一種基于石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖修飾的免疫傳感器的制造方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種基于石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖修飾的免疫傳感器，其特征在于：石墨烯是良好的導(dǎo)電材料具有大的比表面積；多壁碳納米管具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，導(dǎo)電性和極高的機(jī)械強(qiáng)度，然而這兩種物質(zhì)溶解性都很差，需要尋找一種良好的分散劑；而殼聚糖具有良好的生物相容性與成膜性，可以增大多壁碳納米管在溶液里的溶解性；另外，納米金膠具有很強(qiáng)的導(dǎo)電能力，提高了電子的傳輸，進(jìn)一步增強(qiáng)了石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖納米復(fù)合物的導(dǎo)電性；另外，蛋白A可以定向固定毒死蜱抗體，可以吸附更多的毒死蜱農(nóng)藥，提高免疫傳感器的檢測(cè)限，靈敏度。因而該免疫傳感器具備檢測(cè)時(shí)間較短，靈敏度高，選擇性穩(wěn)定性好，回收率符合要求。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種基于石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖修飾的免疫傳感器
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供一種基于石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖修飾的免疫傳感器，屬于生物傳感器【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】 [0002]我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，農(nóng)藥在控制農(nóng)作物病蟲(chóng)害，保障農(nóng)產(chǎn)品穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)方面起到至關(guān)重要的作用，但是，農(nóng)藥的不合理使用，不僅造成了水環(huán)境、土壤、大氣的污染，也導(dǎo)致了農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留超標(biāo)，引起人體中毒以及貿(mào)易壁壘。此外，我國(guó)每年因農(nóng)藥殘留超標(biāo)造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。隨著我國(guó)人民生活水平不斷提高，農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全問(wèn)題越來(lái)越受到關(guān)注，尤其果品、蔬菜中農(nóng)藥殘留問(wèn)題已經(jīng)成為公眾關(guān)注的焦點(diǎn)。當(dāng)前，我國(guó)生產(chǎn)和使用的殺蟲(chóng)劑絕大多數(shù)品種為有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥，其中毒死蜱的生產(chǎn)使用逐漸增加，毒死蜱在人體中主要分布于肝臟、腎臟、脾臟等血流量較高的器官。它可以抑制膽堿酯酶活性，對(duì)人體有致畸作用，甚而對(duì)人體的中樞神經(jīng)產(chǎn)生影響。因此，建立一種快速、靈敏、安全可靠的毒死蜱農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法迫在眉睫。
[0003]傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留檢測(cè)主要有:光譜法(紅外光譜法、熒光光譜法、紫外-可見(jiàn)光、化學(xué)發(fā)光法等)、色譜法(氣相色譜(GC)、液相色譜(LC)、高效液相色譜(HPLC))、氣-質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)，液-質(zhì)聯(lián)用(^:-1^)、酶聯(lián)免疫化1^34)等。雖然這些方法的選擇性好、靈敏度高和準(zhǔn)確度高，同時(shí)檢測(cè)多種元素或化合物，但其需要昂貴的儀器設(shè)備，樣品的前處理過(guò)程繁瑣、費(fèi)時(shí)，并且對(duì)分析人員的技術(shù)水平要求很高，不適于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。因此，人們迫切需要快速、可靠、經(jīng)濟(jì)和適合于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用的快速檢測(cè)方法。于是，廉價(jià)、快速、可信、敏感的生物傳感器應(yīng)運(yùn)而生。與傳統(tǒng)的分析方法相比，生物傳感器具有如下特點(diǎn):(1)較高的選擇性，因此不需要對(duì)被測(cè)組分進(jìn)行分離，即不用對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。(2)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，體積小，使用方便，特別是便攜式的生物傳感器，非常有利于食品質(zhì)量的市場(chǎng)快速評(píng)價(jià)。(3)可實(shí)現(xiàn)連續(xù)在線(xiàn)檢測(cè)，使食品加工過(guò)程的質(zhì)量控制變得簡(jiǎn)便。(4)響應(yīng)速度快，樣品用量少，與其他大型分析儀器相比，生物傳感器制作成本低，且可反復(fù)使用。因此本文嘗試制備一種毒死蜱殘留的免疫傳感器。
