多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑及其制備方法與應(yīng)用，涉及化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。所述多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑的原料組成如下：化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物；多聚物骨架；配體、受體或官能團(tuán)。所述多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑的制備方法：1）多聚物骨架修飾；2）配體或受體修飾；3）配體-多聚物共軛體或受體-多聚物共軛體的合成；4）多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑的合成。所述多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑可廣泛應(yīng)用于醫(yī)療診斷、生物技術(shù)、生物醫(yī)藥、生命科學(xué)、食品安全、環(huán)保檢測等領(lǐng)域。具體來說，多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑的最普遍應(yīng)用是免疫分析診斷，其次為新藥研發(fā)中配體-受體之間相互作用分析，再次是核酸或基因檢測。
【專利說明】多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，尤其是涉及多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑及其制備方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]化學(xué)發(fā)光是指在化學(xué)反應(yīng)過程中產(chǎn)生可見光的一種現(xiàn)象，通常是指一些化合物在沒有紫外光或可見光照射的情況下，通過吸收化學(xué)能，從基態(tài)激發(fā)至激發(fā)態(tài)，在退激時(shí)釋放能量產(chǎn)生光子，實(shí)現(xiàn)化學(xué)能到光能裝換，從而導(dǎo)致發(fā)光的現(xiàn)象。通過測量化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的光強(qiáng)度，可對痕量化合物的含量進(jìn)行精準(zhǔn)定量分析。近年來發(fā)展起來的化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)(chemiluminescent immunoassay, CLIA)是化學(xué)發(fā)光技術(shù)與免疫學(xué)方法相結(jié)合的產(chǎn)物，不但具有發(fā)光檢測的高度靈敏性，而且還具有免疫分析的高度特異性。同時(shí)，化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)不僅檢測快速、可實(shí)現(xiàn)高通量檢測，而且避免傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記試劑的使用，從而避免放射性危害，減少對環(huán)境的沖擊?；瘜W(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)的檢測靈敏度是目前光學(xué)檢測中最好的技術(shù)之一，最低檢測限(LOD)可達(dá)10_21mol / L。
[0003]目前最廣泛的化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)可分為板式化學(xué)發(fā)光和管式化學(xué)發(fā)光。板式化學(xué)發(fā)光使用抗體包被的96孔或更多孔的多孔板，通過抗體-抗原的特異性作用把檢測目標(biāo)(抗原)從樣品中提取出來，加入化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的抗體后形成“三明治(sandwich)”夾心層。根據(jù)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記種類的不同，板式化學(xué)發(fā)光既可是酶促化學(xué)發(fā)光，也可是非酶促化學(xué)發(fā)光。酶促化學(xué)發(fā)光技術(shù)使用酶標(biāo)記，常用的酶有辣根過氧化物酶(horse radishperoxidase, HRP)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、黃嘌呤氧化酶等。其最大特點(diǎn)是通過酶的催化作用放大發(fā)光信號，從而提高檢測靈敏度。同時(shí)，發(fā)光過程中作為標(biāo)記物的酶基本不被消耗，而反應(yīng)體系中發(fā)光底物試劑充分過量，發(fā)光信號強(qiáng)而穩(wěn)定，發(fā)光時(shí)間較長，可采用速率法測量。因此，酶促化學(xué)發(fā)光檢測方式簡單、成本較低、靈敏度高。非酶促化學(xué)發(fā)光技術(shù)也被稱之為直接化學(xué)發(fā)光，使用吖唳酯(acridanium ester,AE)或異魯米諾(如aminobutylethylisoluminol, ABEI),特點(diǎn)是不使用生物酶、可簡化化學(xué)發(fā)光檢測過程、降低試劑成本，但在其發(fā)光過程中作為標(biāo)記物的發(fā)光劑會被消耗，導(dǎo)致發(fā)光信號持續(xù)時(shí)間較短。另外，由于發(fā)光劑被很快消耗，只能進(jìn)行一次性測量。
[0004]管式化學(xué)發(fā)光是最近發(fā)展起來的一種新型化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)，使用磁性或非磁性微粒作為包被載體。比起板式化學(xué)發(fā)光來說，管式化學(xué)發(fā)光有著不少優(yōu)勢，特別是使用磁性微粒的管式發(fā)光技術(shù)，在大型、全自動(dòng)的診斷儀上有著廣泛的應(yīng)用。當(dāng)然，管式化學(xué)發(fā)光也有其弱點(diǎn)，包括如何降低散射作用對檢測靈敏度的影響、如何控制磁性微粒體積分布均勻、如何保證磁性微粒-抗體共軛體的質(zhì)量、如何避免磁性微粒的聚合問題等。
