睡蓮花的鑒別和含量測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了睡蓮花的一種鑒別和含量測定方法，包括睡蓮花中沒食子酸和煙花苷的薄層鑒別方法和含量測定方法。步驟一、采用薄層色譜法對睡蓮花中的沒食子酸和煙花苷進行定性分析；步驟二、采用高效液相色譜法對睡蓮花中沒食子酸和煙花苷進行含量測定。本發(fā)明對睡蓮花提出了質量控制，具有較強的專屬性和良好的重現(xiàn)性，真正體現(xiàn)了藥品的安全有效性和質量可控性。
【專利說明】睡蓮花的鑒別和含量測定方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及睡蓮花的一種鑒別和含量測定方法，屬于分析化學領域。
【背景技術】
[0002]睡蓮花為睡蓮科雪白睡蓮{Nymphaea candidaPresl.)的干燥花蕾，分布于我國新疆的南部地區(qū)，收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準.維吾爾藥分冊》(1999年版)，具有降熱止咳、益心護腦，安神止痛的作用，臨床主要用于感冒發(fā)熱，頭痛咳嗽，咽痛解表等癥。在維吾爾醫(yī)藥中用藥歷史長久，是維吾爾醫(yī)常用的單方或復方抗病毒藥中的主要成分。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有的缺陷，提供了快速、準確的睡蓮花的鑒別和含量測方法。
[0004]本發(fā)明的目的通過以下技術方案具體實現(xiàn):
睡蓮花的一種鑒別和含量測定方法，包括睡蓮花中沒食子酸和煙花苷的薄層鑒別方法和含量測定方法，具體步驟如下:
步驟一、采用薄層色譜法對睡蓮花中的沒食子酸和煙花苷進行定性分析在硅膠GF254薄層板上，分別點沒食子酸-甲醇溶液、睡蓮花藥材-甲醇溶液，在聚酰胺薄膜上，點煙花苷-甲醇溶液、睡蓮花藥材-甲醇溶液，以乙酸乙酯-甲酸-水按體積比為8:1:1為展開劑展開，取出，晾干，置于熒光燈下檢視；
步驟二、采用高效液相色譜法對睡蓮花中沒食子酸和煙花苷進行含量測定
1)對照品的制備
a.精密稱取對照品沒食子酸和煙花苷，加甲醇制成沒食子酸和煙花苷的對照品儲備液，濃度分別為 0.650mg/ml、0.531mg/ml ；
b.分別吸取沒食子酸和煙花苷對照品儲備液lml、2.5ml，加甲醇稀釋，得到含煙花苷和沒食子酸的混合對照品溶液，所含煙花苷的濃度為0.1328mg/ml、所含沒食子酸的濃度為
0.0650mg/ml ；
2)供試品的制備
精密稱取Ig睡蓮花藥材粉末，置于50ml具塞錐形瓶中，加入50ml甲醇，稱重，超聲提取30min，放冷后，稱量質量并用甲醇補足質量差，過濾，置于樣品瓶中，作為供試品溶液；
3)含量測定
測定睡蓮花中沒食子酸和煙花苷的含量時，采用沒食子酸及煙花苷標準品做對照品，繪制進樣量一色譜峰面積的標準曲線，測定睡蓮花的色譜峰面積，從標準曲線上讀出睡蓮花中沒食子酸及煙花苷的含量，其中，液相色譜測定峰面積的色譜條件為:色譜柱的直徑和長度為4.6mmX 250mm, 5Mm的Wondasil? C18，檢測波長為270nm，流動相為甲醇和0.1%冰乙酸混合水溶液，柱溫為30°C，流速為lmL/min，進樣量為5μ1，采樣時間為50min，采用梯度洗脫。[0005]優(yōu)選的，所述步驟二的步驟2)中，所述過濾采用0.45ΜΠ1微孔膜過濾。
[0006]進一步的，所述步驟二的步驟3)中，所述梯度洗脫具體為:流動相中0.1%冰乙酸的體積百分數(shù)隨時間變化為0.01?lOmin，從90%線性降至75% ;10?25min，從75%線性降至55% ；25?35min，從55%線性降至45% ；35?50min，從45%線性降至0%。