[0004]發(fā)明的目的在于提供一種能克服上述缺陷以及操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好的檢測(cè)毒死蜱農(nóng)藥殘留的免疫傳感器的制備方法。
[0005]其技術(shù)方案為:一種基于石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖修飾的免疫傳感器，其特征在于:制備出一種新型的納米復(fù)合物石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖，利用蛋白A定向固定毒死蝶單克隆抗體，BSA封閉。
[0006]所述的一種基于石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖修飾的免疫傳感器，其特征在于:金電極(d=lmm)的清洗,免疫傳感器敏感界面的構(gòu)建及過(guò)程表征(制備納米復(fù)合物石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖，循環(huán)伏安圖以及阻抗圖譜)，免疫傳感器工作曲線(xiàn)的建立，免疫傳感器性能的檢測(cè)，免疫傳感器對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)。[0007]所述的一種基于石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖修飾的免疫傳感器，其特征在于:實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，主要包括免疫傳感器的修飾及表征過(guò)程，有關(guān)實(shí)驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化(納米復(fù)合物中硫堇的濃度、測(cè)試底液的pH、孵育時(shí)間等)；所制備出電流型免疫傳感器的工作曲線(xiàn)；免疫傳感器性能檢測(cè)包括重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、特異性、再生性以及免疫傳感器對(duì)蔬菜樣品加標(biāo)回收率的測(cè)定。所制備的免疫傳感器的工作曲線(xiàn)為:y=9.56761gC(ng/mL)+18.164 (R2=0.9976)，其檢測(cè)限為0.037ng/mL ;免疫傳感器性能檢測(cè)包括特異性、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、再生性以及免疫傳感器對(duì)多種果蔬樣品回收率的測(cè)定。
[0008]其制備原理為:免疫生物傳感器以免疫生物分子作為識(shí)別元件，通過(guò)固定化技術(shù)將免疫蛋白結(jié)合到感受器表面，發(fā)生免疫識(shí)別反應(yīng)后，生成的免疫復(fù)合物與產(chǎn)生的物理或化學(xué)信號(hào)相關(guān)聯(lián)，由換能器將其轉(zhuǎn)化為與待測(cè)物質(zhì)濃度(或活度)有關(guān)的可定量或者可處理的物理化學(xué)信號(hào)，再通過(guò)二次儀表放大并且輸出信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物質(zhì)的檢測(cè)。本發(fā)明利用石墨烯具有良好的導(dǎo)電性，可以提供大的比表面積為納米材料提高附著位置，提高固定量；功能化的多壁碳納米管，具有羧基(-C00H)，可以提供大的外部表面面積，且可以促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移；殼聚糖富含氨基(-NH2),是石墨烯及多壁碳納米管很好的分散劑，具有較高的成膜性及生物相容性；納米金膠的比表面積大、導(dǎo)電性良好，是傳感器修飾過(guò)程廣泛使用的材料，其可以通過(guò)Au-S、Au-N鍵與其他物質(zhì)結(jié)合。從而制備出石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖納米復(fù)合物；而作為蛋白A可以與與抗體的Fe端結(jié)合以便定向固定抗體。用牛血清蛋白(BSA)封閉抗體上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，即可制備得到一種新型的、便捷的免疫傳感器。
[0009]為達(dá)到以上目的，采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種基于石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖修飾的免疫傳感器，其特征在于:(I)電流型免疫傳感器制備前裸金電極的清洗、活化和性能測(cè)試，如果測(cè)試循環(huán)伏安曲線(xiàn)中的峰電位差在120mv以下，氧化峰和還原峰對(duì)稱(chēng)，則所述金電極可使用，否則要重新返回清洗步驟中，直到符合要求。(2)清洗好的金電極電沉積納米金后表面滴涂分散均勻的石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖納米復(fù)合物。