[0005]國內(nèi)目前普遍使用異魯米諾(ABEI)作為直接化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，雖然異魯米諾標(biāo)記很穩(wěn)定，但其發(fā)光效率不高。而相對于異魯米諾來講，吖啶酯則具有高得多的發(fā)光效率，是歐美國家所采用的直接化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。吖啶酯標(biāo)記好的蛋白或抗體曾遇到過標(biāo)記物穩(wěn)定性的問題，但可通過使用合適的緩沖液來解決；這些新技術(shù)進(jìn)一步擴(kuò)大了吖啶酯在生命科學(xué)、特別是生物診斷領(lǐng)域的應(yīng)用。吖啶酯雖有較異魯米諾更好的化學(xué)發(fā)光特性，但在超低濃度檢測時(shí)也會遇到靈敏度不夠的問題。正是因?yàn)檫@種需求促使我們尋求更好的直接化學(xué)發(fā)光標(biāo)記技術(shù)。
[0006]利用多聚效應(yīng)的概念來提高靈敏度或藥效是最近發(fā)展起來的一種新型生命科學(xué)技術(shù)，典型例子包括多價(jià)藥物(Polyvalent drug) (M.Mammen, S.-K.Choi, andG.M.Whitesides Angew.Chem.1nt.Ed.1998，37，2754-2794)和多聚辣根過氧化酶(PolyHRP)(C.A.Marquette and L.J.Blum Bioanalysis, 2009, I(7), 1259-1269 ；S.DhawanExpert Rev Mol Diagn6 (5)，749，2006)。前者在抗癌藥物、抗病毒藥物及其它藥物開發(fā)上別具一格，后者在提高酶免檢測靈敏度技術(shù)上應(yīng)用廣泛。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于針對直接化學(xué)發(fā)光生化分析(特別是酶聯(lián)免疫分析)檢測技術(shù)中面對的靈敏度問題，提供一種可提高發(fā)光效率、增強(qiáng)檢測靈敏度的多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑及其制備方法。
[0008]所述多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑的原料組成如下:
[0009]化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物(chemiluminescentlabel)；
[0010]多聚物骨架(polymericbackbone)；
[0011]配體(ligand)、受體(receptor)或官能團(tuán)(functionalgroup)。
[0012]所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物為任何通過吸收化學(xué)能而發(fā)光的標(biāo)記物，可選自:
[0013]a) Π丫唳酮系列如Π丫唳酯(acridinium ester, AE)及其衍生物,包括磺基化的Π丫唳酯(sulfonated acridinium ester, SAE), APS-5(9-(4-chlorophenylthiophosphoryl-oxymethylidene)-10-methylacridan)及其衍生物等；
[0014]b)酰肼系列,如魯米諾(111111；[1101)、異魯米諾(180111111；[1101)、魯米諾相關(guān)的酰肼或環(huán)酸餅(cyclic hydrazides)；
[0015]c)苯多酌系列，如鄰苯三酌'(pyrogallol)、間苯三酌'(phioroglucinol)'間苯二釀(rescorcinol)；
[0016]d)金剛烷(dioxetane)系列，如3_(2_螺旋金剛烷_4_甲氧基_4_甲基_4-(3_磷酸氧基)-苯基-1，2-二氧乙烷(AMPPD)；
[0017]e)其它系列，如過氧草酸酯、光澤精、洛粉堿等。
[0018]f )能量轉(zhuǎn)移類發(fā)光標(biāo)記物，可選自能量轉(zhuǎn)移類的魯米諾衍生物(energy-transferluminol derivative),所述能量轉(zhuǎn)移類的魯米諾衍生物可選自魯米諾-Π丫唳酮(luminol-acridone)共軛體；或魯米諾-突光素(luminol-fIuorescein)共軛體；或魯米諾-羅丹明(luminol-rhodamine)共軛體；其中，吖唳酮、突光素、羅丹明是能量受體(參見文獻(xiàn) J.Pharma&Biomed.Anal.12, 433-462，1994、Biotech Annual Rev.9, 199, 2003 及Methods in Enzymology, Vol.LVII409, 1978),其它能量受體可同樣被采用。
[0019]所述多聚物骨架為:
[0020]I)含有多個(gè)供化學(xué)發(fā)光標(biāo)記修飾的官能團(tuán)的人造多聚物或天然多聚物，可選自葡聚糖(chitosan)、瓊脂糖(agarose)、纖維素(cellulose)、聚乙烯亞胺(PEI,polyethyIeneimine)>聚丙烯酸及其衍生物、樹狀納米微球(dendrimer)、聚賴氨酸(polylysine)、牛血清白蛋白(BSA，bovine serum albumin)、人血清白蛋白(HSA, humanserum albumin)或其它蛋白質(zhì)、多肽(peptide)等。
[0021]2)特殊化學(xué)修飾的核酸?，F(xiàn)代核酸化學(xué)技術(shù)已發(fā)展出很多有效的化學(xué)修飾來引入化學(xué)標(biāo)記。舉例來說，在堿基的非堿基配對位置上引入氨基以加上熒光標(biāo)記是基因測序技術(shù)中常用技術(shù)。這些氨基同樣可以用來標(biāo)記吖啶酯或其它化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，從而產(chǎn)生以DNA為骨干的多聚吖啶酯。在核苷酸糖環(huán)或磷酸基上亦可通過化學(xué)修飾引入吖啶酯或異魯米諾。特別值得指出的是樹狀DNA (branched DNA)是一類很好的多聚物骨架。