[0007]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明公開了一種睡蓮花中的沒食子酸和煙花苷的含量測定及薄層分析方法，利用超聲法提取睡蓮花中的有效成分，采用HPLC法測定睡蓮花中的沒食子酸和煙花苷的含量，通過HPLC實驗對睡蓮花的成分進行了研究，并結合實際分離情況，確定了睡蓮花的有效成分為沒食子酸和煙花苷，亦為睡蓮花的深入研究及臨床應用提供一定的科學依據(jù)。該方法提供了一種定性鑒別方法和高效液相測定藥物中沒食子酸和煙花苷含量的方法，具有較強的專屬性和良好的重現(xiàn)性(重復性試驗中，供試品中沒食子酸和煙花苷含量的RSD分別為
0.354%、1.92%)，真正體現(xiàn)了藥品的安全有效性和質量可控性。本發(fā)明方法檢測精準，誤差小(精密度試驗中5次對照品的沒食子酸及煙花苷峰面積RSD分別為0.76%,0.98%)?？衫帽旧暾埖姆椒▽λ徎ǖ馁|量進行檢測控制。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發(fā)明的實施一起用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的限制。在附圖中:
圖1是在熒光燈365nm下睡蓮花樣品與沒食子酸標準品薄層色譜圖，其中，I為睡蓮花樣品，2為沒食子酸標準品；
圖2是在熒光燈365nm下睡蓮花樣品與煙花苷標準品薄層色譜圖，其中，1、2為睡蓮花樣品，3為煙花苷標準品；
圖3是混合標準品中沒食子酸對照品的紫外光譜圖；
圖4是混合標準品中煙花苷對照品的紫外光譜圖；
圖5是睡蓮花中沒食子酸的紫外光譜圖；
圖6是睡蓮花中煙花苷的紫外光譜圖；
圖7是混合對照品高效液相色譜圖，其中，a為沒食子酸對照品高效液相色譜圖；b為煙花苷高效液相色譜圖；
圖8是睡蓮花供試樣品溶液高效液相色譜圖；
圖9是沒食子酸對照品線性考察圖；
圖10是煙花苷對照品線性考察圖。
【具體實施方式】
[0009]以下結合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優(yōu)選實施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0010]1.睡蓮花薄層鑒別方法為:取睡蓮花粉末lg，加甲醇溶液50ml，超聲提取30min，放冷，濾過，將濾液濃縮至約2ml，作為供試品溶液，另精密稱取沒食子酸，煙花苷，標準品分別置于IOml容量瓶，作為對照品溶液。分別吸取沒食子酸、供試品溶液各5μ1，點于硅膠GF254薄層板上，吸取煙花苷、供試品溶液，點于聚酰胺薄膜，以體積比例為8:1:1的乙酸乙酯-甲酸-水為展開劑，展開，取出，噴以1%的三氯化鋁乙醇溶液，晾干，置于熒光燈下檢視。參見熒光燈365nm下睡蓮花樣品與沒食子酸標準品薄層色譜圖(附圖1)，1為睡蓮花樣品，2為沒食子酸標準品，I和2在對應位置處出現(xiàn)熒光點，說明可用于鑒別睡蓮花中沒食子酸。參見熒光燈365nm下睡蓮花樣品與煙花苷標準品薄層色譜圖(附圖2)，其中，1、2為睡蓮花樣品，3為煙花苷標準品，1、2和3在相同位置均出現(xiàn)熒光點，說明可用于鑒別睡蓮花樣品中煙花苷。
[0011]2.睡蓮花中沒食子酸和煙花苷的含量測定方法
2.1藥材、儀器與試劑
藥材來源:睡蓮花藥材采自新疆奇康哈博維藥有限公司，經(jīng)新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院藥用植物講師徐海燕教師鑒定為睡蓮科雪白睡蓮(Nymphaea candidaPresl.)的干燥花蕾。粉碎過20目篩備用。
[0012]高效液相色譜儀LC-6AD、CBM-20A色譜工作站、SH)-20A型紫外檢測器，SIL-20A型自動進樣器、CTO-lOASvp型柱溫箱(日本島津公司);安捷倫液相:G1322A在線脫氣機，G1312A四元泵，G1367C自動進樣器，G1316A柱溫控制器，G1315B 二極管陣列檢測器(DAD)。XS105型電子天平(德國，梅特勒-托利多)、超聲清洗器(KQ5200DE型昆山市超聲儀器有限公司)。