(3)再將蛋白A定向固定毒死蝶單克隆抗體的Fe端。(4)修飾上毒死蝶單克隆抗體后用牛血清白蛋白(BSA)封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。電流型免疫傳感器制備結(jié)束后，放入冰箱里4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0010]為達(dá)到以上目的，采取以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種基于石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖修飾的免疫傳感器，其特征在于:(I)配置一系列的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)液，進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，得到抑制率，進(jìn)一步得出上述制備的電流型免疫傳感器的工作曲線(xiàn)、檢測(cè)范圍和檢測(cè)限；(2)配置一系列經(jīng)常混合使用的農(nóng)藥溶液，以檢測(cè)所制備電流型免疫傳感器的選擇性；(3)通過(guò)在冰箱中放置一段時(shí)間再次測(cè)量，以驗(yàn)證上述免疫傳感器的穩(wěn)定性K4)通過(guò)甘氨酸-HCl緩沖液(pH2.8)解離毒死蜱農(nóng)藥，以免疫檢測(cè)其再生性能；(5)對(duì)實(shí)際果蔬樣品進(jìn)行分析得出該免疫傳感器的回收率。
[0011]本發(fā)明制備了新型納米材料石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖復(fù)合物，該納米復(fù)合物膜有良好的化學(xué)穩(wěn)定性，導(dǎo)電性和極高的機(jī)械強(qiáng)度，夠促進(jìn)電化學(xué)反應(yīng)中電子的傳遞，提高電極上的響應(yīng)電流，改善電極表面的微環(huán)境，因而可以作為載體材料。另外，蛋白A可以與抗體的Fe端結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)抗體的定向固定。該免疫傳感器檢測(cè)時(shí)間較短，靈敏度高，選擇性穩(wěn)定性好，再生能力強(qiáng)，回收率符合要求以及可以用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。[0012]所述免疫傳感器的制備工藝如下:⑴首先將金電極放入Piranha溶液(H2O2與濃H2SO4體積比1: 3)、硝酸(HNO3與H2O的體積比1:1)、無(wú)水乙醇、去離子水中分別超聲清洗5min清洗，于0.5MH2S04溶液中活化后用氮?dú)獯蹈?；⑵?.5 μ L石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖納米復(fù)合物修飾到清洗好的裸金電極修飾上，烘干；(3)修飾2 μ LlOO μ g/mL蛋白A，然后用PH=7.5的PBS緩沖液沖洗，氮?dú)獯蹈桑?4)修飾2.5 μ LlO μ g/mL毒死蜱抗體，4°C孵育12h ； (5)將上述制備好的電極最后浸入2.5%的BSA溶液中室溫下靜置Ih,以封閉電極上非特異性結(jié)合位點(diǎn)，室溫下晾干，免疫傳感器制作完成，保存在4°C條件下備用。
[0013]【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
圖1免疫傳感器制過(guò)程的組裝圖。
[0014]圖2納米復(fù)合物石墨烯-多壁碳-殼聚糖和石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖的掃描電鏡圖。
[0015]圖3免疫傳感器修飾過(guò)程的循環(huán)伏安圖。
[0016]圖4免疫傳感器的工作曲線(xiàn)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例:(1)金電極的清洗:金電極修飾前，首先浸入“piranha”溶液(H2O2與濃H2SO4體積比1: 3)中浸泡15min，用水清洗干凈，接下來(lái)用0.3ym、30nm的Al2O3漿在麂皮上拋光至鏡面，拋光后用去離子水洗去除表面污物，再移入超聲水浴中清洗，每次5min，重復(fù)二次，然后依次用6mol/L的HNO3、無(wú)水乙醇和去離子水超聲清洗，氮?dú)猸h(huán)境下干燥。(2)石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖納米復(fù)合物的制備:將0.5g殼聚糖溶于IOOmL 1.0%的醋酸溶液中，室溫下攪拌3h，配成0.5% CS溶液，室溫下磁力攪拌lh，使殼聚糖完全溶解；稱(chēng)取4.0mg石墨烯和4.0mg多壁碳納米管加入10.0mL上述得到的殼聚糖溶液中，在室溫下超聲分散，直至得到穩(wěn)定的黑色分散液(石墨烯-多壁碳-殼聚糖納米復(fù)合材料)；再將制備好的10.0mL的納米金膠加入已混合好的上述溶液中，再在室溫下超聲分散12h至完全溶解，最終得到了石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖納米復(fù)合物。(3)金電極的活化:徹底清洗后，電極在0.5mol/LH2S04溶液中用循環(huán)伏安法活化，掃描范圍1.0V?-1.0V,反復(fù)掃描直至達(dá)到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖為止。(4)將2.5 μ L石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖納米復(fù)合物修飾到清洗好的裸金電極修飾上，烘干；(5)修飾2 μ L μ g/mL蛋白A，然后用PH=7.5的PBS緩沖液沖洗，氮?dú)獯蹈桑?6)修飾2.5 μ L 10 μ g/mL毒死蜱抗體，4°C孵育12h ；