[0022]所述配體是相互間具有特異性作用配對中的一方，如抗原-抗體、配體-受體、DNA堿基配對或RNA堿基配對、底物-酶、配體-蛋白等。配體可選自生物配體(bioaffinityligand)包括生物素(biotin)、亞氨基生物素(2_iminobiotin)、唾液酸(sialic acid)、葉酸(folic acid)、凝集素(lectin)、伴刀豆凝集素 A (Concanavalin A，ConA)、|丐調(diào)素(Calmodulin)、肝素(heparin)、抗原(antigen)、精氨酸(arginine)、賴氨酸(Lysine)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、地高辛(digcxin)、透明質(zhì)酸(Hyaluronicacid，HA)、苯硼酸(phenylboric acid)、明膠(gelatin)、憐酸腺苷(AMP，Adenosinemonophosphate)、二憐酸腺苷(ADP,Adenosine diphosphate)、三憐酸腺苷(ATP,Adenosinetriphosphate)、煙酸胺腺^^票呤二核苷酸(NAD，Nicotinamide adenine dinucleotide)、煙酉先胺腺11票呤二核苷酸憐酸(NADP，Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)、苯甲脈(benzimidine )、汽巴隆藍(lán)(Cibacron Blue)、普施安紅(Procion Red)、DNA 片段、RNA 片段、荷爾蒙多肽、激素、熒光素(fluOToscein)等。
[0023]所述受體是相互間具有特異性作用配對中的另一方，可選自鏈霉親和素(streptavidin)、抗生物素蛋白(avidin)、NutraAvidin、抗體(antibody)、G 蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)及其它細(xì)胞表面受體(cellular receptor)、生物酶、其它特殊蛋白等；其中親和素或抗生物素蛋白及其衍生物與生物素之間的作用力是共價(jià)鍵之外最強(qiáng)的，因此被廣泛應(yīng)用；而抗體則是一類非常有用的受體，常用抗原-抗體配對包括熒光素-抗熒光素抗體、地高辛-抗地高辛抗體等。
[0024]所述官能團(tuán)是可用來修飾抗體或DNA或其它生物分子的化學(xué)基團(tuán)，通過它們可對這些生物分子進(jìn)行標(biāo)記，可選自醒基(aldehyde)、氨基(amine)、羧基(carboxyl)、巰基(thiol)、炔基(alkyne)、疊氮(azido)、氧氨(oxyamine)、肼(hydrazide)、α -鹵代羧基(α -halocarboxyl)、異氰酸酯(isocyanate)、異硫氰酸酯(isothiocyanate)、N-羥基琥?白酯(NHS ester)、環(huán)氧化物(epoxide)、環(huán)氧乙焼(oxirane)、氮丙唳(aziridine)、馬來酉先亞胺(maleimide)、乙烯砜(vinylsulfone)、娃醇基(silanol)、螯合劑(chelator)等；所述官能團(tuán)(functional group)可進(jìn)一步選自生物共軛反應(yīng)配對中的一個(gè):a) SFB (甲酉先基苯甲酸N-羥基玻?自酸亞胺酯，succinimidyl-4-formyl benzoate)或SANH (2，5_ 二氧批咯焼 _1_ 基 _6_(2_(丙-2-亞基)月井基)煙酸，succinamidyl6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone);其中SANH更具吸引力，因?yàn)槠渑鋵梢允浅齋FB之外的其它醒基，而很多生物分子，如抗體，可通過氧化產(chǎn)生醒基；b) SMCC (4-(Maleimidomethyl)cyclohexanecarboxylic acid)或疏基；c)點(diǎn)擊化學(xué)(Click Chemistry)配對；d)原生化學(xué)鏈接(Native Chemical Ligation) ;e)狄爾斯-阿爾德反應(yīng)(Diels-Alder Reaction)等。
[0025]上述概念很容易從圖1的綜合性描述中理解認(rèn)識。作為特殊例子，以抗體為配體的多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑展示在圖2。抗體在生物分析檢測、疾病診斷(特別是免疫診斷)、生命科學(xué)、生物醫(yī)藥、食品安全，甚至環(huán)境保護(hù)檢測等領(lǐng)域占有獨(dú)特地位。因此，多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的抗體具有重要的應(yīng)用價(jià)值和廣泛的應(yīng)用范圍。
[0026]這里要指出的是所述配體-受體系統(tǒng)可交互使用，也就說如果選擇用配體修飾多聚吖啶酯，則可用受體修飾要標(biāo)記的目標(biāo)如蛋白質(zhì)；反之亦然。此方法同樣適用于共軛配對，也就說，如果共軛配對中的一個(gè)被用來修飾多聚吖啶酯，則另一個(gè)可用來修飾要標(biāo)記的目標(biāo)如蛋白質(zhì)。而所述官能團(tuán)則可利用其特殊反應(yīng)性來標(biāo)記目標(biāo)。其中最廣泛應(yīng)用的基團(tuán)包括N-輕基琥拍酯(NHS ester)、馬來酰亞胺(maleimide)、羧基、氨基、齒素、羰基、肼等。
[0027]另一方面，如果用核酸(如人工化學(xué)合成的寡聚脫氧核糖核酸(ODN)、DNA或基因片段或RNA)做骨架，核酸序列本身就是配體，可通過經(jīng)典的Watson-Crik堿基互補(bǔ)配對原則來檢測目標(biāo)基因或目標(biāo)RNA。
[0028]值得指出的是,本發(fā)明的主要應(yīng)用方向除化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescentimmunoassay, CLIA)之外,還可用于核酸(包括DNA、RNA,特別是基因)檢測、食品安全、環(huán)保檢測、生物醫(yī)藥開發(fā)、生命科學(xué)等領(lǐng)域。
[0029]所述多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑的制備方法，包括以下步驟:
[0030]I)多聚物骨架(polymeric backbone)修飾
[0031]根據(jù)多聚物不同的結(jié)構(gòu)以及配體-多聚物共軛體不同的合成方法需要設(shè)計(jì)不同的多聚物骨架修飾方法；
[0032]若生物共軛化學(xué)是以SFB及SANH為基礎(chǔ)的，則需要在多聚物上修飾SFB或SANH，以便與SANH或SFB修飾的配體進(jìn)行配對反應(yīng)從而制備配體-多聚物共軛物；
