一種用于dna堿基同時檢測的電化學傳感器的制造方法
【專利摘要】一種用于DNA堿基同時檢測的電化學傳感器，它涉及DNA的電化學檢測。本發(fā)明是要解決現(xiàn)有電化學傳感器難以實現(xiàn)對四種DNA堿基的同時靈敏分析和穩(wěn)定檢測，現(xiàn)有方法存在的易受樣品污染，儀器復雜昂貴，操作繁瑣問題，以及電位窗較窄，對嘧啶堿基響應電流較低，穩(wěn)定性較差問題。本發(fā)明步驟如下：一、制備氧化石墨烯及溴甲酚紫溶液；二、制備石墨烯修飾電極；三、制備溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極；四：使用復合修飾電極檢測四種堿基混合液的電化學信號，分析并確定其電化學信號所在的峰位；步驟五：對堿基混合液進行電化學檢測，得到其隨濃度變化的差分脈沖伏安圖；建立四種DNA堿基電化學信號變化規(guī)律圖。本發(fā)明適用于電化學傳感器領域。
【專利說明】—種用于DNA堿基同時檢測的電化學傳感器
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及脫氧核糖核酸(DNA)的電化學檢測，尤其是四種DNA堿基的電化學檢測。
【背景技術】
[0002]脫氧核糖核酸(DNA)是染色體的主要化學成分，其基本構成是脫氧核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸又由磷酸、D-2脫氧核糖和堿基構成。其中堿基包括腺嘌呤(Adenine)、鳥嘌呤(Guanine)、胸腺喃唳(Thymine)和胞喃唳(Cytosine)。DNA作為傳遞遺傳信息的載體，與生命的正?；顒尤绶敝?、遺傳、細胞分化等緊密相關。同時，DNA的氧化損傷和變異與生命的異?；顒尤缒[瘤、遺傳病和代謝病等有密切聯(lián)系。DNA的氧化性損傷通常發(fā)生在堿基上，通過檢測體液中堿基的變化可以預測DNA的損傷程度，指示某些疾病的發(fā)生，同時對于研究DNA的代謝過程及其損傷機理具有重要意義。
[0003]早期用于DNA分析測定的方法有經(jīng)典的定磷法、定糖法及流式細胞技術等。近些年發(fā)展起來的分析檢測方法有分光光度法、熒光光譜法、化學發(fā)光法、共振光散射法和毛細管電泳法等。然而，以上這些方法容易受到樣品混濁、溶血、黃疸的干擾，而且大多數(shù)儀器復雜昂貴，操作繁瑣。將電化學傳感器用于對DNA，尤其是兩種嘌呤堿基的分析是近年來的一個新的研究方向。然而，由于嘧啶堿基的氧化電位較高，電化學響應較弱，現(xiàn)有的電化學傳感器難以實現(xiàn)對四種DNA堿基的同時靈敏分析和穩(wěn)定檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有電化學傳感器難以實現(xiàn)對四種DNA堿基的同時靈敏分析和穩(wěn)定檢測，現(xiàn)有方法存在的易受樣品混濁、溶血、黃疸干擾，儀器復雜昂貴，操作繁瑣等問題，以及現(xiàn)有電化學傳感器電位窗較窄，對嘧啶堿基響應電流較低，穩(wěn)定性較差等問題，而提供的一種用于DNA堿基同時檢測的電化學傳感器。
[0005]本發(fā)明提供的用于DNA堿基同時檢測的電化學傳感器，是按以下步驟進行:
[0006]步驟一:將利用Hrnnmer方法制備的氧化石墨烯粉末,于雙蒸水中超聲分散10?15min,得到濃度為0.2?0.5mg/mL的氧化石墨烯懸濁液；將溴甲酚紫于濃度為0.0lM的NaNO3溶液中分散，得到濃度為1.0X 10_3?2.0X 10_3M的溴甲酚紫溶液；
[0007]步驟二:取5?10 μ L步驟一得到的氧化石墨烯懸濁液，滴涂到玻碳電極表面，置于紅外燈下干燥，干燥后冷卻至室溫，得到氧化石墨烯修飾的玻碳電極；將氧化石墨烯修飾的玻碳電極置于ρΗ=5?7的PBS溶液中進行恒電位還原，還原電位為-1.0?-1.5V,還原時間為360?720s，即得石墨烯修飾電極，室溫晾干待用；
[0008]步驟三:將步驟二中制得的石墨烯修飾電極置于步驟一得到的溴甲酚紫溶液中進行循環(huán)伏安掃描，其中，電位為-1.0?+1.5V，掃描速率為50?lOOmVs—1，循環(huán)次數(shù)為10?15圈，即得溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極；
[0009]步驟四:用步驟三制備的溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極檢測四種堿基混合溶液的電化學信號，確定四種堿基電化學信號所在的峰位；其中，所述的溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極檢測的工作條件如下:溫度為22?25°C、脈沖高度為0.0l?0.1V，脈沖寬度為0.01?0.1s,電位增量為0.005?0.015V ;所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.20?200.0 μ M的鳥嘌呤、濃度為0.20?220.0 μ M的腺嘌呤、濃度為2.0?700.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為2.50?650.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.0?7.4、濃度為0.1?0.2Μ的PBS緩沖液制成；
[0010]步驟五:對待測的四種堿基混合液采用進行步驟三制備的溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極進行電化學檢測，得到鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶隨濃度變化的差分脈沖伏安圖；然后分別以堿基濃度為橫坐標，以電化學檢測的電流信號為縱坐標，建立四種DNA堿基電化學信號變化規(guī)律圖；其中，所述的溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極檢測的工作條件如下:溫度為22?25°C、脈沖高度為0.01?0.1V，脈沖寬度為0.01?0.1s,電位增量為0.005?0.015V ;所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.20?200.0yM的鳥嘌呤、濃度為0.20?220.0 μ M的腺嘌呤、濃度為2.0?700.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為2.50?650.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.0?7.4、濃度為0.1?0.2Μ的PBS緩沖液制成。
[0011]本發(fā)明包含以下有益效果:
[0012]本發(fā)明提出的電化學傳感器，是一種用于四種DNA堿基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶)同時檢測的簡單、快速、無標記的新型電化學傳感器。
[0013]本發(fā)明的電化學傳感器，以DNA堿基含量為檢測指標，可同時觀察到鳥嘌呤(0.66V左右)、腺嘌呤(0.92V左右)、胸腺嘧啶(1.12V左右)及胞嘧啶(1.29V左右)四個電化學信號的變化，實現(xiàn)對四種DNA堿基的定量檢測。該電化學傳感器對腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶的線性檢測范圍分別為0.20-220.0 μ Μ, 0.20-200.0 μ Μ, 2.0-700.0 μ Μ,
2.50-650.0 μ Μ,最低檢出限分別可達 0.05 μ Μ，0.06 μ Μ，0.3 μ M 及 0.9 μ Μ。
