一種檢測毛竹納米微晶纖維素生物相容性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測毛竹納米微晶纖維素生物相容性的方法。采用方法的要點(diǎn)是將毛竹納米微晶纖維素配成一定濃度的溶液，分別加入熒光染色劑與細(xì)胞增殖與活性檢測試劑（CellCountingKit,CCK-8），與細(xì)胞共同培養(yǎng)檢測其生物相容性。該方法簡易、快速、高效，特別適于檢測毛竹納米微晶纖維素的生物相容性。將毛竹納米微晶纖維素與細(xì)胞共同培養(yǎng)，利用CCK-8試劑定量測定細(xì)胞在毛竹納米微晶纖維素中的增殖情況，本發(fā)明提供的方法生成產(chǎn)物為水溶性的,不需要后續(xù)的溶解過程,可避免因溶解不完全而造成的實(shí)驗(yàn)誤差，使檢測結(jié)果更可靠、有效。
【專利說明】—種檢測毛竹納米微晶纖維素生物相容性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測微晶纖維素生物相容性的方法，特別涉及一種檢測毛竹納米微晶纖維素生物相容性的方法，屬于生物質(zhì)材料資源化利用【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]生物相容性是指材料置入生物體內(nèi)與機(jī)體之間產(chǎn)生一系列生物、物理、化學(xué)等反應(yīng)的概念。對生物相容性的檢測主要基于生物安全性、生物功能性兩大基本原則，即要求生物材料無毒性、無刺激性、無致癌性、無致敏性、無致畸性、無突變性、無排斥性以及能夠刺激宿主產(chǎn)生滿足特定功能的生物學(xué)響應(yīng)。目前，檢測材料生物相容性的方法主要為組織相容性和體外細(xì)胞生物學(xué)兩類。組織相容性檢測方法主要是用組織生物學(xué)方法觀察材料置入生物體內(nèi)后周圍組織的反應(yīng)情況，雖然更能真實(shí)地反應(yīng)材料的生物學(xué)性能，但往往需要較長的實(shí)驗(yàn)觀察周期、耗用成本較大且體內(nèi)生物環(huán)境復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)較難控制。因此常常通過體外細(xì)胞生物學(xué)方法對材料生物相容性進(jìn)行檢測。體外細(xì)胞生物學(xué)方法是將生物材料與活體細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)以研究細(xì)胞在材料上的粘附、增殖、分化等生物學(xué)行為。
[0003]人骨肉瘤細(xì)胞(MG63)是一種具有成骨細(xì)胞表型特性的特殊腫瘤細(xì)胞群，主要是從成骨細(xì)胞或骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來，由于其表型穩(wěn)定而廣泛應(yīng)用在生物材料對成骨細(xì)胞生物學(xué)特性影響的研究方面。小鼠成纖維細(xì)胞(L929)在體外替代實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用廣泛，主要針對藥物載體的生物相容性檢測。
[0004]在納米微晶纖維素的制備及性能檢測領(lǐng)域，中國專利(ZL 01107523.6) “一種具有纖維素II晶型的納米微晶纖維素及制法”以棉短絨為原料，采用DMSO與強(qiáng)堿同時(shí)溶脹，無機(jī)酸、有機(jī)酸或固態(tài)酸水解制備了納米微晶纖維素，并描述了其形貌和晶型結(jié)構(gòu)；中國專利(ZL 200510100343.6) “用氯氣氧化降解制備納米微晶纖維素的方法”以劍麻纖維或木材纖維為原料，采用氯氣氧化降解制備了色澤潔白的球狀納米微晶纖維素；中國專利(ZL 00117261.1) “一種納米微晶纖維素及制法”以棉短絨為原料，采用硫酸、鹽酸、磷酸和硝酸中一種或幾種的混合物，或者采用丙烯酸、苯甲酸、乙二酸中一種或幾種的混合物，或者采用固體酸水解制備了納米微晶纖維素，并對其形貌和晶型進(jìn)行了表征；美國專利(US20100124651A1) “Method of manufacturing nano-crystal I ine cellulose film”米用木材纖維納米微晶纖維素為原料，與有機(jī)和無機(jī)材料復(fù)合，制備了高強(qiáng)度納米復(fù)合材料薄膜，大幅提高了原薄膜的物理性能。截至目前，還未見到以MG63和L929細(xì)胞為評價(jià)體系，檢測毛竹納米微晶纖維素生物相容性的的相關(guān)工藝技術(shù)出現(xiàn)。
[0005]納米微晶纖維素作為一種新型可再生納米材料正備受關(guān)注，其不但具有普通纖維素的基本結(jié)構(gòu)和性能，還具備納米顆粒的特性，如巨大的比表面積、較高的楊氏模量、超強(qiáng)的吸附能力和靈敏的反應(yīng)活性，目前主要應(yīng)用于材料增強(qiáng)、改善材料光學(xué)特性等方面。通過適宜的評價(jià)細(xì)胞，檢測其生物相容性，可拓展納米微晶纖維素在生物醫(yī)藥如骨組織修復(fù)、藥物載體方面的應(yīng)用范圍。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了拓寬納米微晶纖維素的應(yīng)用領(lǐng)域和范圍，高值化利用現(xiàn)有毛竹資源，為生物醫(yī)藥領(lǐng)域(骨組織修復(fù)、藥物載體等方面)提供新型可再生納米材料，評價(jià)其生物學(xué)特性，本發(fā)明的目的是提供一種檢測毛竹納米微晶纖維素生物相容性的方法。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是采用以下步驟:
