磁場調(diào)控的超分辨熒光成像方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種磁場調(diào)控的超分辨熒光成像方法，涉及光學顯微鏡成像測量方法【技術領域】，克服了現(xiàn)有的應用于超分辨成像方法的熒光探針轉(zhuǎn)換次數(shù)和發(fā)射光子數(shù)少的問題。外加磁場影響探針發(fā)光的超分辨熒光成像方法，在標記了熒光探針的待測樣品附近施加一個外磁場，同時進行超分辨成像的數(shù)據(jù)采集；利用軟件對采集到的數(shù)據(jù)進行分析。本發(fā)明的磁場調(diào)控的超分辨熒光成像方法增大了染料等熒光探針的發(fā)射光子數(shù)，提高了超分辨成像分辨率，并且使超分辨成像方法進一步發(fā)展。
【專利說明】磁場調(diào)控的超分辨熒光成像方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及光學顯微鏡成像測量方法【技術領域】，具體涉及一種外加磁場條件下，磁場調(diào)控的超分辨熒光成像方法。
【背景技術】
[0002]超分辨熒光顯微技術的發(fā)明突破了衍射極限，使得分辨率可以達到幾十納米，因而可以很好地在單分子水平上觀測和研究生物學過程。(G.Patterson, M.Davidson, S.Manley,and J.L.Schwartz,Superresolution Imaging using Single-MoleculeLocalization, Annual Review of Physical Chemistry，2010(61):345 - 367)。
[0003]現(xiàn)有技術中基于單分子定位的超分辨成像方法，如隨機光學重建顯微鏡(ST0RM)、光激活定位顯微鏡(PALM)等，以其卓越的分辨能力、相對簡單的裝置等優(yōu)越性在生物研究中發(fā)揮著越來越重要的作用。STORM和PALM的超分辨成像方法具有如下的步驟:首先用能夠在熒光態(tài)/暗態(tài)轉(zhuǎn)換的熒光染料或熒光蛋白標記樣品，在任一時刻，成像過程中，大多數(shù)樣品中的熒光探針保持在暗態(tài)，只有隨機的一小部分轉(zhuǎn)換為熒光態(tài)；之后發(fā)光的熒光探針被光轉(zhuǎn)換或光漂白為暗態(tài)；隨后另一小部分突光探針被隨機轉(zhuǎn)換為突光態(tài)；如此往復，使得被標記的分子單獨成像；最后將所有的成像累積，最終重構(gòu)成超分辨成像。
[0004]上述的STORM和PALM超分辨成像方法的分辨率與熒光探針的光化學/物理性質(zhì)(如轉(zhuǎn)換循環(huán)次數(shù)、每次轉(zhuǎn)換發(fā)射的光子數(shù)、對比度等)關系密切。理想的熒光探針應該具有每次轉(zhuǎn)換能夠發(fā)出大量的光子數(shù)，熒光態(tài)/暗態(tài)的對比度很高等性質(zhì)。但目前廣泛應用于STORM等超分辨成像方法的熒光探針(如花菁類染料等)循環(huán)轉(zhuǎn)換次數(shù)和每次轉(zhuǎn)換發(fā)出的光子數(shù)有限，因而限制了成像分辨率，進而限制了超分辨成像方法的進一步發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服現(xiàn)有的應用于超分辨成像方法的熒光探針轉(zhuǎn)換次數(shù)和發(fā)射光子數(shù)少的問題，本發(fā)明提供一種通過外加磁場調(diào)控熒光探針發(fā)光的，磁場調(diào)控的超分辨熒光成像方法。
[0006]本發(fā)明為解決技術問題所采用的技術方案如下:
[0007]—種磁場調(diào)控的超分辨熒光成像方法，該方法具有如下步驟:
[0008]步驟一、用熒光探針標記待測樣品，將它們鋪在載玻片上，加入成像緩沖液，蓋上蓋玻片并封片；