[0014]本發(fā)明提出的一種DNA堿基同時檢測的電化學傳感器通過檢測電化學信號來指示DNA堿基的變化情況，是一種簡單、快速、靈敏、快速的新型傳感器，而且不需要添加任何熒光或放射性標記物，樣品不易受污染，操作非常安全。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為不同修飾電極檢測含50.0M鳥嘌呤、50.0 μ M腺嘌呤、200.0 μ M胸腺嘧啶和200.0 μ M胞嘧啶的ρΗ=7.4的PBS溶液的差分脈沖伏安圖，其中，a為玻碳電極電極伏安曲線，b為溴甲酚紫/玻碳電極伏安曲線，c為石墨烯/玻碳電極伏安曲線，d為溴甲酚紫/石墨烯/玻碳電極伏安曲線；
[0016]圖2為鳥嘌呤隨濃度變化的差分脈沖伏安圖；
[0017]圖3為鳥嘌呤的濃度-電化學信號變化規(guī)律圖；
[0018]圖4為腺嘌呤隨濃度變化的差分脈沖伏安圖；
[0019]圖5為腺嘌呤的濃度-電化學信號變化規(guī)律圖；
[0020]圖6為胸腺嘧啶隨濃度變化的差分脈沖伏安圖；
[0021]圖7為胸腺嘧啶的濃度-電化學信號變化規(guī)律圖；
[0022]圖8為胞嘧啶隨濃度變化的差分脈沖伏安圖；
[0023]圖9為胞嘧啶的濃度-電化學信號變化規(guī)律圖；[0024]圖10為鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶同時隨濃度變化的差分脈沖伏安圖?！揪唧w實施方式】
[0025]【具體實施方式】一:本實施方式的一種用于DNA堿基同時檢測的電化學傳感器,其特征在于它是按以下步驟進行:
[0026]步驟一:將利用Hrnnmer方法制備的氧化石墨烯粉末,于雙蒸水中超聲分散10?15min,得到濃度為0.2?0.5mg/mL的氧化石墨烯懸濁液；將溴甲酚紫于濃度為0.0lM的NaNO3溶液中分散，得到濃度為1.0X 10_3?2.0X 10_3M的溴甲酚紫溶液；
[0027]步驟二:取5?10 μ L步驟一得到的氧化石墨烯懸濁液，滴涂到玻碳電極表面，置于紅外燈下干燥，干燥后冷卻至室溫，得到氧化石墨烯修飾的玻碳電極；將氧化石墨烯修飾的玻碳電極置于ρΗ=5?7的PBS溶液中進行恒電位還原，還原電位為-1.0?-1.5V,還原時間為360?720s，即得石墨烯修飾電極，室溫晾干待用；
[0028]步驟三:將步驟二中制得的石墨烯修飾電極置于步驟一得到的溴甲酚紫溶液中進行循環(huán)伏安掃描，其中，電位為-1.0?+1.5V，掃描速率為50?lOOmVs—1，循環(huán)次數(shù)為10?15圈，即得溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極；
[0029]步驟四:用步驟三制備的溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極檢測四種堿基混合溶液的電化學信號，確定四種堿基電化學信號所在的峰位；其中，所述的溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極檢測的工作條件如下:溫度為22?25°C、脈沖高度為0.01?0.1V，脈沖寬度為0.01?0.1s,電位增量為0.005?0.015V ;所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.20?200.0 μ M的鳥嘌呤、濃度為0.20?220.0 μ M的腺嘌呤、濃度為2.0?700.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為2.50?650.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.0?7.4、濃度為0.1?0.2Μ的PBS緩沖液制成；
[0030]步驟五:對待測的四種堿基混合液采用進行步驟三制備的溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極進行電化學檢測，得到鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶隨濃度變化的差分脈沖伏安圖；然后分別以堿基濃度為橫坐標，以電化學檢測的電流信號為縱坐標，建立四種DNA堿基電化學信號變化規(guī)律圖；其中，所述的溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極檢測的工作條件如下:溫度為22?25°C、脈沖高度為0.01?0.1V，脈沖寬度為0.01?0.1s,電位增量為0.005?0.015V ;所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.20?200.0yM的鳥嘌呤、濃度為0.20?220.0 μ M的腺嘌呤、濃度為2.0?700.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為2.50?650.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.0?7.4、濃度為0.1?0.2Μ的PBS緩沖液制成。
[0031]本實施方式提出的電化學傳感器，以DNA堿基含量為檢測指標，可同時觀察到鳥嘌呤(0.66V左右)、腺嘌呤(0.92V左右)、胸腺嘧啶(1.12V左右)及胞嘧啶(1.29V左右)四個電化學信號的變化，實現(xiàn)對四種DNA堿基的定量檢測。該電化學傳感器對腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶的線性檢測范圍分別為0.20-220.0 μ Μ, 0.20-200.0 μ Μ, 2.0-700.0 μ Μ,
2.50-650.0 μ Μ,最低檢出限分別可達 0.05 μ Μ，0.06 μ Μ，0.3 μ M 及 0.9 μ Μ。
[0032]本實施方式提出的一種DNA堿基同時檢測的電化學傳感器通過檢測電化學信號來指示DNA堿基的變化情況，是一種簡單、快速、靈敏、快速的新型傳感器，而且不需要添加任何熒光或放射性標記物，樣品不易受污染，操作非常安全。
[0033]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟一中所述的于雙蒸水中超聲分散為12~15min。其它與【具體實施方式】一相同。
[0034]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一或二不同的是:步驟一中所述的于雙蒸水中超聲分散為15min。其它與【具體實施方式】一或二相同。
[0035]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】一至三之一不同的是:步驟一中所述的氧化石墨烯懸池液濃度為0.3~0.5mg/mL。其它與【具體實施方式】一至三之一相同。
[0036]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】一至四之一不同的是:步驟一中所述的氧化石墨烯懸池液濃度為0.5mg/mL。其它與【具體實施方式】一至四之一相同。
[0037]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】一至五之一不同的是:步驟一中所述的溴甲酚紫溶液濃度為1.5X10_3~2.0X10_3M。其它與【具體實施方式】一至五之一相同。
[0038]【具體實施方式】七:本實施方式與【具體實施方式】一至六之一不同的是:步驟一中所述的溴甲酚紫溶液濃度為2.0X 10_3M。其它與【具體實施方式】一至六之一相同。
[0039]【具體實施方式】八:本實施方式與【具體實施方式】一至七之一不同的是:步驟二中所述的取5~8 μ L步驟一得到的氧化石墨烯懸濁液，滴涂到玻碳電極表面。其它與【具體實施方式】一至七之一相同。
