薄皮甜瓜中果肉蛋白質(zhì)組分析方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種薄皮甜瓜中果肉蛋白質(zhì)組分析方法，是將薄皮甜瓜中果肉總蛋白質(zhì)提取后，首先進(jìn)行等電聚焦電泳，再進(jìn)行SDS-PAGE凝膠垂直電泳。本發(fā)明提供了一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、易行、快速的適用于薄皮甜瓜中果肉的總蛋白的提取及雙向電泳方法。本發(fā)明使用Tris/酚提取-甲醇乙酸銨沉淀法提取蛋白質(zhì)，可以有效提取薄皮甜瓜中果肉的蛋白質(zhì)，減少大量糖分和其他有機(jī)質(zhì)的影響。目前，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)證明：實(shí)驗(yàn)樣品制備全、2-DE電泳操作簡(jiǎn)單、且圖譜清晰、重復(fù)性好、試劑毒性較低、結(jié)果可靠，可為葫蘆科園藝作物蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供技術(shù)范例，是一套適用于薄皮甜瓜中果肉蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳技術(shù)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】薄皮甜瓜中果肉蛋白質(zhì)組分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于園藝作物蛋白質(zhì)組分析領(lǐng)域，尤其涉及一種薄皮甜瓜中果肉蛋白質(zhì)組分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002]甜瓜((Szcwffii1S L)果實(shí)香甜，富含糖、淀粉,還有少量蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)及其他維生素，作為一個(gè)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的園藝作物，近年來(lái)越來(lái)越受到青睞。然而，目前關(guān)于甜瓜生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中蛋白質(zhì)組的變化、不同生境下的差異蛋白質(zhì)組以及外源物質(zhì)調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)組變化鮮見(jiàn)報(bào)道。特別是果實(shí)中蛋白質(zhì)的含量和各種酶對(duì)果實(shí)發(fā)育過(guò)程中不同生理生化反應(yīng)的作用，逆境條件下果實(shí)中蛋白質(zhì)種類(lèi)、功能及代謝的途徑，以及蛋白質(zhì)磷酸化的作用機(jī)制等等方面的研究缺乏。這些都與實(shí)際生產(chǎn)存在密切關(guān)系，因此，研究甜瓜果實(shí)中的蛋白質(zhì)組，并結(jié)合代謝組的研究探索果實(shí)發(fā)育模式及制定相應(yīng)調(diào)控措施，將為創(chuàng)造高產(chǎn)、具有良好農(nóng)藝特征的甜瓜提供美好的前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提供了一種薄皮甜瓜中果肉蛋白質(zhì)組分析方法，應(yīng)用本發(fā)明的方法可以從薄皮甜瓜中果肉提取出較高純度的蛋白質(zhì)，得到清晰、重復(fù)性好的圖譜，并且經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)的分析能得出較多差異蛋白點(diǎn)，便于質(zhì)譜分析。
[0004]本發(fā)明提供的一種薄皮甜瓜中果肉蛋白質(zhì)組分析方法，是將薄皮甜瓜中果肉總蛋白質(zhì)提取后，首先進(jìn)行等電聚焦電泳，再進(jìn)行SDS-PAGE凝膠垂直電泳。
[0005]優(yōu)選地，所述薄皮甜瓜蛋白質(zhì)提取是將薄皮甜瓜中果肉用Tris提取液/Tris-飽和酚提取，用含乙酸銨的甲醇溶液沉淀得到的。
[0006]此方法可以有效提取薄皮甜瓜中果肉的蛋白質(zhì)，避免大量糖分和其他有機(jī)質(zhì)的影響。