[0009]步驟二、在待測樣品附近施加一個外磁場，控制外磁場的大小和方向；
[0010]步驟三、對修飾了熒光探針的待測樣品進行超分辨成像的數(shù)據(jù)采集；
[0011]步驟四、將采集到的數(shù)據(jù)進行分析。
[0012]在上述技術方案中，所述熒光探針為:有機小分子熒光染料或熒光蛋白。
[0013]在上述技術方案中，所述有機小分子熒光染料為:花菁類或羅丹明類或嗪類。
[0014]在上述技術方案中，所述有機小分子熒光染料為:Cy3、Cy5、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 532 或 ATTO 655。
[0015]在上述技術方案中，熒光蛋白為:mE0S2或GFP。
[0016]在上述技術方案中，成像緩沖液含有巰基乙醇、過氧化氫酶和葡萄糖氧化酶。
[0017]在上述技術方案中，待測樣品為:蛋白、DNA或活細胞。
[0018]在上述技術方案中，步驟二中的外磁場由通電線圈產(chǎn)生，或由磁鐵產(chǎn)生。
[0019]在上述技術方案中，所述步驟三具體包括:
[0020]利用激光系統(tǒng)產(chǎn)生的激光照射熒光探針，使其由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，發(fā)出熒光；熒光染料閃爍產(chǎn)生的信號由CCD采集并傳送到電腦。
[0021]在上述技術方案中，所述步驟二中的外磁場為小于0.1T。
[0022]本發(fā)明的有益效果是:通過在樣品周圍施加外磁場，可以對染料等熒光探針的轉(zhuǎn)換次數(shù)、每次轉(zhuǎn)換的發(fā)射光子數(shù)等光物理性質(zhì)進行調(diào)變，進而影響超分辨重構(gòu)圖上定位點的數(shù)目。當施加一個很小的外磁場時(磁場強度小于0.1T)，超分辨重構(gòu)圖上定位點的數(shù)目明顯增多。這能夠提高超分辨成像的分辨率，使超分辨成像方法的進一步發(fā)展。
[0023]本發(fā)明的磁場調(diào)控的超分辨熒光成像方法能用于改善熒光染料/熒光蛋白標記的蛋白、DNA及活細胞等的超分辨成像分辨率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為現(xiàn)有技術的STORM成像原理圖。
[0025]圖2為本發(fā)明的磁場調(diào)控的超分辨熒光成像方法的裝置示意圖。
[0026]圖3為Alexa Fluor 647的分子結(jié)構(gòu)圖。
[0027]圖4為Alexa Fluor 532的分子結(jié)構(gòu)圖。
[0028]圖5為120G(12mT)，右手定則向上的外加磁場下的STORM超分辨成像圖(單分散的Alexa Fluor 647的超分辨成像重構(gòu)圖)。
[0029]圖6為與圖5對應的定位點個數(shù)分布的柱狀圖。
[0030]圖7為與圖5對應的相同條件下，沒有磁場時的STORM超分辨成像圖(單分散的Alexa Fluor 647的超分辨成像重構(gòu)圖)。
[0031]圖8為與圖7對應的定位點個數(shù)分布的柱狀圖。
[0032]圖9為900G (90mT)，右手定則向上的外加磁場下的STORM超分辨成像圖(單分散的Alexa Fluor 647的超分辨成像重構(gòu)圖)。
[0033]圖10為與圖9對應的定位點個數(shù)分布的柱狀圖。
[0034]圖11為與圖9對應的相同條件下，沒有磁場時的STORM超分辨成像圖(單分散的Alexa Fluor 647的超分辨成像重構(gòu)圖)。
[0035]圖12為與圖11對應的定位點個數(shù)分布的柱狀圖。
[0036]圖13為IOOG(IOmT)，右手定則向上的外加磁場下的STORM超分辨成像圖(單分散的Alexa Fluor 532的超分辨成像重構(gòu)圖)。