[0040]【具體實施方式】九:本實施方式與【具體實施方式】一至八之一不同的是:步驟二中所述的取5 μ L步驟一得到的氧化石墨烯懸濁液，滴涂到玻碳電極表面。其它與【具體實施方式】一至八之一相同。
[0041]【具體實施方式】十:本實施方式與【具體實施方式】一至九之一不同的是:步驟二中所述的的PBS的ρΗ=5~6。其它與【具體實施方式】一至九之一相同。
[0042]【具體實施方式】十一: 本實施方式與【具體實施方式】一至十之一不同的是:步驟二中所述的的PBS的pH=5。其它與【具體實施方式】一至十之一相同。
[0043]【具體實施方式】十二:本實施方式與【具體實施方式】一至十一之一不同的是:步驟二中所述的還原電位為-1.3~-1.5V。其它與【具體實施方式】一至^ 之一相同。
[0044]【具體實施方式】十三:本實施方式與【具體實施方式】一至十二之一不同的是:步驟二中所述的還原電位為-1.5V。其它與【具體實施方式】一至十二之一相同。
[0045]【具體實施方式】十四:本實施方式與【具體實施方式】一至十三之一不同的是:步驟二中所述的還原時間為400~720s。其它與【具體實施方式】一至十三之一相同。
[0046]【具體實施方式】十五:本實施方式與【具體實施方式】一至十四之一不同的是:步驟二中所述的還原時間為500~720s。其它與【具體實施方式】一至十四之一相同。
[0047]【具體實施方式】十六:本實施方式與【具體實施方式】一至十五之一不同的是:步驟二中所述的還原時間為600~720s。其它與【具體實施方式】一至十五之一相同。
[0048]【具體實施方式】十七:本實施方式與【具體實施方式】一至十六之一不同的是:步驟二中所述的還原時間為720s。其它與【具體實施方式】一至十六之一相同。
[0049]【具體實施方式】十八:本實施方式與【具體實施方式】一至十七之一不同的是:步驟三中所述的聚合溴甲酚紫掃描速率為60~IOOmVs'其它與【具體實施方式】一至十七之一相同。
[0050]【具體實施方式】十九:本實施方式與【具體實施方式】一至十七之一不同的是:步驟三中所述的聚合溴甲酚紫掃描速率為70~IOOmVs'其它與【具體實施方式】一至十七之一相同。[0051]【具體實施方式】二十:本實施方式與【具體實施方式】一至十九之一不同的是:步驟三中所述的聚合溴甲酚紫掃描速率為80~IOOmVs'其它與【具體實施方式】一至十九之一相同。
[0052]【具體實施方式】二十一:本實施方式與【具體實施方式】一至二十之一不同的是:步驟三中所述的聚合溴甲酚紫掃描速率為90~IOOmVs'其它與【具體實施方式】一至二十之一相同。
[0053]【具體實施方式】二十二:本實施方式與【具體實施方式】一至二十一之一不同的是:步驟三中所述的聚合溴甲酚紫掃描速率為IOOmVs'其它與【具體實施方式】一至二十一之一相同。
[0054]【具體實施方式】二十三:本實施方式與【具體實施方式】一至二十二之一不同的是:步驟三中所述的聚合溴甲酚紫循環(huán)次數(shù)為12~15圈。其它與【具體實施方式】一至二十二之一相同。
[0055]【具體實施方式】二十四:本實施方式與【具體實施方式】一至二十三之一不同的是:步驟三中所述的聚合溴甲酚紫循環(huán)次數(shù)為15圈。其它與【具體實施方式】一至二十三之一相同。
[0056]【具體實施方式】二十五:本實施方式與【具體實施方式】一至二十四之一不同的是:步驟四中所述的溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極工作條件如下:溫度為25°C、脈沖高度為
0.05V，脈沖寬度為0.05s,電位增量為0.01V0其它與【具體實施方式】一至二十四之一相同。
[0057]【具體實施方式】二十六:本實施方式與【具體實施方式】一至二十五之一不同的是:步驟四中所述的用作堿基溶劑 的PBS緩沖液pH=7.1~7.4。其它與【具體實施方式】一至二十五之一相同。
[0058]【具體實施方式】二十七:本實施方式與【具體實施方式】一至二十六之一不同的是:步驟四中所述的用作堿基溶劑的PBS緩沖液pH=7.2~7.4。其它與【具體實施方式】一至二十六之一相同。
[0059]【具體實施方式】二十八:本實施方式與【具體實施方式】一至二十七之一不同的是:步驟四中所述的用作堿基溶劑的PBS緩沖液pH=7.3~7.4。其它與【具體實施方式】一至二十七之一相同。
[0060]【具體實施方式】二十九:本實施方式與【具體實施方式】一至二十八之一不同的是:步驟四中所述的用作堿基溶劑的PBS緩沖液pH=7.4。其它與【具體實施方式】一至二十八之一相同。
[0061]【具體實施方式】三十:本實施方式與【具體實施方式】一至二十九之一不同的是:步驟四中所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.20~100.0y M的鳥嘌呤、濃度為0.20~100.0 μ M的腺嘌呤、濃度為2.0~500.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為2.50~400.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.0~7.4、濃度為0.1~0.2Μ的PBS緩沖液混合制成。其它與【具體實施方式】一至二十九之一相同。
[0062]【具體實施方式】三十一:本實施方式與【具體實施方式】一至三十之一不同的是:步驟四中所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.20~50.0 μ M的鳥嘌呤、濃度為0.20~50.0 μ M的腺嘌呤、濃度為2.0~300.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為2.50~200.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.0~7.4、濃度為0.1~0.2Μ的PBS緩沖液混合制成。其它與【具體實施方式】一至三十之一相同。[0063]【具體實施方式】三十二:本實施方式與【具體實施方式】一至三十一之一不同的是:步驟四中所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.20~20.0y M的鳥嘌呤、濃度為0.20~20.0 μ M的腺嘌呤、濃度為2.0~100.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為2.50~100.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.0~7.4、濃度為0.1~0.2Μ的PBS緩沖液混合制成。其它與【具體實施方式】一至
之一相同。
[0064]【具體實施方式】三十三:本實施方式與【具體實施方式】一至三十二之一不同的是:步驟四中所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.20~5.0μ M的鳥嘌呤、濃度為0.20~
5.0 μ M的腺嘌呤、濃度為2.0~50.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為2.50~50.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.0~7.4、濃度為0.1~0.2Μ的PBS緩沖液混合制成。其它與【具體實施方式】一至三十二之一相同。
[0065]【具體實施方式】三十四:本實施方式與【具體實施方式】一至三十三之一不同的是:步驟四中所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.20~2.0μ M的鳥嘌呤、濃度為0.20~