[0033]若其它生物共軛反應(yīng)配對，包括SMCC-巰基、點(diǎn)擊化學(xué)(Click Chemistry)配對、原生化學(xué)鏈接(Native Chemical Ligation)、狄爾斯-阿爾德反應(yīng)(Diels-AlderReaction)等亦可應(yīng)用于此；
[0034]若生物素(Biotin)引入到多聚物上，其方法包括NHS-活化的生物素與含氨基的多聚物形成酰胺鍵；
[0035]若酶鏈親和素(Streptavidin),通過EDC稱合反應(yīng)引入到多聚物上；
[0036]其它方法包括還原性席夫堿形成、α -鹵素取代、芳香疊氮(aryl azide)光化學(xué)等(見 G.T.Hermanson “Bioconjugate Techniques” 2008)都可用于多聚物的修飾。
[0037]2)配體(ligand)或受體(receptor)修飾
[0038]根據(jù)配體的結(jié)構(gòu)以及多聚物骨架上所含的官能團(tuán)的不同需要設(shè)計(jì)不同的修飾方法，尤其需要據(jù)生物共軛反應(yīng)配對來設(shè)計(jì)與多聚物互補(bǔ)的修飾化學(xué)，以上所述多聚物修飾化學(xué)也適用于配體的修飾，包括配體的NHS活化、生物共軛配對修飾、點(diǎn)擊化學(xué)、原生化學(xué)鏈接、狄爾斯-阿爾德反應(yīng)、席夫堿形成等，類似生物共軛化學(xué)技術(shù)可同樣應(yīng)用到受體(receptor)的修飾上。
[0039]3)配體-多聚物共軛體或受體-多聚物共軛體的合成
[0040]當(dāng)多聚物、配體在被適當(dāng)?shù)幕鶊F(tuán)修飾后(上述步驟I和2)，生物共軛反應(yīng)可合成相應(yīng)的配體-多聚物共軛體；
[0041]若配體是NHS-活化的，而多聚物含有氨基，則通過酰胺鍵的形成合成配體-多聚物共軛體；
[0042]若配體是SFB修飾的，而多聚物是SANH，則通過SFB-SANH間獨(dú)特的席夫堿形成可合成配體-多聚物共軛體。在此領(lǐng)域的化學(xué)家可根據(jù)文獻(xiàn)(G.T.HermansoniiBioconjugateTechniques” 2008)很容易設(shè)計(jì)多種合成方法。同時(shí)，此處的“配體”可理解為一個(gè)廣泛的概念，即可指傳統(tǒng)意義上的配體，也可指受體。
[0043]除配體及受體之外，一些特殊的官能團(tuán)可直接用來標(biāo)記目標(biāo)分子，所述特殊的官能團(tuán)包括醒基(aldehyde)、氨基(amine)、羧基(carboxyl)、巰基(thiol)、炔基(alkyne)、疊氮(azido)、氧氨(oxyamine)、肼(hydrazide)、α -鹵代羧基(a -halocarboxyl )、異氰酸酯(isocyanate)、異硫氰酸酯(isothiocyanate)、N-羥基琥拍酯(NHS ester)、環(huán)氧化物(6口(《丨(16)、環(huán)氧乙燒((《;[以116)、氮丙卩定(32；[1^(1;[116)、馬來酰亞胺(maleimide)、乙烯砜(vinylsulfone)、娃醇基(siIanol)等,這些基團(tuán)可與目標(biāo)分子中的相應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)而形成共軛鍵來標(biāo)記。
[0044]4)多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑的合成
[0045]對步驟3)的共軛體引入化學(xué)發(fā)光標(biāo)記基團(tuán)，利用NHS-活化的吖啶酯對含氨基共軛體的修飾，若氨基修飾的ABEI，則可通過EDC耦合反應(yīng)或還原性席夫堿的形成而引入；若吖啶酯或ABEI被其它官能團(tuán)所修飾，則其它方法包括點(diǎn)擊化學(xué)、SMCC-巰基化學(xué)等亦可用來引入化學(xué)發(fā)光基團(tuán)。
[0046]在步驟I)中，所述多聚物骨架(polymeric backbone)修飾,根據(jù)多聚物不同的結(jié)構(gòu)以及配體-多聚物共軛體不同的合成方法需要設(shè)計(jì)不同的多聚物骨架修飾方法；一些多聚物可能不需修飾，比如含官能團(tuán)氨基的多聚物(BSA、PE1、樹狀納米微球、聚賴氨酸等)可以利用其氨基，與NHS-活化的配體可進(jìn)行直接反應(yīng)合成配體-多聚物。
[0047]所述多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑的應(yīng)用如下:
[0048]所述多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑可廣泛應(yīng)用于醫(yī)療診斷、生物技術(shù)、生物醫(yī)藥、生命科學(xué)、食品安全、環(huán)保檢測等領(lǐng)域。具體來說，多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑的最普遍應(yīng)用是免疫分析診斷，其次為新藥研發(fā)中配體-受體(ligand-receptor)之間相互作用分析,再次是核酸或基因檢測。
[0049]a)免疫診斷分析
[0050]鏈霉親和素(streptavidin)被廣泛用來修飾抗體形成抗體-親和素共軛物。通過親和素-生物素之間非常強(qiáng)的作用力(親和系數(shù)為1.3X IO15IT1)可引入含生物素的多聚吖啶酯。通過生物共軛技術(shù)，多聚吖啶酯可用來標(biāo)記抗原或抗體。常用的共軛技術(shù)包括SFB與SANH配對、SMCC與巰基配對等。因此，含SFB的多聚吖啶酯可用來標(biāo)記含SANH的抗體或抗原；含SANH的多聚吖唳酯還可用來標(biāo)記NaIO4氧化后的抗體(形成腙鍵，hydrozone)；而含SMCC的多聚吖啶酯可用來巰基化的抗體。一旦被多聚吖啶酯所標(biāo)記，抗體或抗原便可被用于化學(xué)發(fā)光免疫診斷分析。
[0051]b)配體-受體(ligand-receptor)作用分析
[0052]配體-受體作用是生命科學(xué)中最重要的作用之一，對于新藥研發(fā)、各類疾病原理的揭示等具有指導(dǎo)性意義。通過多聚吖啶酯標(biāo)記的小分子配體可研究癌癥等疾病細(xì)胞表面的受體，從而對新 藥研發(fā)、疾病原理研究提供有效的化學(xué)發(fā)光檢測手段。舉例來講，葉酸(folic acid)可被引入到多聚卩丫唳酯修飾的樹狀納米微球(dendrimer)上,通過葉酸-葉酸受體間的特異性作用可研究癌癥細(xì)胞在抗癌新藥作用下的變化從而為新藥開發(fā)提供高效的分析工具。[0053]c)基因分析
