一種中華鱉脂肪酸分析方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及水生生物、分析化學領域，具體說的是一種通過（氣相色譜串聯(lián)質譜）GC-MS結合保留指數(shù)分離鑒定中華鱉體內脂肪酸的組成的方法。分離中華鱉脂肪組織，并對其中脂肪酸提取、衍生制備成脂肪酸甲酯。其分離鑒定方法為：將中華鱉脂肪酸甲酯溶與正己烷中，用GC-MS分析，達到分離的目的，根據(jù)不同脂肪酸甲酯的保留時間計算其保留指數(shù)，質譜庫搜庫同時結合保留指數(shù)定性，面積歸一化法計算各脂肪酸甲酯的相對含量，達到準確、快速分析中華鱉脂肪酸組成的目的。本發(fā)明的特點：充分利用質譜庫搜庫結合保留指數(shù)定性的方法，可準確的鑒定中華鱉體內脂肪酸的組成，尤其是操作簡便，結果比質譜庫搜庫的方法更準確。
【專利說明】一種中華鱉脂肪酸分析方法
[0001]【技術領域】:本分明屬于分析化學領域，特別涉及采用氣相色譜質譜結合保留指數(shù)法進行中華鱉脂肪酸分析的方法。
[0002]【背景技術】:
中華鱉隸屬爬行綱、龜鱉目、鱉科、鱉屬，廣泛分布于我國除新疆、西藏，青海以外的其他省份，為我國名貴的水生爬行動物。中華鱉肉質細嫩、營養(yǎng)豐富、高蛋白，備受國內外消費者的青睞。中華鱉除了營養(yǎng)美味外，還具有較高的藥用價值。據(jù)《名醫(yī)別錄》記載，鱉性味甘，平，有滋陰補腎，清退虛熱的功效，鱉甲、鱉血更具有治療陰虛以及補血的藥用功效，為食療佳品。中華鱉脂肪中富含EPA、DHA等不飽和脂肪酸，具有抗癌、促進生長發(fā)育、增強記憶力等功效，臨床上已被用于治療高血壓、糖尿病等疾病。白晶等采用超臨界C02萃取技術，利用低溫濃縮工藝從中華鱉油中提取到DHA和EPA，得到中華鱉油中EPA+DHA的含量為26.39%0L1-Hsun Chang等用超臨界C02法從中華鱉脂肪酸中提取不飽和脂肪酸，Chen-HueiHuang等發(fā)現(xiàn)中華鱉自身可以合成18個碳以下的脂肪酸，但是不能合成高不飽和度的脂肪酸，同時發(fā)現(xiàn)中華鱉體內不飽和脂肪酸占總脂肪酸的70%以上。通過分析中華鱉脂肪中脂肪酸的組成尤其是不飽和脂肪酸的組成，為中華鱉脂肪的合理利用提供依據(jù)。
[0003]氣相色譜質譜(GC-MS)結合質譜譜庫檢索方法是將組分的質譜峰與質譜數(shù)據(jù)庫圖譜進行匹配比對，以匹配度高的化合物作為鑒定結果，已被廣泛應用于動植物脂肪酸的分析。由于脂肪酸種類較多，從結構上分類主要有直鏈脂肪酸、支鏈脂肪酸和復雜形勢的脂肪酸三種類型，脂肪酸的鏈長、雙鍵位置和數(shù)量以及取代基團不同均會導致分離的不準確，尤其是長鏈脂肪酸結構比較復雜經(jīng)常會有同分異構體存在，以及受分離度和色譜條件變化等因素的影響，會使脂肪酸的質譜圖檢索結果出現(xiàn)偏差，使得難以準確定性，甚至出現(xiàn)錯誤。為提高鑒定的準確性，采用保留指數(shù)和質譜檢索相結合的改良方法可顯著越來越多地應用于定性定量分析中。采用液-液萃取法從中華鱉脂肪中提取脂肪酸并進行甲酯化衍生，然后通過氣相色譜質譜(GC-MS)譜庫檢索結合保留指數(shù)，對中華鱉的脂肪酸進行定性定量分析，以鑒別中華鱉脂肪中的脂肪酸組成。
[0004]
【發(fā)明內容】
:
本發(fā)明氣相色譜質譜結合保留指數(shù)分析方法分析中華鱉脂肪，得到了其精確地脂肪酸總離子流色譜圖、相應的質譜圖和保留指數(shù)。通過比較脂肪酸甲酯的質譜譜庫結構和相應的保留指數(shù)，可以對中華鱉脂肪酸進行定性分析。