[0007]進(jìn)一步地，每Ig薄皮甜瓜中果肉需要3?4 ml Tris提取液和3?4 ml Tris-飽和酚。
[0008]在此比例下可以最大量的溶解出樣品中的蛋白質(zhì)，減少樣品和試劑的浪費(fèi)。是提取甜瓜中果肉總蛋白的最優(yōu)比例。
[0009]所述Tris提取液和Tris-飽和酚的體積比為1:1。
[0010]優(yōu)選地，所述等電聚焦電泳中使用24cm膠條。
[0011]選擇24cm膠條，是為了使蛋白質(zhì)更好的分離，避免蛋白質(zhì)點(diǎn)之間的重疊，使蛋白質(zhì)點(diǎn)在膠上達(dá)到最大程度的分離。
[0012]進(jìn)一步地，所述等電聚焦電泳中上樣量為800 μ g蛋白質(zhì)，終上樣體積為450 μ I。
[0013]此上樣量是24cm膠條的最優(yōu)上樣量，這樣蛋白點(diǎn)聚焦好，無(wú)橫紋和豎紋，分離徹底，能夠得到清晰的蛋白質(zhì)圖譜。
[0014]優(yōu)選地，所述等電聚焦電泳后包括膠條平衡的步驟，所述膠條平衡分兩步，每步20mino
[0015]每步平衡20min，可以保證每步的平衡完全徹底，又不會(huì)造成過(guò)度平衡。
[0016]優(yōu)選地，在所述SDS-PAGE凝膠垂直電泳中，先IW /塊跑Ih，瓊脂糖形成一條直線后,調(diào)成5W/塊跑8h。
[0017]前Ih以?xún)?nèi)選擇IW/塊膠的功率跑膠，可以使蛋白質(zhì)在低功率下均勻平穩(wěn)的從膠條上轉(zhuǎn)移到膠上，然后選擇較高的功率跑膠，使不同的蛋白質(zhì)達(dá)到快速高效的分離。
[0018]優(yōu)選地，所述SDS-PAGE凝膠垂直電泳后包括固定、染色、脫色的步驟，在固定后用純水清洗，所述染色時(shí)間為24小時(shí)。
[0019]本發(fā)明提供了一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、易行、快速的適用于薄皮甜瓜中果肉的總蛋白的提取及雙向電泳方法。本發(fā)明使用Tris/酚提取-甲醇乙酸銨沉淀法提取蛋白質(zhì)，可以有效提取薄皮甜瓜中果肉的蛋白質(zhì)，減少大量糖分和其他有機(jī)質(zhì)的影響。目前，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)證明:實(shí)驗(yàn)樣品制備全、2-DE電泳操作簡(jiǎn)單、且圖譜清晰、重復(fù)性好、試劑毒性較低、結(jié)果可靠，可為葫蘆科園藝作物蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供技術(shù)范例，是一套適用于薄皮甜瓜中果肉蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳技術(shù)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1為上樣量為500 μ g蛋白質(zhì)，使用不同pH范圍的膠條進(jìn)行等電聚焦電泳，再進(jìn)行凝膠垂直電泳后的圖譜比較；其中，圖1A使用的是pH3-10，24cm膠條；圖1B使用的是pH4-7, 24cm 膠條；
圖2為使用pH4-7，24cm膠條時(shí)，不同蛋白質(zhì)上樣量進(jìn)行等電聚焦電泳，再進(jìn)行凝膠垂直電泳后的圖譜比較；其中，圖2A的上樣量為SOOyg蛋白質(zhì)；圖2B的上樣量為800 μ g蛋白質(zhì)。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。如未特殊說(shuō)明，“％”為質(zhì)量百分比。
[0022]薄皮甜瓜雖然包括許多品種，但是品種間果實(shí)中糖類(lèi)、膠質(zhì)、酚類(lèi)等物質(zhì)的成分和含量相差不多，因此本發(fā)明的方法適用于薄皮甜瓜的所有品種。
[0023]本發(fā)明采用Tris提取液/Tris飽和酹提取-甲醇乙酸銨沉淀法提取蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)裂解、定量。計(jì)算上樣量后進(jìn)行第一向等電聚焦，一般需要30h。第一向完成，進(jìn)行膠條平衡。然后開(kāi)始第二向SDS-PAGE凝膠垂直電泳。最后把凝膠固定、染色及脫色，得到蛋白點(diǎn)清晰的圖譜。