1)將毛竹納米微晶纖維素配制成濃度0.04 wt%溶液，進(jìn)行高壓滅菌處理，得到經(jīng)預(yù)處理的毛竹納米微晶纖維素溶液；
2)在無菌環(huán)境下，將檢測細(xì)胞在培養(yǎng)基中按傳代培養(yǎng)方法消化成單細(xì)胞懸濁液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以5X IO3個(gè)/孔向96孔板中加入檢測細(xì)胞，同時(shí)量取步驟I)中得到的經(jīng)預(yù)處理的毛竹納米微晶纖維素溶液分別加入96孔板，保證每孔溶液總量200 μ L，獲得毛竹納米微晶纖維素-檢測細(xì)胞混合培養(yǎng)液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；
3)分別在1、3、5、7天吸取96孔板中的毛竹納米微晶纖維素-檢測細(xì)胞混合培養(yǎng)液，用PBS溶液清洗數(shù)次，加入CCK-8試劑和培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-6 h，吸取100 μ L上清液加入96孔板中，在450 nm波長采用酶標(biāo)儀檢測其OD值；
4)同時(shí)將步驟2)中得到的毛竹納米微晶纖維素-檢測細(xì)胞混合培養(yǎng)液與含有DiO染料的培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1(T20 min,吸出培養(yǎng)基并用PBS溶液清洗去除未結(jié)合染料，加入I mL胰酶，制成單細(xì)胞懸液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，分別在1、3、5、7天利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的增殖情況。
[0008]所述的毛竹納米微晶纖維素，由硫酸水解或纖維素酶水解毛竹纖維制備。
[0009]所述的PBS溶液濃度為0.0f0.05 mol/L ;CCK_8試劑與培養(yǎng)基質(zhì)量比為1:10?50 ；Dio染料與培養(yǎng)基質(zhì)量比為1:100?300。
[0010]所述的檢測細(xì)胞是L929細(xì)胞和MG63細(xì)胞中的一種，其中L929細(xì)胞采用MEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，MG63細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
[0011]與【背景技術(shù)】相比，本發(fā)明具有的有益效果是:
本發(fā)明在表征納米微晶纖維素性能領(lǐng)域引入對其進(jìn)行生物學(xué)特性檢測的方法，對于拓展其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是骨組織修復(fù)、藥物載體方面的實(shí)際應(yīng)用提供了前提，對于拓寬和高值化利用納米微晶纖維素具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1、2、3、4分別是實(shí)施例1中的毛竹納米微晶纖維素與L929細(xì)胞共混培養(yǎng)1、3、
5、7天的熒光顯微鏡照片。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0014]實(shí)施例1:
1)將由纖維素酶水解制備的毛竹納米微晶纖維素配制成濃度0.04 wt%溶液，進(jìn)行高壓滅菌處理，得到經(jīng)預(yù)處理的毛竹納米微晶纖維素溶液；
2)在無菌環(huán)境下，將L929細(xì)胞在MEM培養(yǎng)基中按傳代培養(yǎng)方法消化成單細(xì)胞懸濁液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以5X IO3個(gè)/孔向96孔板中加入L929細(xì)胞，同時(shí)量取步驟I)中得到的經(jīng)預(yù)處理的毛竹納米微晶纖維素溶液分別加入96孔板，保證每孔溶液總量200 μ L，獲得毛竹納米微晶纖維素-L929細(xì)胞混合培養(yǎng)液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；
3)分別在1、3、5、7天吸取96孔板中的毛竹納米微晶纖維素-L929細(xì)胞混合培養(yǎng)液，用0.01 mol/L PBS溶液清洗數(shù)次，按照1:30質(zhì)量比加入CCK-8試劑和MEM培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，吸取100 μ L上清液加入96孔板中，在450 nm波長采用酶標(biāo)儀檢測其OD值(a)；