[0005]本發(fā)明的方法包括以下步驟:一種中華鱉脂肪酸分析方法，包括以下步驟:
(1)中華鱉宰殺后取脂肪組織10g，-18 °C保存；
(2)稱取甲魚脂肪Ig，碾碎后放入10 mL玻璃試管中，加入10 mL提取液，混勻后密封浸提24 h;提取完成后，用不含脂肪的濾紙過濾，再加入5 mL提取液沖洗殘渣，2次濾液合并保存；所述提取液為體積比為2:1的氯仿:甲醇；
(3)取脂肪提取液5mL，加入3 mL 10% KOH甲醇溶液，混勻后，置于80 1:水浴反應Ih;室溫冷卻后，加入3 mL 14% BF3甲醇溶液(v/v)混勻后，于50 1:水浴反應10 min ;冷卻后，加入3 mL正己烷，震蕩渦旋，室溫靜置過夜；取上層正己烷層至進樣小瓶，-18 °C冷凍，待GC-MS分析； (4)將進樣瓶中的脂肪酸甲酯進行氣相色譜質譜分析，色譜條件:色譜柱為安捷倫DB-5MS石英毛細管柱30.0 mX0.25 mmX0.25 μ m ;載氣為高純氦氣；流速I mL/min ;程序升溫:60 °C保持I min,以10 V /min升至160 °C并保持4 min,以5°C /min升至260 V并保持5min,以5 °C/min升至280 °C并保持I min ;分流比20:1 ;進樣量I μ L ;質譜條件=EI離子源；電子能量70 eV ;離子源溫度220 V ;進樣口溫度240°C，質量掃描范圍:m/z 40~600 ;溶劑切除時間2.5 min。
[0006]在進行氣相色譜質譜分析之后，還包括對分析的脂肪酸甲酯計算保留指數(shù)進行計算的步驟:
(1)將正構烷烴混合標準品(C8-C40)以脂肪酸甲酯分析的條件進行氣相色譜質譜分
析；
(2)記錄每個正構烷烴標準品的保留時間；采用保留指數(shù)的線性升溫公式:i?/ = 100?+100^^計算各組分的RI值，其中^,、、和t(n+1)分別為被分析組分和碳原
in In
子數(shù)處于η和η+1之間的正構烷烴混標標準品的流出峰保留時間(min)；
(3)根據(jù)http://webbook.nist.gov/chemistry/搜索文獻得相應色譜柱各脂肪酸甲酯的保留指數(shù)RI，結合質譜庫檢索，同時運用面積歸一化法計算各脂肪酸的相對百分含量。
[0007]本發(fā)明的方法不僅可以打破常規(guī)的氣相色譜質譜定性的局限，減少因為質譜庫不全或相似度接近對中華鱉脂肪酸分析帶來的誤差，同時為其他生物的脂肪酸分析鑒定提供方便、準確的定性方法，而且還能夠應用該方法鑒定其他氣相色譜質譜難以準確定性的物質。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1中華鱉脂肪酸甲酯總離子流圖 【具體實施方式】:
以下提供本發(fā)明一種中華鱉脂肪酸分析方法的【具體實施方式】。
[0009]實施例1
采用本發(fā)明方法分析了鄱陽湖中華鱉脂肪酸的組成，隨機抽取健康鄱陽湖中華鱉一只，體重約500g，宰殺后取其四肢周圍脂肪組織冷凍備用。
[0010]脂肪提取:稱取中華鱉脂肪I g，碾碎后放入10 mL玻璃試管中，加入10 mL提取液(氯仿:甲醇=2:1，v/v)，混勻后密封浸提24 h。提取完成后，用不含脂肪的濾紙過濾，再加入5 mL提取液沖洗殘渣，2次濾液合并保存。
[0011]脂肪酸甲酯化:取上述脂肪提取液5 mL，加入3 mL 10% KOH甲醇溶液(v/v)，混勻后,置于80 °(:水浴反應I h。室溫冷卻后,加入3 mL 14% BF3甲醇溶液(v/v),混勻后，于50 1:水浴反應10 min。冷卻后，加入3 mL正己烷，震蕩渦旋，室溫靜置過夜。取上層正己烷層至進樣小瓶，-18 °C冷凍，GC-MS分析。
