人乳腺癌細(xì)胞乙?；痯53蛋白同位素標(biāo)記定量方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分析領(lǐng)域，涉及乳腺癌細(xì)胞內(nèi)源性生物大分子乙?；痯53蛋白同位素定量分析，利用免疫共沉淀，凝膠電泳等技術(shù)手段對(duì)細(xì)胞復(fù)雜基質(zhì)樣品中乙?；痯53蛋白進(jìn)行提取分離純化。步驟如下：利用重組人p53蛋白、乳腺癌細(xì)胞內(nèi)p53蛋白經(jīng)胰蛋白酶水解產(chǎn)生的特異性肽段進(jìn)行定性定量的策略，以特異性肽段序列內(nèi)氨基酸進(jìn)行穩(wěn)定碳13、氮15同位素標(biāo)記的合成肽段為內(nèi)標(biāo)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)乳腺癌細(xì)胞樣品中DNA結(jié)合區(qū)特異性位點(diǎn)乙酰化p53蛋白的定量。本發(fā)明主要包括樣品提取及凝膠電泳方法、Obitrap測(cè)定方法、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備和精密度測(cè)定。本發(fā)明方法線性關(guān)系良好、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，可用于乙酰化p53蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定量。
【專利說(shuō)明】人乳腺癌細(xì)胞乙酰化P53蛋白同位素標(biāo)記定量方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用同位素標(biāo)記結(jié)合軌道阱(obitrap)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)人乳腺癌細(xì)胞內(nèi)DNA結(jié)合區(qū)的功能性位點(diǎn)乙?；痯53蛋白的定量方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乳腺癌已經(jīng)成為全球范圍女性最常見(jiàn)的癌癥，p53基因是迄今為止已發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤發(fā)生相關(guān)性最高的抑癌基因，與乳腺癌腫瘤生長(zhǎng)、調(diào)亡及耐藥關(guān)系密切。乳腺癌細(xì)胞受到化療藥物刺激之后，P53蛋白表達(dá)上調(diào)，啟動(dòng)下游一系列細(xì)胞凋亡程序，從而殺死腫瘤細(xì)胞，P53蛋白表達(dá)量增加，可明顯抑制腫瘤血管生成，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。DNA損傷過(guò)程中p53經(jīng)歷復(fù)雜的翻譯后修飾作用，包括磷酸化、乙?；?、甲基化、泛素化等，其中乙酰化是P53蛋白活化并產(chǎn)生功能的必要條件，DNA結(jié)合區(qū)位點(diǎn)的乙?；c腫瘤細(xì)胞凋亡密切相關(guān)?，F(xiàn)有的P53蛋白定量方法主要是Western Blot方法，這種方法只能達(dá)到相對(duì)定量的目的，并且無(wú)法對(duì)一些特定乙酰化位點(diǎn)進(jìn)行定量。相對(duì)于Western Blot方法，同位素質(zhì)譜定量技術(shù)具有更好的選擇性和精密度。建立人乳腺癌細(xì)胞內(nèi)DNA結(jié)合區(qū)位點(diǎn)乙酰化p53的細(xì)胞樣品同位素定量方法對(duì)于觀察腫瘤細(xì)胞狀態(tài)，研究化療藥物藥效具有重要的意義，對(duì)改善臨床給藥方案，減低抗腫瘤藥物毒性反應(yīng)和腫瘤復(fù)發(fā)是十分必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，建立人乳腺癌細(xì)胞DNA結(jié)合區(qū)的功能性位點(diǎn)乙?；疨53蛋白的提取方法并建立其質(zhì)譜定性定量方法。