4)同時(shí)將步驟2)中得到的毛竹納米微晶纖維素-L929細(xì)胞混合培養(yǎng)液與含有DiO染料的MEM培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min，Dio染料與MEM培養(yǎng)基質(zhì)量比為1:100，吸出MEM培養(yǎng)基并用0.01 mol/L PBS溶液清洗去除未結(jié)合染料，加入I mL胰酶，制成單細(xì)胞懸液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，分別在1、3、5、7天利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的增殖情況。
[0015]實(shí)施例2:
1)將由硫酸水解制備的毛竹納米微晶纖維素配制成濃度0.04 wt%溶液，進(jìn)行高壓滅菌處理，得到經(jīng)預(yù)處理的毛竹納米微晶纖維素溶液；
2)在無菌環(huán)境下，將MG63細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中按傳代培養(yǎng)方法消化成單細(xì)胞懸濁液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以5X IO3個(gè)/孔向96孔板中加入MG63細(xì)胞，同時(shí)量取步驟I)中得到的經(jīng)預(yù)處理的毛竹納米微晶纖維素溶液分別加入96孔板，保證每孔溶液總量200 μ L，獲得毛竹納米微晶纖維素-MG63細(xì)胞混合培養(yǎng)液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；
3)分別在1、3、5、7天吸取96孔板中的毛竹納米微晶纖維素-MG63細(xì)胞混合培養(yǎng)液，用0.03 mol/L PBS溶液清洗數(shù)次，按照1:50質(zhì)量比加入CCK-8試劑和DMEM培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，吸取100 μ L上清液加入96孔板中，在450 nm波長采用酶標(biāo)儀檢測其OD值(b)；
4)同時(shí)將步驟2)中得到的毛竹納米微晶纖維素-MG63細(xì)胞混合培養(yǎng)液與含有DiO染料的DMEM培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min，Dio染料與DMEM培養(yǎng)基質(zhì)量比為1:300，吸出DMEM培養(yǎng)基并用0.03 mol/L PBS溶液清洗去除未結(jié)合染料，加入I mL胰酶，制成單細(xì)胞懸液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，分別在1、3、5、7天利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的增殖情況。
[0016]實(shí)施例3:
1)將由纖維素酶水解制備的毛竹納米微晶纖維素配制成濃度0.04 wt%溶液，進(jìn)行高壓滅菌處理，得到經(jīng)預(yù)處理的毛竹納米微晶纖維素溶液；
2)在無菌環(huán)境下，將MG63細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中按傳代培養(yǎng)方法消化成單細(xì)胞懸濁液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以5X IO3個(gè)/孔向96孔板中加入MG63細(xì)胞，同時(shí)量取步驟I)中得到的經(jīng)預(yù)處理的毛竹納米微晶纖維素溶液分別加入96孔板，保證每孔溶液總量200 μ L，獲得毛竹納米微晶纖維素-MG63細(xì)胞混合培養(yǎng)液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；
3)分別在1、3、5、7天吸取96孔板中的毛竹納米微晶纖維素-MG63細(xì)胞混合培養(yǎng)液，用0.05 mol/L PBS溶液清洗數(shù)次，按照1:10質(zhì)量比加入CCK-8試劑和DMEM培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，吸取100 μ L上清液加入96孔板中，在450 nm波長采用酶標(biāo)儀檢測其OD值(c)；
4)同時(shí)將步驟2)中得到的毛竹納米微晶纖維素-MG63細(xì)胞混合培養(yǎng)液與含有DiO染料的DMEM培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 min, Dio染料與DMEM培養(yǎng)基質(zhì)量比為1:200，吸出DMEM培養(yǎng)基并用0.05 mol/L PBS溶液清洗去除未結(jié)合染料，加入I mL胰酶，制成單細(xì)胞懸液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，分別在1、3、5、7天利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的增殖情況。
