 的技術(shù)，可以消除探測(cè)器跟隨脈沖對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶了的干擾。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明提供的超分辨熒光壽命相關(guān)光譜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0021] 圖中各標(biāo)記如下：1激光器a、2二向色性濾光片a、3激光器b、4位相板、5二向色 性濾光片b、6反射鏡a、7顯微物鏡、8樣品臺(tái)、9位移控制器、10反射鏡b、ll濾波片、12收 集透鏡、13光電探測(cè)器、14光學(xué)信號(hào)采集器、15控制采集處理軟件。
[0022] 圖2為使用本發(fā)明系統(tǒng)對(duì)熒光微球溶液進(jìn)行的熒光相關(guān)光譜測(cè)量，與共聚焦熒光 相關(guān)光譜曲線（右側(cè)曲線）比，超分辨熒光相關(guān)光譜的相關(guān)曲線（左側(cè)）相關(guān)時(shí)間較短。

【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不局限于以下實(shí)施例。
[0024] 本發(fā)明提供的基于受激福射耗盡突光顯微術(shù)的突光相關(guān)光譜系統(tǒng)，激光器al輸 出的激光經(jīng)二向色性濾光片a2濾光后經(jīng)反射鏡a6反射后匯聚至顯微物鏡7,激光器b3輸 出的激光依次經(jīng)位相板4和二向色性濾光片b5濾光后經(jīng)反射鏡a6反射后匯聚至顯微物鏡 7 ;經(jīng)過顯微物鏡7匯聚的激光照射至樣品臺(tái)8上，待測(cè)樣品的熒光信號(hào)又經(jīng)顯微物7匯聚 后經(jīng)反射鏡a6、二向色性濾光片a2、二向色性濾光片b5、反射鏡blO、濾波片11和收集透鏡 12收集后入射至光電探測(cè)器13,光電探測(cè)器13輸出的光電信號(hào)輸入至光學(xué)信號(hào)米集器14 ; 光學(xué)信號(hào)采集器14和位移控制器9均與控制采集處理軟件15相連接，用于控制樣品臺(tái)8 的移動(dòng)和采集光學(xué)信號(hào)采集器14的數(shù)據(jù)。同時(shí)，激光器al和所述激光器b3的同步觸發(fā)信 號(hào)輸入至光學(xué)信號(hào)米集器14中。
[0025] 本發(fā)明提供的系統(tǒng)中，激發(fā)用激光器al經(jīng)過二向色性濾光片a2、反射鏡a6反射入 顯微物鏡7,經(jīng)顯微物鏡7匯聚后，激發(fā)樣品發(fā)射熒光；退激發(fā)用激光器b3,經(jīng)過位相板4調(diào) 整光束波前，經(jīng)二向色性濾光片b5和反射鏡a6反射后，經(jīng)顯微物鏡7匯聚后形成空殼型焦 斑，將激發(fā)光激發(fā)的熒光斑周圍熒光分子退激發(fā)，最后只有小體積的熒光分子自發(fā)輻射熒 光，實(shí)現(xiàn)受激輻射耗盡超分辨光學(xué)成像；樣品臺(tái)8連接位移控制器9,在控制采集處理軟件 15的控制下對(duì)樣品進(jìn)行掃描，同時(shí)獲得不同位置的光學(xué)信號(hào)。熒光信號(hào)經(jīng)顯微物鏡7收集 后，經(jīng)反射鏡a6和反射鏡blO反射后，由濾波片11濾除熒光以外的其它光，經(jīng)收集透鏡12 匯聚后，由光電探測(cè)器13轉(zhuǎn)換為電信號(hào)；由光電探測(cè)器13獲得的電信號(hào)連接光學(xué)信號(hào)采集 器13,由控制采集處理軟件15進(jìn)行重構(gòu)和處理獲得超分辨熒光顯微圖像。
[0026] 使用上述系統(tǒng)對(duì)熒光標(biāo)記的40納米直徑的納米微球進(jìn)行了超分辨光學(xué)成像試 驗(yàn)，其中光學(xué)超分辨顯微圖像的分辨率已經(jīng)達(dá)到50nm的橫向空間分辨率，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過傳統(tǒng)的 共聚焦顯微鏡。
[0027] 使用上述系統(tǒng)對(duì)40納米熒光微球的溶液進(jìn)行了超分辨熒光相關(guān)光譜實(shí)驗(yàn)，如圖2 所示，左側(cè)曲線為超分辨熒光相關(guān)光譜相關(guān)曲線，右側(cè)曲線為共聚焦熒光相關(guān)光譜相關(guān)曲 線，從圖2中可以得出超分辨熒光擴(kuò)散時(shí)間小于共聚焦熒光擴(kuò)散時(shí)間，這說明本發(fā)明超分 辨熒光相關(guān)光譜的探測(cè)體積小于共聚焦熒光相關(guān)光譜的探測(cè)體積。
【權(quán)利要求】
1. 超分辨熒光壽命相關(guān)光譜系統(tǒng)，其特征在于： 激光器a輸出的激光經(jīng)二向色性濾光片a濾光后匯聚至顯微物鏡，激光器b輸出的激 光依次經(jīng)位相板和二向色性濾光片b濾光后入射至所述顯微物鏡；經(jīng)所述顯微物鏡匯聚的 激光照射至樣品臺(tái)，得到待測(cè)樣品的熒光信號(hào)又經(jīng)所述顯微物鏡匯聚后經(jīng)收集透鏡收集后 入射至光電探測(cè)器，所述光電探測(cè)器輸出的光電信號(hào)輸入至光學(xué)信號(hào)采集器； 所述激光器a和所述激光器b的同步觸發(fā)信號(hào)輸入至所述光學(xué)信號(hào)采集器。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于：所述激光器a輸出和所述激光器b輸出 的激光在匯聚至所述顯微物鏡之前均經(jīng)一反射鏡。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的系統(tǒng)，其特征在于：所述待測(cè)樣品的熒光信號(hào)在入射至 所述收集透鏡之前經(jīng)過一反射鏡和一濾波片。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其特征在于：所述光學(xué)信號(hào)采集器與控制 采集處理軟件相連接。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的系統(tǒng)，其特征在于：所述控制采集處理軟件與位移控制器相 連接，所述位移控制器與所述樣品臺(tái)相連接。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK104089935SQ201410332038
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年7月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月11日
【發(fā)明者】于建強(qiáng), 袁景和, 方曉紅 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所