[0024]實(shí)施例1
本發(fā)明的薄皮甜瓜蛋白質(zhì)組分析方法具體如下:
1、蛋白質(zhì)的提取
稱(chēng)取薄皮甜瓜(京蜜11號(hào))中果肉約lg，置液氮中研磨成粉狀后，向研缽中加入3mlTris 提取液(Tris 提取液配方:50 mmol /T,Tri s, 50 mmol/L EDTA, 100 mmol/L 氯化鉀，2%DTT，30%蔗糖，lmmol/L PMSF,其余為水)，待其融化后，繼續(xù)研磨3?4min，轉(zhuǎn)至離心管中，加入等體積pH8.0 Tris-飽和酹,潤(rùn)鏇,離心(10000 Xg,4°C) IOmin0取酹層，以等體積Tris提取液加入酚層中抽提2次，往酚層中加入約5倍體積0.1 mo I/L乙酸銨的甲醇溶液，-20°C沉淀2h以上。離心(15000 Xg，4°C)20min，棄上清液，沉淀用-20°C預(yù)冷甲醇洗滌I次，再以丙酮(含2%DTT，-20°C預(yù)冷)洗滌2次，室溫干燥，所得干粉置_80°C保存待用。
[0025]樣品的裂解
向樣品的蛋白質(zhì)粉末中加入250μ I裂解液(7Μ尿素，2Μ硫脲，4% CHAPS, 2%IPG-buffer,50 mMDTT)進(jìn)行裂解。30KHz超聲波促溶20min后，在室溫下靜置2h，使蛋白質(zhì)充分溶解。轉(zhuǎn)至小離心管中，離心(20000Xg) 20min,進(jìn)一步促溶。
[0026]2、蛋白質(zhì)定量
用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)進(jìn)行定量。
[0027]3、等電聚焦
本發(fā)明所用為PH4-7的24cm膠條，上樣量為800 μ g蛋白質(zhì)，樣品液+水化液(7M尿素，2M硫脲，2% CHAPS,0.5 % IPG buffer, 65 mM DTT)終上樣體積為450 μ I。等電聚焦的程序如表1所示:
表1
【權(quán)利要求】
1.一種薄皮甜瓜中果肉蛋白質(zhì)組分析方法，其特征在于:是將薄皮甜瓜中果肉總蛋白質(zhì)提取后，首先進(jìn)行等電聚焦電泳，再進(jìn)行SDS-PAGE凝膠垂直電泳。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述薄皮甜瓜蛋白質(zhì)提取是將薄皮甜瓜中果肉用Tris提取液/Tris-飽和酚提取，用含乙酸銨的甲醇溶液沉淀得到的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:每Ig薄皮甜瓜中果肉需要31ml Tris提取液和:3~4 ml Tris-飽和酚。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述Tris提取液和Tris-飽和酚的體積比為1:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述等電聚焦電泳中使用24cm膠條。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述等電聚焦電泳中上樣量為800μ g蛋白質(zhì),終上樣體積為450 μ I。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述等電聚焦電泳后包括膠條平衡的步驟，所述膠條平衡分兩步，每步20min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:在所述SDS-PAGE凝膠垂直電泳中，先IW/塊跑lh，瓊脂糖形成一條直線后，調(diào)成5W/塊跑8h。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述SDS-PAGE凝膠垂直電泳后包括固定、染色、脫色的步驟， 在固定后用純水清洗，所述染色時(shí)間為24小時(shí)。
【文檔編號(hào)】G01N1/28GK103760210SQ201410026620
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月21日
【發(fā)明者】郝敬虹, 黃雅芳, 房克鳳, 楊瑞, 劉超杰, 韓瑩琰, 楊柳, 王建立, 張卿, 宋婷婷, 孫中華, 于同泉, 王紹輝, 范雙喜 申請(qǐng)人:北京農(nóng)學(xué)院