2.0 μ M的腺嘌呤、濃度為2.0~10.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為2.50~10.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.0~7.4、濃度為0.1~0.2Μ的PBS緩沖液混合制成。其它與【具體實施方式】一至三十三之一相同。
[0066]【具體實施方式】三十五:本實施方式與【具體實施方式】一至三十四之一不同的是:步驟四中所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.20~1.0 μ M的鳥嘌呤、濃度為0.20~1.0 μ M的腺嘌呤、濃度為2.0~5.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為2.50~5.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.0~7.4、濃度為0.1~0.2Μ的PBS 緩沖液混合制成。其它與【具體實施方式】一至三十四之一相同。
[0067]【具體實施方式】三十六:本實施方式與【具體實施方式】一至三十五之一不同的是:步驟四中所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.20~0.8 μ M的鳥嘌呤、濃度為0.20~0.8 μ M的腺嘌呤、濃度為2.0~3.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為2.50~3.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.0~7.4、濃度為0.1~0.2Μ的PBS緩沖液混合制成。其它與【具體實施方式】一至三十五之一相同。
[0068]【具體實施方式】三十七:本實施方式與【具體實施方式】一至三十六之一不同的是:步驟四中所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.20~0.5 μ M的鳥嘌呤、濃度為0.20~0.5 μ M的腺嘌呤、濃度為2.0~2.5 μ M的胸腺嘧啶、濃度為2.50~2.8 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.0~7.4、濃度為0.1~0.2Μ的PBS緩沖液混合制成。其它與【具體實施方式】一至三十六之一相同。
[0069]【具體實施方式】三十八:本實施方式與【具體實施方式】一至三十七之一不同的是:步驟五中所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.06~100.0y M的鳥嘌呤、濃度為0.05~100.0 μ M的腺嘌呤、濃度為0.3~500.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為0.9~400.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.0~7.4、濃度為0.1~0.2Μ的PBS緩沖液混合制成。其它與【具體實施方式】一至三十七之一相同。
[0070]【具體實施方式】三十九:本實施方式與【具體實施方式】一至三十八之一不同的是:步驟五中所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.06~50.0y M的鳥嘌呤、濃度為0.05~50.0 μ M的腺嘌呤、濃度為0.3~200.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為0.9~200.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.0~7.4、濃度為0.1~0.2Μ的PBS緩沖液混合制成。其它與【具體實施方式】一至三十八之一相同。
[0071]【具體實施方式】四十:本實施方式與【具體實施方式】一至三十九之一不同的是:步驟五中所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.06~20.0yM的鳥嘌呤、濃度為0.05~20.0 μ M的腺嘌呤、濃度為0.3~100.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為0.9~100.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.0~7.4、濃度為0.1~0.2Μ的PBS緩沖液混合制成。其它與【具體實施方式】一至三十九之一相同。
[0072]【具體實施方式】四十一:本實施方式與【具體實施方式】一至四十之一不同的是:步驟五中所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.06~10.0 μ M的鳥嘌呤、濃度為0.05~10.0 μ M的腺嘌呤、濃度為0.3~50.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為0.9~50.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.0~7.4、濃度為0.1~0.2Μ的PBS緩沖液混合制成。其它與【具體實施方式】一至四十之一相同。
[0073]【具體實施方式】四十二:本實施方式與【具體實施方式】一至四十一之一不同的是:步驟五中所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.06~5.0 μ M的鳥嘌呤、濃度為0.05~5.0 μ M的腺嘌呤、濃度為0.3~10.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為0.9~10.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.0~7.4、濃度為0.1~0.2Μ的PBS緩沖液混合制成。其它與【具體實施方式】一至四十一之一相同。
[0074]【具體實施方式】四十三:本實施方式與【具體實施方式】一至四十二之一不同的是:步驟五中所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.06~1.0 μ M的鳥嘌呤、濃度為0.05~1.0 μ M的腺嘌呤、濃度為0.3~5.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為0.9~5.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.0~7.4、濃度為0.1~0.2Μ的PBS緩沖液混合制成。其它與【具體實施方式】一至四十二之一相同。
[0075]【具體實施方式】四十四:本實施方式與【具體實施方式】一至四十三之一不同的是:步驟五中所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.06~0.5 μ M的鳥嘌呤、濃度為0.05~0.5 μ M的腺嘌呤、濃度為0.3~2.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為0.9~2.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.0~7.4、濃度為0.1~0.2Μ的PBS緩沖液混合制成。其它與【具體實施方式】一至四十三之一相同。
[0076]【具體實施方式】四十五:本實施方式與【具體實施方式】一至四十四之一不同的是:步驟五中所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.06~0.1 μ M的鳥嘌呤、濃度為0.05~0.1 μ M的腺嘌呤、濃度為0.3~1.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為0.9~1.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.0~