[0054]核酸或基因的最突出特點(diǎn)是堿基配對(base-pairing)作用，被廣泛應(yīng)用于基因或核酸分析。目前應(yīng)用最多的是基因的熒光分析，包括熒光基因測序，其關(guān)鍵是熒光標(biāo)記的核苷(fluorescent nucleotides)或引物(fluorescent primers)。此突光標(biāo)記可被化學(xué)發(fā)光標(biāo)記如B丫唳酯所取代，形成化學(xué)發(fā)光核苷或引物(chemiluminescent nucleotides orprimers),可用于化學(xué)發(fā)光的基因分析。
[0055]舉例來說，利用化學(xué)發(fā)光雜交保護(hù)分析的原理可檢測空腸彎曲菌、單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌、大腸桿菌0157和金黃色葡萄球菌4種致病菌特異性RNA序列，這種方法無需物理分離，利用吖啶酯標(biāo)記DNA探針，通過核酸雜交保護(hù)分析法，即應(yīng)用人工合成的靶DNA保守區(qū)的寡核苷酸，在合成時(shí)引入一個(gè)烷氨基的手臂，經(jīng)活化后接上吖啶酯，制成化學(xué)發(fā)光探針。雜交后無需分離步驟，而是利用差分水解來鑒別，即加入堿性溶液，游離的發(fā)光探針遇堿水解失去發(fā)光特性，而與特異性目的片段結(jié)合的探針形成DNA-RNA雜交體，由于吖啶酯是平面結(jié)構(gòu)很容易進(jìn)入雙螺旋的內(nèi)部而獲得雜交保護(hù)，水解速度緩慢(半衰期達(dá)IOmin以上)，仍有發(fā)光性能，可以在發(fā)光儀上顯示化學(xué)發(fā)光信號，從而實(shí)現(xiàn)對病原菌的檢測。
[0056]本發(fā)明的核心技術(shù)是化學(xué)發(fā)光標(biāo)記(如吖啶酯、ABE1、金剛烷、APS-5等)的多聚化，從而提高化學(xué)發(fā)光量(幾倍到幾十倍)，進(jìn)而提高免疫分析、基因檢測等生物分析的靈敏度。另一個(gè)特點(diǎn)是本發(fā)明利用生命科學(xué)中最重要的抗原-抗體、配體-受體、堿基配對等特異性作用開發(fā)產(chǎn)品，選擇性高、應(yīng)用范圍廣泛，具有高度商業(yè)前景。
[0057]本發(fā)明的基本思想也是利用多聚效應(yīng)將高效發(fā)光的吖啶酯、魯米諾或其它化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物制備成多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑以進(jìn)一步提高其發(fā)光量及靈敏度。
[0058]本發(fā)明為化學(xué)發(fā)光免疫分析領(lǐng)域或基因檢測領(lǐng)域提供一種新的、高效化學(xué)發(fā)光標(biāo)記技術(shù)，其技術(shù)核心是帶有多個(gè)發(fā)光標(biāo)記基團(tuán)(如吖啶脂、魯米諾、異魯米諾、酰肼或環(huán)酰肼、金剛烷等)的多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，其中標(biāo)記基團(tuán)可用來標(biāo)記生物大分子(如抗體、蛋白質(zhì)、多糖、DNA、RNA、基因或其它生物大分子)或生物小分子(如生物素、激素、荷爾蒙、類固醇等)。相對于單個(gè)吖啶酯標(biāo)記來說，多聚吖啶酯標(biāo)記可提高標(biāo)記物的發(fā)光強(qiáng)度，從而提高檢測靈敏度，對于超低濃度的生物分子的分析檢測尤為有益。本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于生物診斷、生物技術(shù)、生命科學(xué)、生物醫(yī)藥、食品安全、環(huán)保檢測等領(lǐng)域。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0059]圖1為多聚吖啶酯的整體概念示意圖，其中配體是相互間具有特異性作用配對(如配體-受體)中的一方，包括抗體、抗原、生物素(biotin)、亞氨基生物素(2-1minobiotin)、鏈霉親和素(straptavidin)、抗生物素蛋白(avidin)、地高辛(Digoxin)、Digoxigenin、唾液酸(sialic acid)、葉酸(folic acid)、凝集素(lectin)、伴刀豆凝集素 A(ConcanavalinA, ConA), DNA、RNA、激素、荷爾蒙、類固醇等；化學(xué)發(fā)光標(biāo)記包括吖啶酯、異魯米諾、金剛烷、APS-5 等。
[0060]圖2為圖1特例的抗體-多聚吖啶酯示意圖，圖1中的配體為抗體。
[0061]圖3為多聚吖啶酯標(biāo)記物的通用制備方法。Oo為配體；X為氨基、羧基、巰基、肼基(hydrazine)、醒基、氧氨基(oxyamine)、環(huán)氧乙燒(oxirane)等；Y 或 Z 為 NHS、SMCC、SFB、SANH等，也可等同于X。圖3描述了所述多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑的通用制備方法?；瘜W(xué)發(fā)光標(biāo)記中使用最廣泛者當(dāng)屬吖啶酯及氨基修飾的異魯米諾(ABEI)。N-羥基琥珀酯(NHS)-活化的吖啶酸可參照文獻(xiàn)(Bioorg.Med.Chem.Lett.14 (2004)，2313-7)以化學(xué)合成手段合成出來，也可以從供應(yīng)商采購；ABEI可從供應(yīng)商采購。多聚物骨架可直接采用含活潑基團(tuán)的蛋白質(zhì)(如BSA)或帶有官能團(tuán)的合成高分子，也可修飾天然產(chǎn)物(如葡聚糖)以引入目的官能團(tuán)。核酸片段或基因骨架可通過全自動(dòng)核酸合成法(solid phase oligonucleotidesynthesis，SP0S)引入氨基或其它基團(tuán)，也可通過其它方法(如氧化)在DNA或RNA鏈上直接引入基團(tuán)。至于配體、受體或官能團(tuán)則可據(jù)上述方法為不同分子設(shè)計(jì)不同的制備方法。舉例來說，生物素可通過NHS-活化來制備成生物素-NHS活化酯以便于修飾含氨基的多聚物骨架。一旦上述片段制備完畢就可將其組裝起來。以NHS-活化酯為例，配體-NHS酯、NHS-吖啶酯可很容易與含氨基的多聚物在中性緩沖液中形成穩(wěn)定的酰胺鍵，從而形成配體-多聚物-吖啶酯(圖3)。這里的配體、多聚物、吖啶酯的配比可據(jù)需求進(jìn)行調(diào)整。上述制備方法中所用原料均從供應(yīng)商購買并直接使用。