[0017]測定實(shí)施例1、2、3得到的毛竹納米微晶纖維素OD值。表1為由實(shí)施例1、2、3檢測的毛竹納米微晶纖維素生物相容性表征結(jié)果。由表1中數(shù)據(jù)可知，采用本發(fā)明所述的檢測方法獲得的毛竹納米微晶纖維素OD值(a)、(b)、(c)分布在0.42、.80之間，說明不同水解工藝制備的毛竹納米微晶纖維素對MG-63與L929細(xì)胞增殖均有促進(jìn)作用，其中由纖維素酶水解制備的毛竹納米微晶纖維素促進(jìn)細(xì)胞增殖效果更為明顯，具備更好的生物相容性。
[0018]如圖1、2、3、4所示，從實(shí)施例1檢測獲得的毛竹納米微晶纖維素?zé)晒怙@微鏡照片可看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(f 7天)，與毛竹納米微晶纖維素共同培養(yǎng)的L929細(xì)胞數(shù)量不斷增加并最終保持穩(wěn)定，說明由纖維素酶水解制備的毛竹納米微晶纖維素對L929細(xì)胞的增殖具有明顯的促進(jìn)作用，因此具備良好的生物相容性。
[0019]表1
【權(quán)利要求】
1.一種檢測毛竹納米微晶纖維素生物相容性的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將毛竹納米微晶纖維素配制成濃度0.04 wt%溶液，進(jìn)行高壓滅菌處理，得到經(jīng)預(yù)處理的毛竹納米微晶纖維素溶液； 2)在無菌環(huán)境下，將檢測細(xì)胞在培養(yǎng)基中按傳代培養(yǎng)方法消化成單細(xì)胞懸濁液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以5X IO3個(gè)/孔向96孔板中加入檢測細(xì)胞，同時(shí)量取步驟I)中得到的經(jīng)預(yù)處理的毛竹納米微晶纖維素溶液分別加入96孔板，保證每孔溶液總量200 μ L，獲得毛竹納米微晶纖維素-檢測細(xì)胞混合培養(yǎng)液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)； 3)分別在1、3、5、7天吸取96孔板中的毛竹納米微晶纖維素-檢測細(xì)胞混合培養(yǎng)液，用磷酸緩沖溶液(Phosphate buffer solution, PBS)清洗數(shù)次,加入細(xì)胞增殖與活性檢測試劑(Cell Counting Kit, CCK-8)和培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-6 h，吸取100 μ L上清液加入96孔板中，在450 nm波長采用酶標(biāo)儀檢測其光密度值(Optical density, OD)； 4)同時(shí)將步驟2)中得到的毛竹納米微晶纖維素-檢測細(xì)胞混合培養(yǎng)液與含有細(xì)胞膜綠色熒光探針染料(DiO)的培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1(T20 min，吸出培養(yǎng)基并用PBS溶液清洗去除未結(jié)合染料，加入I mL胰酶，制成單細(xì)胞懸液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，分別在1、3、5、7天利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的增殖情況。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測毛竹納米微晶纖維素生物相容性的方法，其特征在于:所述的毛竹納米微晶纖維素，是由硫酸水解或纖維素酶水解毛竹纖維制備得到的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測毛竹納米微晶纖維素生物相容性的方法，其特征在于:所述的PBS溶液濃度為0.01?0.05 mol/L ;CCK_8試劑與培養(yǎng)基質(zhì)量比為1:10?50 ；Dio染料與培養(yǎng)基質(zhì)量比為1:100?300。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測毛竹納米微晶纖維素生物相容性的方法，其特征在于:所述的檢測細(xì)胞為小鼠成纖維細(xì)胞(L929)和人骨肉瘤細(xì)胞(MG63)中的一種，其中L929細(xì)胞采用MEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，MG63細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
【文檔編號】G01N21/17GK103776771SQ201410022117
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月20日
【發(fā)明者】馬蘭, 張勇, 姚菊明, 劉虹奕, 徐雅琴 申請人:浙江理工大學(xué)