7.4、濃度為0.1~0.2Μ的PBS緩沖液混合制成。其它與【具體實施方式】一至四十四之一相同。
[0077]通過以下實施例驗證本發(fā)明的有益效果:
[0078]實施例1
[0079]本實施例的一種用于DNA堿基同時檢測的電化學傳感器，按以下步驟進行:
[0080]步驟一:將利用Hummer方法得到的氧化石墨烯粉末，于雙蒸水中超聲分散15min，得0.5mg/mL的氧化石墨烯水懸濁液；將溴甲酚紫于0.01MNaNO3溶液中分散，得到1.0X 10_3~2.0X IO-3M的溴甲酚紫混合溶液；
[0081]其中，所用溴甲酚紫屬于分析純；
[0082]步驟二:用微量移液器吸取5 μ L氧化石墨烯懸濁液，滴涂到氧化石墨烯表面，置于紅外燈下干燥，干燥后冷卻至室溫，得到氧化石墨烯修飾的玻碳電極；將氧化石墨烯修飾的玻碳電極置于pH=5的PBS溶液中進行恒電位還原,還原電位為-1.5V,還原時間為720s,即得石墨烯修飾電極，室溫晾干；
[0083]其中，紅外燈照射時間根據(jù)玻碳電極表面石墨烯薄膜完全干燥確定；
[0084]步驟三:將步驟二中制得的石墨烯修飾電極置于溴甲酚紫溶液中進行循環(huán)伏安掃描，電位-1.0?+ 1.5V，掃描速率lOOmVs—1，循環(huán)次數(shù)15圈，即得溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極；
[0085]步驟四:用步驟三制備的溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極檢測四種堿基混合溶液的電化學信號，確定四種堿基電化學信號所在的峰位；其中，溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極工作條件為溫度25°C、脈沖高度0.05V，脈沖寬度0.05s,電位增量0.0lV ;所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.20?200.0 μ M的鳥嘌呤、濃度為0.20?220.0yM的腺嘌呤、濃度為2.0?700.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為2.50?650.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.4、濃度為0.1?0.2Μ的PBS緩沖液混合后制成；
[0086]其中，鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶購自百靈威科技有限公司；
[0087]步驟五:對待測定的四種堿基混合液采用驟三制備的溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極進行電化學檢測，得到鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶隨濃度變化的差分脈沖伏安圖；然后分別以堿基濃度為橫坐標，以電化學檢測的電流信號為縱坐標，建立四種DNA堿基電化學信號變化規(guī)律圖；其中，溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極工作條件為溫度25°C、脈沖高度0.05V，脈沖寬度0.05s,電位增量0.0lV ;所述的待測定的四種堿基混合溶液由濃度為0.20?200.0 μ M的鳥嘌呤、濃度為0.20?220.0 μ M的腺嘌呤、濃度為2.0?700.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為2.50?650.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.4、濃度為0.1?0.2Μ的PBS緩沖液混合后制成。
[0088]本實施例得到的4種DNA堿基隨濃度變化的差分脈沖伏安圖如圖1所示，鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶同時隨濃度變化的差分脈沖伏安圖如圖2、4、6、8所示，其中，圖
3、5、7、9是將圖2、4、6、8的數(shù)據(jù)參數(shù)轉化為濃度_電化學信號得到的變化規(guī)律圖；圖10為為鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶同時隨濃度變化的差分脈沖伏安圖。
[0089]由圖1至圖10可知，本實施例提出的電化學傳感器，以DNA堿基含量為檢測指標，可同時觀察到鳥嘌呤(0.66V左右)、腺嘌呤(0.92V左右)、胸腺嘧啶(1.12V左右)及胞嘧啶(1.29V左右)四個電化學信號的變化，實現(xiàn)對四種DNA堿基的定量檢測。該電化學傳感器對腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶的線性檢測范圍分別為0.20-220.0 μ Μ,
0.20-200.0 μ Μ, 2.0-700.0 μ Μ, 2.50-650.0 μ Μ，最低檢出限分別可達 0.05 μ Μ, 0.06 μ Μ,
0.3 μ M 及 0.9 μ Μ。
[0090]本實施例提出的一種DNA堿基同時檢測的電化學傳感器通過檢測電化學信號來指示DNA堿基的變化情況，是一種簡單、快速、靈敏、快速的新型傳感器，而且不需要添加任何熒光或放射性標記物，操作非常安全。
[0091]實施例2
[0092]本實施例的一種用于DNA堿基同時檢測的電化學傳感器，按以下步驟進行:
[0093]步驟一:將利用Hrnnmer方法得到的氧化石墨烯粉末，于雙蒸水中超聲分散15min，得0.5mg/mL的氧化石墨烯水懸濁液；將溴甲酚紫于0.0lMNaNO3溶液中分散，得到
1.0X 10_3?2.0X IQ-3M的溴甲酚紫混合溶液；[0094]其中，所用溴甲酚紫屬于分析純；
[0095]步驟二:用微量移液器吸取6 μ L氧化石墨烯懸濁液，滴涂到氧化石墨烯表面，置于紅外燈下干燥，干燥后冷卻至室溫，得到氧化石墨烯修飾的玻碳電極；將氧化石墨烯修飾的玻碳電極置于ρΗ=5的PBS溶液中進行恒電位還原,還原電位為-1.5V,還原時間為720s,即得石墨烯修飾電極，室溫晾干；
[0096]其中，紅外燈照射時間根據(jù)玻碳電極表面石墨烯薄膜完全干燥確定；
[0097]步驟三:將步驟二中制得的石墨烯修飾電極置于溴甲酚紫溶液中進行循環(huán)伏安掃描，電位-1.0?+1.5V，掃描速率lOOmVs—1，循環(huán)次數(shù)15圈，即得溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極；
[0098]步驟四:用步驟三制備的溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極檢測四種堿基混合溶液的電化學信號，確定四種堿基電化學信號所在的峰位；其中，溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極工作條件為溫度25°C、脈沖高度0.05V，脈沖寬度0.05s,電位增量0.0lV ;所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.20?200.0 μ M的鳥嘌呤、濃度為0.20?220.0yM的腺嘌呤、濃度為2.0?700.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為2.50?650.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.4、濃度為0.1?