[0062]圖4為生物素-多聚吖啶酯分析數(shù)據(jù):生物素-G4-多聚吖啶酯在親和素檢測中的應(yīng)用。配體為生物素，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記為吖啶酯，多聚物骨架為G4 (第4代樹狀納米微球)。單一吖啶酯為生物素-吖啶酯，多聚吖啶酯為生物素-G4-多聚吖啶酯。圖4以親和素為代表性范例描述了生物大分子的檢測。此例中的配體為生物素，多聚物骨架為G4樹狀納米微球，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記為吖啶酯，它們組成生物素-G4-多聚吖啶酯。而作為單一吖啶酯的生物素-吖啶酯可用來作對比。從圖4數(shù)據(jù)分析，多聚吖啶酯將單一吖啶酯的發(fā)光量提高數(shù)倍(在其它實(shí)驗(yàn)中，分析數(shù)據(jù)顯示，多聚吖啶酯可將單一吖啶酯的發(fā)光量提高60倍以上)，其線性良好，R2達(dá)0.998，對于提高親和素的檢測靈敏度極有幫助。由于生物素-親和素是生命科學(xué)中應(yīng)用最廣泛的一對配體-受體，這里描述的多聚吖啶酯廣泛地應(yīng)用于生物素或親和素標(biāo)記的生物大分子的檢測中。
[0063]圖5為地高辛-多聚吖啶酯分析數(shù)據(jù):地高辛-BSA-多聚吖啶酯(Dig-BSA-pSAE)在地高辛競爭法檢測的應(yīng)用。配體為地高辛，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記為吖啶酯，多聚物骨架為BSA。圖5以地高辛為代表性范例描述了生物小分子的競爭法檢測。此例中的配體為地高辛，多聚物骨架為BSA，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記為吖啶酯。競爭法是檢測生物小分子常用的方法，地高辛是心臟病檢測中一項(xiàng)重要指標(biāo)。圖5數(shù)據(jù)顯示地高辛-BSA-多聚吖啶酯可通過競爭法來檢測地高辛，其線性良好，R2達(dá)0.996。另外，數(shù)據(jù)進(jìn)一步顯示，地高辛-BSA-多聚吖啶酯的發(fā)光量可達(dá)地高辛-吖啶酯(單一吖啶酯)的56倍(數(shù)據(jù)沒顯示)。
【具體實(shí)施方式】
[0064]以下實(shí)施例將對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0065]本發(fā)明的三個(gè)組成部分包括化學(xué)發(fā)光標(biāo)記(chemiluminescent label)、多聚物骨干(polymeric backbone)及配體(ligand)或官能團(tuán)(functional group)。以下例子以口丫唳酯作為化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，多聚物選自牛血清白蛋白(BSA)、樹狀納米微球(dendrimer)、聚乙烯亞胺(PEI)、葡聚糖(chitosan),配體選自生物素(biotin, Bt)、鏈霉親和素(streptavidin, SAv)、地高辛(digoxin)等。
[0066]⑴所需儀器:[0067]Orion II Microplate Luminometer (Berthold,Germany)、Berthold 的 Sirius LTubeLuminometer,全自動(dòng)酶標(biāo)洗板儀(PW-812,匯松)、紫外可見分光光度計(jì)(TU-1810,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，全自動(dòng)新型電熱培養(yǎng)箱(ZDP-A2080A，上海智城分析儀器制造有限公司)。
[0068](2)所需藥品:
[0069]除非特殊注明，下列藥品是從3丨811^-41(11^(311、4]^3、1'(:1、百靈威、西亞、國藥、北京萬泰、上海源葉、安耐吉等商業(yè)機(jī)構(gòu)購買并直接使用。[0070]生物素、鏈霉親和素、葡聚糖、縮水甘油、2_(對羥基苯偶氮)苯甲酸(HABA)、己二酸二酰肼(ADH)、聚酰胺-胺型樹枝狀高分子(PAMAM)、2，2’ -聯(lián)喹啉_4，4’ - 二羧酸二鈉(BCA)、地高辛、透明質(zhì)酸、雙氧水、Tris鹽酸鹽、Tris堿、硼酸鹽、HEPES、磷酸鹽、碳酸鹽、EDTA、鹽酸、氫氧化鈉、吐溫20 (Tween20)、鹿糖(Sucrose)、酪蛋白鈉鹽、小牛血清(FBS)及牛血清白蛋白(BSA)(上海符達(dá)生物有限公司)；C183D是經(jīng)過重組表達(dá)的乙肝殼蛋白核心抗原、MB-Ab中使用的抗體(Ab)是針對C183D的。
[0071]磺基化吖啶酸(NSP-SA )、磺基化吖啶酸-琥珀酰亞胺酯(NSP-SA-NHS或SAE )、對-甲?；郊姿酦-羥基琥珀酰亞胺酯(SFB)、4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸(SANH)、生物素-吖啶酯(單一吖啶酯)由赫利森生物科技公司自己合成的。
[0072](3)操作方案:
[0073]以下例子僅選取三類配體(生物素、地高辛或鏈霉親和素)、牛血清白蛋白(BSA)或樹狀納米微球(G4)以及葡聚糖為多聚物骨架、吖啶酯為化學(xué)發(fā)光標(biāo)記來說明本發(fā)明的多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑的合成、分析及應(yīng)用。使用其它配體或多聚物骨架的數(shù)據(jù)在此不再贅述。
[0074]第一類:以生物素為配體的多聚吖啶酯(Bt-pSAE)
[0075]I)生物素-BSA-多聚吖啶酯(Bt-BSA-pSAE)
[0076]合成步驟:取5mg的BSA溶液，加入適量的NHS活化的生物素(Bt-NHS)溶液，室溫下反應(yīng)一個(gè)h。再加入適量的NHS活化的吖啶酯(SAE-NHS)溶液，室溫下反應(yīng)30min。反應(yīng)液經(jīng)G25脫鹽柱脫鹽，磷酸鹽緩沖液(pH6.3，IOOmM)洗脫，收集洗脫液(每管0.5mL)，通過BCA蛋白分析法以決定產(chǎn)品收集。
[0077]樣品分析:取以上G25脫鹽收集液產(chǎn)品中的樣品做分析，標(biāo)記為Bt-BSA-pSAE，用水稀釋20倍后進(jìn)行測量。
[0078]a)吖啶酯(SAE)濃度測試:分別取150 μ L上述樣品通過紫外可見吸收光譜(UV-Vis)測試369nm及562nm處吸光值，以吖啶酯在369nm處的摩爾吸光系數(shù)146501^(^1計(jì)算吖啶酯濃度=A369=0.186，吖啶酯濃度=0.254mM。