[0037]圖14為與圖13對應的定位點個數(shù)分布的柱狀圖。
[0038]圖15為與圖13對應的相同條件下，沒有磁場時的STORM超分辨成像圖(單分散的Alexa Fluor 532的超分辨成像重構(gòu)圖)。
[0039]圖16為與圖15對應的定位點個數(shù)分布的柱狀圖。【具體實施方式】
[0040]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0041]如圖2所示，磁場調(diào)控的超分辨熒光成像方法，該方法具有如下步驟:
[0042]步驟一、首先，用熒光探針(如熒光染料或熒光蛋白)標記待測樣品，將它們鋪在載玻片上，加入成像緩沖液，蓋上蓋玻片并封片；
[0043]步驟二、在待測樣品附近施加一個外磁場，例如可以纏若干圈線圈，線圈兩端分別連接直流電源的正極和負極，接通直流電源，這時在樣品周圍就存在一個外磁場。通過改變線圈的匝數(shù)或電流的大小控制外磁場的大小，通過改變線圈纏繞方式控制外磁場的方向；
[0044]步驟三、設置實驗參數(shù)，對修飾了熒光探針的待測樣品進行超分辨成像的數(shù)據(jù)采集;
[0045]步驟四、將采集到的數(shù)據(jù)利用相關軟件進行分析。
[0046]上述的步驟一中，成像緩沖液主要含有巰基乙醇、過氧化氫酶和葡萄糖氧化酶，它們的作用分別是延長熒光染料處于熒光態(tài)的時間和除去體系中的氧氣。
[0047]上述的步驟一中，待測物質(zhì)包括蛋白、DNA或細胞等可用超分辨熒光顯微鏡檢測的單分子，熒光探針包括可用于超分辨熒光顯微鏡的有機小分子染料以及熒光蛋白等，如Cy3、Cy5、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 532和 GFP 等。Alexa Fluor 647和Alexa Fluor532的分子結(jié)構(gòu)圖如圖3和4所示。
[0048]上述的步驟二中，外磁場既可以由纏繞在樣品附近的導電線圈產(chǎn)生，也可以由樣品附近的永磁鐵產(chǎn)生。
[0049]上述的步驟三中，超分辨成像系統(tǒng)主要由激光、顯微鏡、CXD等組成，激光照射熒光探針，使其由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，發(fā)出熒光。熒光染料閃爍產(chǎn)生的信號由CCD采集并傳送到電腦。
[0050]上述的步驟四中，相關軟件分析指的是利用軟件分析方法獲得超分辨成像重構(gòu)圖，比較重構(gòu)圖上定位點的多少，確定成像分辨率。
[0051]本發(fā)明的磁場調(diào)控的超分辨熒光成像方法對于熒光探針標記的各類單分子物質(zhì)、各波長的激光均可適用。
[0052]實施例1120G(12mT)，右手定則向上的外磁場條件下單分散的Alexa Fluor647在玻片上的分布情況研究。
[0053]將樣片固定在載物臺上，打開激光使其照射到樣品上，調(diào)好焦距、曝光時間和照相張數(shù)。選定一個區(qū)域，進行圖像采集。將采集到的數(shù)據(jù)利用相關軟件進行分析。
[0054]如圖5-8所示，實驗結(jié)果表明本發(fā)明的優(yōu)點是:(1)相同條件下，施加120G外磁場后，染料Alexa Fluor 647閃爍增多，從而使得到的超分辨重構(gòu)圖上定位點更多。(2)能夠提高超分辨成像的分辨率，使超分辨成像方法進一步發(fā)展。
[0055]實施例2900G(90mT),右手定則向上的外磁場條件下單分散的Alexa Fluor 647在玻片上的分布情況研究。
[0056]將樣片固定在載物臺上，打開激光使其照射到樣品上，調(diào)好焦距、曝光時間和照相張數(shù)。選定一個區(qū)域，進行圖像采集。將采集到的數(shù)據(jù)利用相關軟件進行分析。