[0004]本發(fā)明采取的技術(shù)方案是，首先利用免疫共沉淀技術(shù)，經(jīng)抗體吸附純化后用SDS-PAGE分離，硝酸銀染色。經(jīng)胰蛋白酶膠內(nèi)消化后軌道離子阱質(zhì)譜(Orbitrap)檢測(cè)內(nèi)源性P53蛋白的特異性乙?；亩?，選擇的乙酰化特異性肽段是該的蛋白胰酶水解后獨(dú)有的?；谲壍离x子阱質(zhì)譜(Orbitrap)，利用多種模式對(duì)特異性肽段進(jìn)行分析，建立可靠，穩(wěn)定質(zhì)譜定量方法。合成與特異性乙酰化肽段序列相同并用穩(wěn)定同位素C13、N15標(biāo)記該肽段的氨基酸作為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行定量分析建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而實(shí)現(xiàn)特異性肽段的定量，進(jìn)而對(duì)蛋白的表達(dá)量進(jìn)行分析。
[0005]本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下所述。
[0006]人乳腺癌細(xì)胞內(nèi)源性乙?；痯53蛋白同位素標(biāo)記定量方法，包括細(xì)胞樣品的提取方法和質(zhì)譜定量方法，具體步驟如下:
[0007]A、細(xì)胞樣品提取方法:
[0008](I)樣品總蛋白的制備:收集細(xì)胞蛋白，加入NP40溫和裂解液100 μ L(已加蛋白酶抑制劑)，冰上超聲破碎，16000g4度離心30分鐘，取上清，并測(cè)定蛋白濃度。
[0009](2)免疫共沉淀提取過(guò)程:
[0010]洗磁珠:將50 μ L磁珠加入到Iml的PBS中，14000g，4°C離心lmin，重復(fù)2次，棄上清。磁珠加入到蛋白質(zhì)中，4°C搖床lh。14000g，4°C離心lmin，棄底，移上清至新的EP管中，加抗體(Hyg/^OOyg細(xì)胞總蛋白)及IgG，4°C搖床過(guò)夜。
[0011]次日，洗磁珠2次。14000g，4°C離心lmin。向磁珠中加入抗體蛋白混合液，4°C搖床3h。14000g，4°C離心lmin。棄上清，留底(磁珠)。洗磁珠3次(第一，第二次用PBS，第三次用lysis)，瞬時(shí)離心。向磁珠中加入2X b μ ffer (25~30 μ L),沸水煮5min, 12000rpm,離心5min,電泳。
[0012]銀染過(guò)程:固定:配制固定液，固定I~3h,搖床,室溫。敏化:固定結(jié)束后換用敏化液，敏化30min。水洗:倒出敏化液，以ddH20洗5minX3次。染色:銀染20min。水洗:倒出銀染液后，以ddH20洗1.5minX I次。顯色:加入顯色液后仔細(xì)觀察凝膠顯色情況，直至蛋白質(zhì)點(diǎn)完全顯現(xiàn)為止，一般約需要5~IOmin左右。終止:倒出顯色液后，立即加入終止液，終止顯色lOmin。保存:終止后以ddH20洗10minX2次，換成10%乙醇溶液保存使用。 [0013]打開(kāi)通風(fēng)櫥，用水和酒精小心仔細(xì)擦拭超凈臺(tái)；用ddH20洗膠3次，每次超聲5min(膠污染較多時(shí)，可用10%乙醇代替ddH20) ;3000rpm，lmin離心，棄液，用ACN脫色5min，銀染膠為灰白色有彈性為止；3000rpm，lmin離心，棄液，加入IOmM DTT50 μ L，56°C水浴 Ih ；3000rpm, lmin 離心，棄液，加入 55mM IAA50 μ L,暗處避光，45min ；3000rpm, lmin 離心，棄液，依次加入25mM NH4HC03,50% ACN, 100% ACN，逐級(jí)脫水；
[0014](3)蛋白樣品的胰蛋白酶消化:加酶(10叩/1^)，一個(gè)膠粒對(duì)應(yīng)2~31^，每多一個(gè)膠粒，多加I μ L的酶，4°C或冰上靜止30min，小心吸出多余酶液。加入8.5 μ LNH4HC03作為覆蓋液，放入37°C水浴，過(guò)夜。加入2% TFA終止反應(yīng)，至終濃度為0.1%。
[0015](4)低溫凍干，復(fù)溶，樣品肽段除鹽后進(jìn)樣。
[0016]B、LTQ Orbitrap Velos 質(zhì)譜儀條件為:
[0017]反相分離肽段所用的A相跟B相體系是:A相(含0.1%的甲酸的乙腈)，B相(含