0.2Μ的PBS緩沖液混合后制成；
[0099]其中，鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶購自百靈威科技有限公司；
[0100]步驟五:對待測定的四種堿基混合液采用驟三制備的溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極進行電化學檢測，得到鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶隨濃度變化的差分脈沖伏安圖；然后分別以堿基濃度為橫坐標，以電化學檢測的電流信號為縱坐標，建立四種DNA堿基電化學信號變化規(guī)律圖；其中，溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極工作條件為溫度25°C、脈沖高度0.05V，脈沖寬度0.05s,電位增量0.0lV ;所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.20?200.0 μ M的鳥嘌呤、濃度為0.20?220.0 μ M的腺嘌呤、濃度為2.0?700.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為2.50?650.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.4、濃度為0.1?0.2Μ的PBS緩沖液混合后制成。
[0101]本實施例提出的電化學傳感器，以DNA堿基含量為檢測指標，可同時觀察到鳥嘌呤(0.66V左右)、腺嘌呤(0.92V左右)、胸腺嘧啶(1.12V左右)及胞嘧啶(1.29V左右)四個電化學信號的變化，實現(xiàn)對四種DNA堿基的定量檢測。該電化學傳感器對腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶的線性檢測范圍分別為0.20-220.0 μ Μ, 0.20-200.0 μ Μ, 2.0-700.0 μ Μ,
2.50-650.0 μ Μ,最低檢出限分別可達 0.05 μ Μ，0.06 μ Μ，0.3 μ M 及 0.9 μ Μ。
[0102]本實施例提出的一種DNA堿基同時檢測的電化學傳感器通過檢測電化學信號來指示DNA堿基的變化情況，是一種簡單、快速、靈敏、快速的新型傳感器，而且不需要添加任何熒光或放射性標記物，操作非常安全。
[0103]實施例3
[0104]本實施例的一種用于DNA堿基同時檢測的電化學傳感器，按以下步驟進行:
[0105]步驟一:將利用Hrnnmer方法得到的氧化石墨烯粉末，于雙蒸水中超聲分散15min，得0.5mg/mL的氧化石墨烯水懸濁液；將溴甲酚紫于0.0lMNaNO3溶液中分散，得到
1.0X 10_3?2.0X IO-3M的溴甲酚紫混合溶液；
[0106]其中，所用溴甲酚紫屬于分析純；
[0107]步驟二:用微量移液器吸取5 μ L氧化石墨烯懸濁液，滴涂到氧化石墨烯表面，置于紅外燈下干燥，干燥后冷卻至室溫，得到氧化石墨烯修飾的玻碳電極；將氧化石墨烯修飾的玻碳電極置于pH=5的PBS溶液中進行恒電位還原,還原電位為-1.5V,還原時間為700s,即得石墨烯修飾電極，室溫晾干；
[0108]其中，紅外燈照射時間根據(jù)玻碳電極表面石墨烯薄膜完全干燥確定；
[0109]步驟三:將步驟二中制得的石墨烯修飾電極置于溴甲酚紫溶液中進行循環(huán)伏安掃描，電位-1.0?+1.5V，掃描速率lOOmVs—1，循環(huán)次數(shù)15圈，即得溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極；
[0110]步驟四:用步驟三制備的溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極檢測四種堿基混合溶液的電化學信號，確定四種堿基電化學信號所在的峰位；其中，溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極工作條件為溫度25°c、脈沖高度0.05V，脈沖寬度0.05s,電位增量0.0lV ;所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.20?200.0 μ M的鳥嘌呤、濃度為0.20?220.0yM的腺嘌呤、濃度為2.0?700.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為2.50?650.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.4、濃度為0.1?
0.2Μ的PBS緩沖液混合后制成；
[0111]其中，鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶購自百靈威科技有限公司；
[0112]步驟五:對待測定的四種堿基混合液采用驟三制備的溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極進行電化學檢測，得到鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶隨濃度變化的差分脈沖伏安圖；然后分別以堿基濃度為橫坐標，以電化學檢測的電流信號為縱坐標，建立四種DNA堿基電化學信號變化規(guī)律圖；其中，溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極工作條件為溫度25°C、脈沖高度0.05V，脈沖寬度0.05s,電位增量0.0lV ;所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.20?200.0 μ M的鳥嘌呤、濃度為0.20?220.0 μ M的腺嘌呤、濃度為2.0?700.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為2.50?650.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.4、濃度為0.1?0.2Μ的PBS緩沖液混合后制成。
[0113]本實施例提出的電化學傳感器，以DNA堿基含量為檢測指標，可同時觀察到鳥嘌呤(0.66V左右)、腺嘌呤(0.92V左右)、胸腺嘧啶(1.12V左右)及胞嘧啶(1.29V左右)四個電化學信號的變化，實現(xiàn)對四種DNA堿基的定量檢測。該電化學傳感器對腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶的線性檢測范圍分別為0.20-220.0 μ Μ, 0.20-200.0 μ Μ, 2.0-700.0 μ Μ,
2.50-650.0 μ Μ,最低檢出限分別可達 0.05 μ Μ，0.06 μ Μ，0.3 μ M 及 0.9 μ Μ。
[0114]本實施例提出的一種DNA堿基同時檢測的電化學傳感器通過檢測電化學信號來指示DNA堿基的變化情況，是一種簡單、快速、靈敏、快速的新型傳感器，而且不需要添加任何熒光或放射性標記物，操作非常安全。
[0115]實施例4
[0116]本實施例的一種用于DNA堿基同時檢測的電化學傳感器，按以下步驟進行:
[0117]步驟一:將利用Hrnnmer方法得到的氧化石墨烯粉末，于雙蒸水中超聲分散15min，得0.5mg/mL的氧化石墨烯水懸濁液；將溴甲酚紫于0.0lMNaNO3溶液中分散，得到
1.0X 10_3?2.0X IO-3M的溴甲酚紫混合溶液；
[0118]其中，所用溴甲酚紫屬于分析純；
[0119]步驟二:用微量移液器吸取5 μ L氧化石墨烯懸濁液，滴涂到氧化石墨烯表面，置于紅外燈下干燥，干燥后冷卻至室溫，得到氧化石墨烯修飾的玻碳電極；將氧化石墨烯修飾的玻碳電極置于ρΗ=5的PBS溶液中進行恒電位還原,還原電位為-1.5V,還原時間為720s,即得石墨烯修飾電極，室溫晾干；
[0120]其中，紅外燈照射時間根據(jù)玻碳電極表面石墨烯薄膜完全干燥確定；
[0121]步驟三:將步驟二中制得的石墨烯修飾電極置于溴甲酚紫溶液中進行循環(huán)伏安掃描，電位-1.0?+1.4V，掃描速率lOOmVs—1，循環(huán)次數(shù)15圈，即得溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極；
[0122]步驟四:用步驟三制備的溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極檢測四種堿基混合溶液的電化學信號，確定四種堿基電化學信號所在的峰位；其中，溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極工作條件為溫度25°C、脈沖高度0.05V，脈沖寬度0.05s,電位增量0.0lV ;所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.20?200.0 μ M的鳥嘌呤、濃度為0.20?220.0yM的腺嘌呤、濃度為2.0?700.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為2.50?650.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.4、濃度為0.1?