[0057]如圖9-12所示，實驗結(jié)果表明本發(fā)明的優(yōu)點是:(I)相同條件下，施加900G外磁場后，染料Alexa Fluor 647閃爍增多，從而使得到的超分辨重構(gòu)圖上定位點更多。(2)能夠提高超分辨成像的分辨率，使超分辨成像方法進一步發(fā)展。
[0058]實施例3100G(10mT)，右手定則向上的外磁場條件下單分散的Alexa Fluor 532在玻片上的分布情況研究。
[0059]將樣片固定在載物臺上，打開激光使其照射到樣品上，調(diào)好焦距、曝光時間和照相張數(shù)。選定一個區(qū)域，進行圖像采集。將采集到的數(shù)據(jù)利用相關軟件進行分析。
[0060]如圖13-16所示，實驗結(jié)果表明本發(fā)明的優(yōu)點是:(1)相同條件下，施加100G外磁場后，染料Alexa Fluor 532閃爍增多，從而使得到的超分辨重構(gòu)圖上定位點更多。(2)能夠提高超分辨成像的分辨率，使超分辨成像方法進一步發(fā)展。
[0061]顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之中。
【權利要求】
1.一種磁場調(diào)控的超分辨熒光成像方法，其特征在于，該方法具有如下步驟: 步驟一、用熒光探針標記待測樣品，將它們鋪在載玻片上，加入成像緩沖液，蓋上蓋玻片并封片； 步驟二、在待測樣品附近施加一個外磁場，控制外磁場的大小和方向； 步驟三、對修飾了熒光探針的待測樣品進行超分辨成像的數(shù)據(jù)采集； 步驟四、將采集到的數(shù)據(jù)進行分析。
2.根據(jù)權利要求1所述的磁場調(diào)控的超分辨熒光成像方法，其特征在于，所述熒光探針為:有機小分子熒光染料或熒光蛋白。
3.根據(jù)權利要求2所述的磁場調(diào)控的超分辨熒光成像方法，其特征在于，所述有機小分子熒光染料為:花菁類或羅丹明類或嗪類。
4.根據(jù)權利要求3所述的磁場調(diào)控的超分辨熒光成像方法，其特征在于，所述有機小分子熒光染料為:Cy3、Cy5、Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 532 或 ATT0655。
5.根據(jù)權利要求2所述的磁場調(diào)控的超分辨熒光成像方法，其特征在于，熒光蛋白為:mE0S2 或 GFP。
6.根據(jù)權利要求1所述的磁場調(diào)控的超分辨熒光成像方法，其特征在于，成像緩沖液含有巰基乙醇、過氧化氫酶和葡萄糖氧化酶。
7.根據(jù)權利要求1所述的磁場調(diào)控的超分辨熒光成像方法，其特征在于，待測樣品為:蛋白、DNA或活細胞。
8.根據(jù)權利要求1至7中的任意一項所述的磁場調(diào)控的超分辨熒光成像方法，其特征在于，步驟二中的外磁場由通電線圈產(chǎn)生，或由磁鐵產(chǎn)生。
9.根據(jù)權利要求1至7中的任意一項所述的磁場調(diào)控的超分辨熒光成像方法，其特征在于，所述步驟三具體包括: 利用激光系統(tǒng)產(chǎn)生的激光照射熒光探針，使其由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，發(fā)出熒光；熒光染料閃爍產(chǎn)生的信號由CCD采集并傳送到電腦。
10.根據(jù)權利要求1至7中的任意一項所述的磁場調(diào)控的超分辨熒光成像方法，其特征在于，所述步驟二中的外磁場為小于0.1T。
【文檔編號】G01N21/64GK103575716SQ201310571202
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月15日 優(yōu)先權日:2013年11月15日
【發(fā)明者】王宏達, 張敏, 蔡明軍, 蔣俊光 申請人:中國科學院長春應用化學研究所