[0013]甲醇(色譜純，飛世爾實驗器材有限公司)，其他均為分析純，水為飲用純凈水(娃哈哈集團有限公司)，煙花苷標準品由新疆藥物研究所趙軍博士提供(含量〉97%)，沒食子酸標準品(成都曼思特生物科技有限公司，含量〉98%)
2.2方法與結果
沒食子酸和煙花苷對照品適量，加甲醇制成一定濃度的溶液，在200?400nm波長范圍掃描，測得沒食子酸的最大吸收波長λ max為270nm，煙花苷的最大吸收波長為265nm，參見附圖 3、4、5、6。
[0014]2.2.2色譜條件
色譜柱:直徑和長度為4.6mmX 250mm, 5Mm的Wondasil C18，流動相:甲醇和0.1%冰乙酸混合水溶液。采用梯度洗脫，流動相中B的體積百分數(shù)隨時間變化為:0.01?lOmin，從90%線性降至75% ；10?25min,從75%線性降至55% ；25?35min,從55%線性降至45% ；35?50min，從45%線性降至0%。柱溫:30°C ;流速:lmL/min，檢測波長:270nm，進樣量:5μ1,采樣時間:50min。
[0015]2.2.3對照品溶液的制備
精密稱取標準品沒食子酸6.50mg，煙花苷5.3Img,分別置于IOml容量瓶中加甲醇溶解定容，制成的沒食子酸和煙花苷溶液的濃度分別為0.650mg/ml、0.531mg/ml。分別吸取沒食子酸和煙花苷對照品儲備液lml、2.5ml，置于同一個IOml容量瓶中用甲醇稀釋定容，得到混合對照品中煙花苷的濃度為0.1328mg/ml，沒食子酸的溶度為0.0650mg/ml。
[0016]2.2.4供試品制備
精密稱取Ig睡蓮花藥材粉末，置于50ml具塞錐形瓶中，加入50ml甲醇，稱重，超聲處理30min，放冷后再稱量質量并用甲醇補足質量差，過濾，取濾液用0.45Mm微孔膜過濾，置于樣品瓶中，作為供試樣品溶液。
[0017]2.2.5線性關系考察精密吸取混合對照品溶液1，3，5，7，9PL，然后進樣分析，以對照品的進樣量(X，μδ)為橫坐標，峰面積積分值⑴為縱坐標，進行性線性擬合，繪制標準曲線，得沒食子酸線性回歸方程為Υ=3177785.34Χ-34770.85 (r=0.999 I)，煙花苷線性回歸方程為Y=2027945.39Χ-17934.95 (r=0.999 5)，結果表明，沒食子酸及煙花苷進樣量分別在
0.065~0.535μδ,0.133~1.195Pg范圍內，峰面積與進樣量呈現(xiàn)良好的線性關系。參見附圖 7、8、9、10。
[0018]2.2.6精密度試驗
精密吸取混合對照品溶液5PL，連續(xù)進樣5次，結果沒食子酸及煙花苷峰面積RSD分別為0.76%,0.98%，表明儀器精密度較好。
[0019]2.2.7穩(wěn)定性試驗
取同一睡蓮花供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣5 PL測定，結果沒食子酸標準品峰面積RSD為2.37%，煙花苷標準品峰面積RSD為2.29%，表明供試品溶液在24h內基本穩(wěn)定。
[0020]2.2.8重復性試驗稱取睡蓮花樣品5份，按“2.2.4”項下方法配制成供試液，并在上述色譜條件下進樣5PL進行測定。結果供試品中沒食子酸及煙花苷含量的RSD為
0.354%、1.92%，表明該實驗方法的重復性較好。
[0021 ] 2.2.9加樣回收率試驗
分別稱取6份已知含量睡蓮花藥材粉末0.5g，分別置于50mL具塞錐形瓶中，加入已知沒食子酸及煙花苷量的對照品，按“2.2 .4”項下方法制成供試品溶液，在上述色譜條件下進樣5 μ?測定，結果計算得到睡蓮花中沒食子酸平均回收率為102.71%，RSD為1.97%，煙花苷平均回收率為102.08%, RSD為0.457%。見表1。
[0022]
表1樣品回收率實驗結果
IIII
I測定項目I 平均回收率(%) IRSD(I)I
1-1-j-1
II?