(7)將上述制備好的電極最后浸入2.5%的BSA溶液中室溫下靜置lh，以封閉電極上非特異性結(jié)合位點(diǎn)，室溫下晾干，免疫傳感器制作完成，保存在4°C條件下備用。(8)從殼聚糖-石墨烯與殼聚糖-多壁碳的濃度比例、測(cè)試底液pH、孵育時(shí)間三方面對(duì)所制備的免疫傳感器的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，殼聚糖-石墨烯與殼聚糖-多壁碳的濃度比例為1:3-3:1，pH的范圍為5.5-8.5，孵育時(shí)間的范圍為5-40min。(9)配置0.1-1.0X 105ng/mL的毒死蝶標(biāo)準(zhǔn)溶液，將上述制備好的免疫傳感器分別浸入不同濃度的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液，在常溫下孵育30min，檢測(cè)免疫反應(yīng)前后電流變化得到其工作曲線(xiàn)。(10)將免疫傳感器在久效磷、西維因、克百威、3_羥基克百威等干擾物存在的情況下對(duì)100ng/mL的毒死蜱進(jìn)行測(cè)試，以檢測(cè)其選擇性；選5根于相同條件下制備好的免疫傳感器檢測(cè)其重現(xiàn)性；連續(xù)7天依次檢測(cè)相同濃度的毒死蜱溶液以檢測(cè)其穩(wěn)定性；將免疫后的傳感器用甘氨酸-HCl緩沖液(pH2.8)解離毒死蜱農(nóng)藥5min后再次免疫，檢測(cè)其再生能力。(11)把蔬菜徹底清洗干凈并用去離子水清洗3次，噴灑上一定濃度的農(nóng)藥，放置24h后，用IOmL丙酮/0.1ΜρΗ7.5磷酸鹽緩沖溶液(1/9，v/v)做溶劑超聲處理20min，然后再離心IOmin(IOOOOrpm)，得到的上清液用來(lái)檢測(cè)實(shí)際樣品的回收率，其回收率可以達(dá)到87.4%-104.0%。
[0018]此種免疫傳感器檢測(cè)農(nóng)藥毒死蜱殘留的檢測(cè)方法操作工藝簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間較短，靈敏度高，選擇性好，穩(wěn)定性高，再生能力好和回收率符合要求，符合我國(guó)農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)發(fā)展和國(guó)際化要求。
【權(quán)利要求】
1.一種基于石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖修飾的免疫傳感器，其特征在于:制備了石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖納米復(fù)合材料，制備步驟為: 將0.5g殼聚糖溶于IOOmL 1.0%的醋酸溶液中，室溫下攪拌3h，配成0.5%CS溶液，室溫下磁力攪拌Ih,使殼聚糖完全溶解；稱(chēng)取4.0mg石墨烯和4.0mg多壁碳納米管加入10.0mL上述得到的殼聚糖溶液中，在室溫下超聲分散，直至得到穩(wěn)定的黑色分散液(石墨烯-多壁碳-殼聚糖納米復(fù)合材料)；再將制備好的10.0mL的納米金膠加入已混合好的上述溶液中，再在室溫下超聲分散12h至完全溶解，最終得到了石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖納米復(fù)合物。
2.如權(quán)利要求1所述的一種基于石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖修飾的免疫傳感器，其特征在于:制備了石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖納米復(fù)合材料修飾的免疫傳感器的制備，制備步驟為: 首先將金電極放入Piranha溶液(H2O2與濃H2SO4體積比I: 3)、硝酸(HNO3與H2O的體積比1:1)、無(wú)水乙醇、去離子水中分別超聲清洗5min清洗，于0.5MH2S04溶液中活化后用氮?dú)獯蹈桑?2)將2.5 μ L石墨烯-多壁碳-納米金膠-殼聚糖納米復(fù)合物修飾到清洗好的裸金電極修飾上，烘干；(3)修飾2 μ LlOO μ g/mL蛋白A，然后用PH=7.5的PBS緩沖液沖洗，氮?dú)獯蹈桑?4)修飾2.5 μ LlO μ g/mL毒死蜱抗體，4°C孵育12h ; (5)將上述制備好的電極最后浸入2.5%的BSA溶液中室溫下靜置lh，以封閉電極上非特異性結(jié)合位點(diǎn)，室溫下晾干，免疫傳感器制作完成，保存在4 C條件下備用。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103592437SQ201310556254
【公開(kāi)日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月11日
【發(fā)明者】孫霞, 郭業(yè)民, 王相友, 劉君峰, 曹瑤瑤 申請(qǐng)人:山東理工大學(xué)