[0079]b)BSA濃度測試:分別取20μ L上述樣品，加入200 μ L的BCA工作液，在37°C孵化15min后測量562nm處發(fā)光值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算BSA濃度=A562=0.343，BSA濃度=0.033mM。
[0080]c)吖啶酯 /BSA 比例:【吖啶酯】/ [BSA] =0.254mM/0.033mM=7.79。
[0081]d)生物素(Biotin，Bt)測定:2_ (對-羥基苯偶氮)苯甲酸-鏈霉親和素(HABA-SAv)配合物在500nm具有特殊吸收，其吸光系數(shù)為35500^^?'當(dāng)生物素加入到此溶液中由于生物素-鏈霉親和素之間的親和系數(shù)(約1.3X IO15M4)遠(yuǎn)大于HABA-鏈霉親和素(約6X IO6IT1),生物素將取代HABA與鏈霉親和素結(jié)合從而將其釋放到溶液中導(dǎo)致500nm處的吸收峰降低。此特性被廣泛用于生物素的定量分析。[0082]溶液配制:磷酸鹽緩沖液:0.05M磷酸鹽，0.15M NaCl，pH6 ;2_(對-羥基苯偶氮)苯甲酸(HABA)溶液:在IOmM的NaOH溶液中配制2.42mg/mL的HABA溶液。鏈霉親和素(Streptavidin, SAv) (lmg/mL):在PBS溶液中配制2.2mg/mL的鏈霉親和素溶液。工作液:ImL的上述鏈霉親和素溶液與25 μ L上述HABA溶液混合后制成工作液。
[0083]樣品分析:取10 μ L的Bt-BSA-pSAE樣品加入90 μ L工作液，測試500nm處吸光值=HABA-SAv在500nm處的吸光值為0.307，Bt-BSA-pSAE樣品在500nm處的吸光值為
0.279，差值為0.028，換算成測試液濃度為7.9X104mM，而稀釋前樣品濃度為0.079mM。因此，此樣品的每條BSA鏈上平均含有約7.8個(gè)吖啶酯標(biāo)記、2.4個(gè)生物素標(biāo)記。
[0084]2)生物素-G4-多聚吖啶酯(Bt-G4_pSAE)
[0085]a)生物素-吖啶酯(Bt-SAE)的合成:取IOmg NHS-活化的吖啶酯溶入無水DMF，溶解后加入適量生物素酰肼，室溫反應(yīng)18h，濃縮除去DMF后通過制備型薄層板分離得生物素-吖啶酯產(chǎn)品。b)生物素-G4-多聚吖啶酯(Bt-G4-pSAE)的合成:稱取5mg PAMAM(G4)樹狀納米微球，溶于ImL的0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，加入適量的NHS-活化生物素(Bt-NHS) DMF溶液，室溫反應(yīng)Ih后，加入適量的NHS-活化的吖啶酯(SAE-NHS)的DMF-磷酸鹽溶液，室溫下避光反應(yīng)2h，加入適當(dāng)試劑處理后，取清液濃縮得17.2mg產(chǎn)品。
[0086]3)化學(xué)發(fā)光測試:
[0087]溶液配制:a)生物素-吖啶酯(Bt-SAE):稱取3.3mg的上述生物素-吖啶酯溶于2mL的DMF制成生物素標(biāo)記的單一吖啶酯。b)生物素-G4-多聚吖啶酯(Bt_G4-pSAE):稱取17.2mg的上述生物素-G4-多聚吖啶酯溶于2mL的水中制成樹狀物微球?yàn)楣羌艿亩嗑圻灌ト芤骸?br> [0088]化學(xué)發(fā)光測試:通過EDC (l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimidehydrochloride)稱合,鏈霉親和素(SAv)被修飾到含羧基的磁珠表面。將不同濃度的生物素-吖啶酯或生物素-多聚吖啶酯分別溶解在PH7.4的磷酸鹽緩沖液中，反應(yīng)十min，然后用磷酸鹽緩沖液洗滌4次，樣品加入到特殊發(fā)光試管后置入Berthold的Sirius L管式發(fā)光檢測儀(Tube Luminometer),自動(dòng)加入發(fā)光引發(fā)劑后測量發(fā)光量,單一與多聚吖唳酯化學(xué)發(fā)光測試對比參見表1，表1的數(shù)據(jù)被用來制作圖4。
[0089]表1
[0090]
【權(quán)利要求】
1.多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑，其特征在于其原料組成如下: a)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物； b)多聚物骨架； c)配體、受體或官能團(tuán)。
2.如權(quán)利要求1所述多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑，其特征在于所述化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物為任何通過吸收化學(xué)能而發(fā)光的標(biāo)記物，選自: a)吖啶酮系列，所述吖啶酮系列選自吖啶酯及其衍生物，包括磺基化的吖啶酯，APS-5(9-(4-chlorophenylthiophosphoryl-oxymethylidene)-10-methylacridan)及其衍生物； b)酰肼系列，所述酰肼系列選自魯米諾、異魯米諾、魯米諾相關(guān)的酰肼或環(huán)酰肼； c)苯多酚系列，所述苯多酚系列選自鄰苯三酚、間苯三酚或間苯二酚； d)金剛烷系列，所述金剛烷系列選自3-(2-螺旋金剛烷-4-甲氧基-4-甲基-4-(3-磷酸氧基)-苯基_1，2- 二氧乙燒； e)其它系列，所述其它系列選自過氧草酸酯、光澤精或洛粉堿； f )能量轉(zhuǎn)移類發(fā)光標(biāo)記物，所述能量轉(zhuǎn)移類發(fā)光標(biāo)記物選自能量轉(zhuǎn)移類的魯米諾衍生物，所述能量轉(zhuǎn)移類的魯米 諾衍生物選自魯米諾-吖啶酮共軛體；或魯米諾-熒光素共軛體；或魯米諾-羅丹明共軛體；其中，吖啶酮、熒光素、羅丹明是能量受體，其它能量受體可同樣被采用。
3.如權(quán)利要求1所述多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑，其特征在于所述多聚物骨架選自: 1)含有多個(gè)供化學(xué)發(fā)光標(biāo)記修飾的官能團(tuán)的人造多聚物或天然多聚物，選自葡聚糖、瓊脂糖、纖維素、聚乙烯亞胺、聚丙烯酸及其衍生物、樹狀納米微球、聚賴氨酸、牛血清白蛋白、人血清白蛋白或其它蛋白質(zhì)或多肽； 2)特殊化學(xué)修飾的核酸，所述特殊化學(xué)修飾的核酸，在核苷酸糖環(huán)、磷酸基或堿基上通過化學(xué)修飾引入吖啶酯或異魯米諾，優(yōu)選樹狀DNA。