I 役食子酸 I102.71I1.97II 煙花苷 I 102.080.46I
?；II
[0023]2.3.0樣品含量測定
分別精密吸取供試品溶液5 μ?,注入液 相色譜儀，在上述色譜條件下進行測定，記錄峰面積，計算樣品中的沒食子酸和煙花苷的含量，見表2。
[0024]
【權利要求】
1.一種睡蓮花的鑒別和含量測定方法，睡蓮花中沒食子酸和煙花苷的薄層鑒別方法和含量測定方法，具體步驟如下: 步驟一、采用薄層色譜法對睡蓮花中的沒食子酸和煙花苷進行定性分析 在硅膠GF254薄層板上，分別點沒食子酸-甲醇溶液、睡蓮花藥材-甲醇溶液，在聚酰胺薄膜上，點煙花苷-甲醇溶液、睡蓮花藥材-甲醇溶液，以乙酸乙酯-甲酸-水按體積比為8:1:1為展開劑展開，取出，晾干，置于熒光燈下檢視； 步驟二、采用高效液相色譜法對睡蓮花中沒食子酸和煙花苷進行含量測定 1)對照品的制備 a、精密稱取對照品沒食子酸和煙花苷，加甲醇制成沒食子酸和煙花苷的對照品儲備液，濃度分別為 0.650mg/ml、0.531mg/ml ； b、分別吸取沒食子酸和煙花苷對照品儲備液各lml、2.5ml，加甲醇稀釋，得到含煙花苷和沒食子酸的對照品混合溶液，所含煙花苷的濃度為0.1328mg/ml、所含沒食子酸的濃度為.0.0650mg/ml ； 2)供試品的制備 精密稱取Ig睡蓮花藥材粉末，置于50ml具塞錐形瓶中，加入50ml甲醇，稱重，超聲提取30min，放冷后，稱量質量并用甲醇補足質量差，過濾，置于樣品瓶中，作為供試品溶液； 3)含量測定 測定睡蓮花中沒食子酸和煙花苷的含量時，采用沒食子酸及煙花苷標準品做對照品，繪制進樣量一色譜峰面積的標準曲線，測定睡蓮花的色譜峰面積，從標準曲線上讀出睡蓮花中沒食子酸及煙花苷的含量，其中，液相色譜測定峰面積的色譜條件為:色譜柱的直徑和長度為4.6mmX 250mm, 5Mm的WondasiI? C18，檢測波長為270nm，流動相為甲醇和0.1%冰乙酸混合水溶液，柱溫為30°C，流速為lmL/min，進樣量為5μ1，采樣時間為50min，采用梯度洗脫。
2.根據(jù)權利要求1所述的睡蓮花的鑒別和含量測定方法，其特征在于:所述步驟二的步驟2中，所述過濾采用0.45ΜΠ1微孔膜過濾。
3.根據(jù)權利要求1所述的睡蓮花的鑒別和含量測定方法，其特征在于:所述步驟二的步驟3)中，所述梯度洗脫具體為:流動相中0.1%冰乙酸的體積百分數(shù)隨時間變化為.0.01 ?IOmin,從 90% 線性降至 75% ；10 ?25min,從 75% 線性降至 55% ；25 ?35min,從 55%線性降至45% ；35?50min,從45%線性降至0%。
【文檔編號】G01N30/88GK103513000SQ201310461068
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年10月8日 優(yōu)先權日:2013年10月8日
【發(fā)明者】田樹革, 李潔, 季志紅, 陳金成 申請人:新疆奇康哈博維藥有限公司