[0012]氣相色譜質譜儀器條件如下:GC/MS為QP2010型，是島津公司的產(chǎn)品
色譜條件:色譜柱為安捷倫DB-5MS石英毛細管柱(30.0 mX0.25 mmX0.25 μ m);載氣為高純氦氣；流速I mL/min ;程序升溫:60 °C保持I min,以10 V /min升至160。(!'并保持4 min,以5°C /min升至260 °C并保持5min,以5 °C /min升至280 °C并保持I min ；分流比20:1;進樣量I yL。
[0013]質譜條件:EI離子源；電子能量70 eV;離子源溫度220 °C;進樣口溫度240°C，質量掃描范圍:m/z 40~600 ;溶劑切除時間2.5 min。
[0014]采用保留指數(shù)的線性升溫公式:
【權利要求】
1.一種中華鱉脂肪酸分析方法，包括以下步驟: (1)中華鱉宰殺后取脂肪組織10g，-18 °C保存； (2)稱取甲魚脂肪Ig，碾碎后放入10 mL玻璃試管中，加入10 mL提取液，混勻后密封浸提24 h ; 提取完成后，用不含脂肪的濾紙過濾，再加入5 mL提取液沖洗殘渣，2次濾液合并保存；所述提取液為體積比為2:1的氯仿:甲醇； (3)取脂肪提取液5mL，加入3 mL 10% KOH甲醇溶液，混勻后，置于80 1:水浴反應Ih;室溫冷卻后，加入3 mL 14% BF3甲醇溶液(v/v)混勻后，于50 1:水浴反應10 min ;冷卻后，加入3 mL正己烷，震蕩渦旋，室溫靜置過夜；取上層正己烷層至進樣小瓶，-18 °C冷凍，待GC-MS分析； (4)將進樣瓶中的脂肪酸甲酯進行氣相色譜質譜分析，色譜條件:色譜柱為安捷倫DB-5MS石英毛細管柱30.0 mX0.25 mmX0.25 μ m ;載氣為高純氦氣；流速I mL/min ;程序升溫:60 °C保持I min,以10 V /min升至160 °C并保持4 min,以5°C /min升至260 V并保持5min,以5 °C/min升至280 °C并保持I min ;分流比20:1 ;進樣量I μ L ;質譜條件=EI離子源；電子能量70 eV ;離子源溫度220 V ;進樣口溫度240°C，質量掃描范圍:m/z 40~600 ;溶劑切除時間2.5 min。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于:在進行氣相色譜質譜分析之后，還包括對分析的脂肪酸甲酯計算保留指數(shù)進行計算的步驟: (1)將正構烷烴混合標準品C8-C40以脂肪酸甲酯分析的條件進行氣相色譜質譜分析； (2)記錄每個正構烷烴標準品的保留時間；采用保留指數(shù)的線性升溫公式:i?/ = 10Cte+100^^計算各組分的RI值，其中:tx、tjP t(n+1)分別為被分析組分和碳原子數(shù)處于η和η+1之間的正構烷烴混標標準品的流出峰保留時間(min)； (3)根據(jù)http://webbook.nist.gov/chemistry/搜索文獻得相應色譜柱各脂肪酸甲酯的保留指數(shù)RI，結合質譜庫檢索，同時運用面積歸一化法計算各脂肪酸的相對百分含量。
【文檔編號】G01N30/06GK103675136SQ201310668383
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權日:2013年12月11日
【發(fā)明者】焦豐龍, 洪一江, 魏遠隆, 王軍花, 盛軍慶, 王誠遠, 侯喜洋 申請人:南昌大學