0.2Μ的PBS緩沖液混合后制成；
[0123]其中，鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶購自百靈威科技有限公司；
[0124]步驟五:對待測定的四種堿基混合液采用驟三制備的溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極進行電化學檢測，得到鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶隨濃度變化的差分脈沖伏安圖；然后分別以堿基濃度為橫坐標，以電化學檢測的電流信號為縱坐標，建立四種DNA堿基電化學信號變化規(guī)律圖；其中，溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極工作條件為溫度25°C、脈沖高度0.05V，脈沖寬度0.05s,電位增量0.0lV ;所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.20?200.0 μ M的鳥嘌呤、濃度為0.20?220.0 μ M的腺嘌呤、濃度為2.0?700.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為2.50?650.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.4、濃度為0.1?0.2Μ的PBS緩沖液混合后制成。
[0125]本實施例提出的電化學傳感器，以DNA堿基含量為檢測指標，可同時觀察到鳥嘌呤(0.66V左右)、腺嘌呤(0.92V左右)、胸腺嘧啶(1.12V左右)及胞嘧啶(1.29V左右)四個電化學信號的變化，實現(xiàn)對四種DNA堿基的定量檢測。該電化學傳感器對腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶的線性檢測范圍分別為0.20-220.0 μ Μ, 0.20-200.0 μ Μ, 2.0-700.0 μ Μ,
2.50-650.0 μ Μ,最低檢出限分別可達 0.05 μ Μ，0.06 μ Μ，0.3 μ M 及 0.9 μ Μ。
[0126]本實施例提出的一種DNA堿基同時檢測的電化學傳感器通過檢測電化學信號來指示DNA堿基的變化情況，是一種簡單、快速、靈敏、快速的新型傳感器，而且不需要添加任何熒光或放射性標記物，操作非常安全。
[0127]實施例5
[0128]本實施例的一種用于DNA堿基同時檢測的電化學傳感器，按以下步驟進行:
[0129]步驟一:將利用Hrnnmer方法得到的氧化石墨烯粉末，于雙蒸水中超聲分散15min，得0.5mg/mL的氧化石墨烯水懸濁液；將溴甲酚紫于0.0lMNaNO3溶液中分散，得到
1.0X 10_3?2.0X IO-3M的溴甲酚紫混合溶液；
[0130]其中，所用溴甲酚紫屬于分析純；
[0131]步驟二:用微量移液器吸取5 μ L氧化石墨烯懸濁液，滴涂到氧化石墨烯表面，置于紅外燈下干燥，干燥后冷卻至室溫，得到氧化石墨烯修飾的玻碳電極；將氧化石墨烯修飾的玻碳電極置于ρΗ=5的PBS溶液中進行恒電位還原,還原電位為-1.5V,還原時間為720s,即得石墨烯修飾電極，室溫晾干；
[0132]其中，紅外燈照射時間根據(jù)玻碳電極表面石墨烯薄膜完全干燥確定；[0133]步驟三:將步驟二中制得的石墨烯修飾電極置于溴甲酚紫溶液中進行循環(huán)伏安掃描，電位-1.0?+1.5V，掃描速率lOOmVs—1，循環(huán)次數(shù)14圈，即得溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極；
[0134]步驟四:用步驟三制備的溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極檢測四種堿基混合溶液的電化學信號，確定四種堿基電化學信號所在的峰位；其中，溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極工作條件為溫度25°C、脈沖高度0.05V，脈沖寬度0.05s,電位增量0.0lV ;所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.20?200.0 μ M的鳥嘌呤、濃度為0.20?220.0yM的腺嘌呤、濃度為2.0?700.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為2.50?650.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.4、濃度為0.1?0.2Μ的PBS緩沖液混合后制成；
[0135]其中，鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶購自百靈威科技有限公司；
[0136]步驟五:對待測定的四種堿基混合液采用驟三制備的溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極進行電化學檢測，得到鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶隨濃度變化的差分脈沖伏安圖；然后分別以堿基濃度為橫坐標，以電化學檢測的電流信號為縱坐標，建立四種DNA堿基電化學信號變化規(guī)律圖；其中，溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極工作條件為溫度25°C、脈沖高度0.05V，脈沖寬度0.05s,電位增量0.0lV ;所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.20?200.0 μ M的鳥嘌呤、濃度為0.20?220.0 μ M的腺嘌呤、濃度為2.0?700.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為2.50?650.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.4、濃度為0.1?0.2Μ的PBS緩沖液混合后制成。
[0137]本實施例提出的電化學傳感器，以DNA堿基含量為檢測指標，可同時觀察到鳥嘌呤(0.66V左右)、腺嘌呤(0.92V左右)、胸腺嘧啶(1.12V左右)及胞嘧啶(1.29V左右)四個電化學信號的變化，實現(xiàn)對四種DNA堿基的定量檢測。該電化學傳感器對腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶的線性檢測范圍分別為0.20-220.0 μ Μ, 0.20-200.0 μ Μ, 2.0-700.0 μ Μ,