4.如權(quán)利要求1所述多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑，其特征在于所述配體是相互間具有特異性作用配對中的一方，所述配體為抗原-抗體、配體-受體、DNA堿基配對或RNA堿基配對、底物-酶、配體-蛋白；所述配體可選自生物配體包括生物素、亞氨基生物素、唾液酸、葉酸、凝集素、伴刀豆凝集素A、鈣調(diào)素、肝素、抗原、精氨酸、賴氨酸、谷胱甘肽、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、地高辛、透明質(zhì)酸、苯硼酸、明膠、磷酸腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、苯甲脒、汽巴隆藍(lán)、普施安紅、DNA片段、RNA片段、荷爾蒙多肽、激素、熒光素中的一種。
5.如權(quán)利要求1所述多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑，其特征在于所述受體是相互間具有特異性作用配對中的另一方，所述受體選自鏈霉親和素、抗生物素蛋白、NutraAvidin、抗體、G蛋白偶聯(lián)受體及其它細(xì)胞表面受體、生物酶中的一種；所述抗體可選自熒光素-抗熒光素抗體或地高辛-抗地高辛抗體。
6.如權(quán)利要求1所述多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑，其特征在于所述官能團(tuán)是可用來修飾抗體或DNA或其它生物分子的化學(xué)基團(tuán)，所述官能團(tuán)選自醛基、氨基、羧基、巰基、炔基、疊氮、氧氨、肼、α -鹵代羧基、異氰酸酯、異硫氰酸酯、N-羥基琥珀酯、環(huán)氧化物、環(huán)氧乙烷、氮丙啶、馬來酰亞胺、乙烯砜、硅醇基、螯合劑中的一種。
7.如權(quán)利要求1所述多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑，其特征在于所述官能團(tuán)選自生物共軛反應(yīng)配對中的一個(gè): a)甲酰基苯甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯或2，5-二氧吡咯烷-1-基-6-(2-(丙-2-亞基)餅基)煙酸；
b)SMCC (4- (Maleimidomethyl) cyclohexanecarboxylic acid)或疏基； c)點(diǎn)擊化學(xué)配對； d)原生化學(xué)鏈接(NativeChemical Ligation)配對； e)狄爾斯-阿爾德反應(yīng)(Diels-AlderReaction)配對。
8.如權(quán)利要求1所述多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟: O多聚物骨架修飾 根據(jù)多聚物不同的結(jié)構(gòu)以及配體-多聚物共軛體不同的合成方法需要設(shè)計(jì)不同的多聚物骨架修飾方法； 若生物共軛化學(xué)是以SFB及SANH為基礎(chǔ)的，則需要在多聚物上修飾SFB或SANH，以便與SANH或SFB修飾的配體進(jìn)行配對反應(yīng)從而制備配體-多聚物共軛物； 若其它生物共軛反應(yīng)配對，包括SMCC-巰基、點(diǎn)擊化學(xué)配對、原生化學(xué)鏈接、狄爾斯-阿爾德反應(yīng)亦可 應(yīng)用于此； 若生物素引入到多聚物上，其方法包括NHS-活化的生物素與含氨基的多聚物形成酰胺鍵； 若酶鏈親和素，通過EDC耦合反應(yīng)引入到多聚物上； 還原性席夫堿形成、α -鹵素取代、芳香疊氮光化學(xué)； 2)配體或受體修飾 根據(jù)配體的結(jié)構(gòu)以及多聚物骨架上所含的官能團(tuán)的不同需要設(shè)計(jì)不同的修飾方法，尤其需要據(jù)生物共軛反應(yīng)配對來設(shè)計(jì)與多聚物互補(bǔ)的修飾化學(xué)，以上所述多聚物修飾化學(xué)也適用于配體的修飾，包括配體的NHS活化、生物共軛配對修飾、點(diǎn)擊化學(xué)、原生化學(xué)鏈接、狄爾斯-阿爾德反應(yīng)、席夫堿形成等，類似生物共軛化學(xué)技術(shù)可同樣應(yīng)用到受體的修飾上； 3)配體-多聚物共軛體或受體-多聚物共軛體的合成 當(dāng)多聚物、配體在被適當(dāng)?shù)幕鶊F(tuán)修飾后，生物共軛反應(yīng)可合成相應(yīng)的配體-多聚物共軛體； 若配體是NHS-活化的，而多聚物含有氨基，則通過酰胺鍵的形成合成配體-多聚物共軛體； 若配體是SFB修飾的，而多聚物是SANH，則通過SFB-SANH間獨(dú)特的席夫堿形成可合成配體-多聚物共軛體； 除配體及受體之外，一些特殊的官能團(tuán)可直接用來標(biāo)記目標(biāo)分子，所述特殊的官能團(tuán)包括醛基、氨基、羧基、巰基、炔基、疊氮、氧氨、肼、α -鹵代羧基、異氰酸酯、異硫氰酸酯、N-羥基琥珀酯、環(huán)氧化物、環(huán)氧乙烷、氮丙啶、馬來酰亞胺、乙烯砜或硅醇基，這些基團(tuán)與目標(biāo)分子中的相應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)而形成共軛鍵來標(biāo)記； 4)多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑的合成 對步驟3)的共軛體引入化學(xué)發(fā)光標(biāo)記基團(tuán)，利用NHS-活化的吖啶酯對含氨基共軛體的修飾，若氨基修飾的ABEI，則可通過EDC耦合反應(yīng)或還原性席夫堿的形成而引入；若吖啶酯或ABEI被其它官能團(tuán)所修飾，則其它方法包括點(diǎn)擊化學(xué)、SMCC-巰基化學(xué)等亦可用來引入化學(xué)發(fā)光基團(tuán)。
9.如權(quán)利要求1所述多聚化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑在醫(yī)療診斷、生物技術(shù)、生物醫(yī)藥、生命科學(xué)、食品安全、環(huán)保檢測中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述應(yīng)用，其特征在于所述診斷為免疫分析診斷，所述生物技術(shù)為配體-受體之間相互作用分析，核酸、基因分析與檢測。
【文檔編號】G01N21/76GK103792346SQ201410050951
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月14日
【發(fā)明者】劉澗泉, 黃炳河 申請人:赫利森（廈門）生物科技有限公司