0.1%的甲酸的水)。肽段分析:運(yùn)用LTQ Orbitrap Velos質(zhì)譜儀與納升液相色譜柱串聯(lián)來(lái)完成的。質(zhì)譜掃描后獲得分析譜圖的質(zhì)核比范圍是350-1800，從一級(jí)掃描圖譜中選取20個(gè)強(qiáng)度最高的離子進(jìn)行HCD模式碎裂獲得二級(jí)譜圖(用Xcalibur質(zhì)譜軟件進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè))，動(dòng)態(tài)質(zhì)譜窗口間隔是60秒。Orbitrap Velos檢測(cè)得到的RAW文件用MaxQuant (vl.2.2.5)檢索，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作流程檢索鑒定到的譜圖，峰值列表檢索對(duì)照UniPiOtKB人類蛋白質(zhì)組序列數(shù)據(jù)庫(kù)，接著計(jì)算乙?；疨53蛋白量。
[0018]表1肽段監(jiān)測(cè)值
[0019]
【權(quán)利要求】
1. 人乳腺癌細(xì)胞內(nèi)源性乙酰化P53蛋白同位素標(biāo)記定量方法，包括樣品的提取方法和質(zhì)譜定量方法，具體步驟如下:生物樣品提取方法: 提取制備樣品總蛋白；利用免疫共沉淀進(jìn)行提取，其中抗體濃度為l_2yg / 200yg細(xì)胞總蛋白；蛋白樣品的胰蛋白酶消化；加酶(IOng / uL),—個(gè)膠粒對(duì)應(yīng)2到3uL,每多出一個(gè)膠粒，多加至少IuL的酶，4°C或冰上靜止放置30min，小心地吸出多余酶液。并加入8.5uLNH4HC03作為覆蓋液，再放入37°C水浴，保持溫度過(guò)夜；次日再加入2% TFA終止反應(yīng)，至終濃度達(dá)到0.1%。低溫凍干，0.1%甲酸復(fù)溶樣品，肽段經(jīng)過(guò)除鹽后進(jìn)樣。
2.LTQ Orbitrap Velos 質(zhì)譜儀條件為: 反相分離肽段所用的A相跟B相體系是:A相(含0.1%的甲酸的乙腈)，B相(含0.1%的甲酸的水)。肽段分析:運(yùn)用LTQ Orbitrap Velos質(zhì)譜儀與納升液相色譜柱串聯(lián)來(lái)完成的。質(zhì)譜掃描后獲得分析譜圖的質(zhì)核比范圍是350-1800，從一級(jí)掃描圖譜中選取20個(gè)強(qiáng)度最高的離子進(jìn)行HCD模式碎裂獲得二級(jí)譜圖(用Xcalibur質(zhì)譜軟件進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè))，動(dòng)態(tài)質(zhì)譜窗口間隔是60秒。Orbitrap Velos檢測(cè)得到的RAW文件用MaxQuant (vl.2.2.5)檢索，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作流程檢索鑒定到的譜圖，峰值列表檢索對(duì)照UniPiOtKB人類蛋白質(zhì)組序列數(shù)據(jù)庫(kù)，接著計(jì)算乙酰化P53蛋白量。 特異性乙?；亩伪O(jiān)測(cè)設(shè)定值，Ql:967.5，Q3:1086.5 ;內(nèi)標(biāo)肽段多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)設(shè)定值，Ql:970.5，Q3:1092.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的人乳腺癌細(xì)胞內(nèi)源性乙酰化p53蛋白同位素標(biāo)記定量方法，其特征在于所述的定量?jī)?nèi)標(biāo)肽段為穩(wěn)定同位素碳13、氮15標(biāo)記的特征乙?；亩?，內(nèi)標(biāo)溶液濃度為2μ g/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線利用H1299細(xì)胞基質(zhì)(p53蛋白不表達(dá))作為空白基質(zhì)。
【文檔編號(hào)】G01N27/62GK103743808SQ201410022161
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2014年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月17日
【發(fā)明者】王廣基, 湯志遠(yuǎn), 郝海平, 吳夢(mèng)秋, 李盈淳 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)