2.50-650.0 μ Μ,最低檢出限分別可達 0.05 μ Μ，0.06 μ Μ，0.3 μ M 及 0.9 μ Μ。
[0138]本實施例提出的一種DNA堿基同時檢測的電化學傳感器通過檢測電化學信號來指示DNA堿基的變化情況，是一種簡單、快速、靈敏、快速的新型傳感器，而且不需要添加任何熒光或放射性標記物，操作非常安全。
[0139]需要指出的是，以上說明及優(yōu)選實施例不可解釋為限定本發(fā)明的設計思想。在本發(fā)明的【技術領域】里持有相同知識者可以將本發(fā)明的技術性思想以多樣的形態(tài)改良變更，這樣的改良及變更應理解為屬于本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
【權利要求】
1.一種用于DNA堿基同時檢測的電化學傳感器，其特征在于它是按以下步驟進行: 步驟一:將利用Hrnnmer方法制備的氧化石墨烯粉末，于雙蒸水中超聲分散10~15min,得到濃度為0.2~0.5mg/mL的氧化石墨烯懸濁液；將溴甲酚紫于濃度為0.01M的NaNO3溶液中分散，得到濃度為1.0X 10_3~2.0X 10_3M的溴甲酚紫溶液； 步驟二:取5~10 μ L步驟一得到的氧化石墨烯懸濁液，滴涂到玻碳電極表面，置于紅外燈下干燥，干燥后冷卻至室溫，得到氧化石墨烯修飾的玻碳電極；將氧化石墨烯修飾的玻碳電極置于ρΗ=5~7的PBS溶液中進行恒電位還原，還原電位為-1.0~-1.5V,還原時間為360~720s，即得石墨烯修飾電極，室溫晾干待用； 步驟三:將步驟二中制得的石墨烯修飾電極置于步驟一得到的溴甲酚紫溶液中進行循環(huán)伏安掃描，其中，電位為-1.0~+1.5V，掃描速率為50~lOOmVs—1，循環(huán)次數(shù)為10~15圈，即得溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極； 步驟四:用步驟三制備的溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極檢測四種堿基混合溶液的電化學信號，確定四種堿基電化學信號所在的峰位；其中，所述的溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極檢測的工作條件如下:溫度為22~25°C、脈沖高度為0.01~0.1V，脈沖寬度為0.01~0.1s,電位增量為0.005~0.015V ;所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.20~200.0 μ M的鳥嘌呤、濃度為0.20~220.0 μ M的腺嘌呤、濃度為2.0~700.0yM的胸腺嘧啶、濃度為2.50~650.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.0~7.4、濃度為0.1~0.2Μ的PBS緩沖液制成； 步驟五:對待測的四種堿基混合液采用進行步驟三制備的溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極進行電化學檢測，得到鳥嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶隨濃度變化的差分脈沖伏安圖；然后分別以堿基濃度為橫坐標，以電化學檢測的電流信號為縱坐標，建立四種DNA堿基電化學信號變化規(guī)律圖；其中，所述的溴甲酚紫/石墨烯復合修飾電極檢測的工作條件如下:溫度為22~25°C、脈沖高度為0.01~0.1V，脈沖寬度為0.01~0.1s,電位增量為0.005~0.015V ;所述的待測定的四種堿基混合溶液由濃度為0.20~200.0yM的鳥嘌呤、濃度為0.20~220.0 μ M的腺嘌呤、濃度為2.0~700.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為2.50~650.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.0~7.4、濃度為0.1~0.2Μ的PBS緩沖液制成。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種用于DNA堿基同時檢測的電化學傳感器，其特征在于步驟一中所述的氧化石墨烯懸池液濃度為0.5mg/mL。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種用于DNA堿基同時檢測的電化學傳感器，其特征在于步驟一中所述的溴甲酚紫溶液濃度為2.0X10_3M。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種用于DNA堿基同時檢測的電化學傳感器，其特征在于步驟二中所述的取5μ L步驟一得到的氧化石墨烯懸濁液，滴涂到玻碳電極表面。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種用于DNA堿基同時檢測的電化學傳感器，其特征在于步驟二中所述的氧化石墨烯的還原電位為-1.5V。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種用于DNA堿基同時檢測的電化學傳感器，其特征在于步驟二中所述的氧化石墨烯的還原時間為720s。
7.根據(jù)權利要求1所述的一種用于DNA堿基同時檢測的電化學傳感器，其特征在于步驟三中所述的聚合溴甲酚紫時所用的掃描速率為IOOmVs'
8.根據(jù)權利要求1所述的一種用于DNA堿基同時檢測的電化學傳感器，其特征在于步驟三中所述的聚合溴甲酚紫圈數(shù)為15圈。
9.根據(jù)權利要求1所述的一種用于DNA堿基同時檢測的電化學傳感器，其特征在于步驟四中所述的PBS緩沖液pH=7.4。
10.根據(jù)權利要求1所述的一種用于DNA堿基同時檢測的電化學傳感器，其特征在于步驟五中所述的所述的四種堿基混合溶液由濃度為0.20~50.0μ M的鳥嘌呤、濃度為0.20~50.0 μ M的腺嘌呤、濃度為2.0~200.0 μ M的胸腺嘧啶、濃度為2.50~100.0 μ M的胞嘧啶和ρΗ=7.2~7.4、濃度為0.1~0.2Μ的PBS緩沖液制成。
【文檔編號】G01N27/26GK103760202SQ201410041822
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月28日 優(yōu)先權日:2014年1月28日
【發(fā)明者】袁星, 武冬梅, 朱曉琳, 李錦蓮 申請人:東北師范大學