芒屬植物快速切片染色的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物切片的【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種植物切片染色的方法，取新鮮的芒屬植物莖段3-10cm，經(jīng)酒精浸泡、適度軟化處理、切片、對切下的薄片進(jìn)行染色、固定、脫色后再次染色后制片用于顯微鏡觀察。本發(fā)明方法的軟化程度更易把握，不會出現(xiàn)過硬或過軟等問題，易于切片的完整性，更利于后期的染色和制片。
【專利說明】芒屬植物快速切片染色的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物切片的【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種植物切片染色的方法，更具體地說是涉及一種芒屬植物快速切片染色并用于鏡檢的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生物質(zhì)是繼煤炭、石油之后，世界第三大能源(Liang，2000)，生物質(zhì)資源儲量非常豐富，每年生物質(zhì)能源為全世界提供了 14%的能源，并成為世界上約15億人口賴以生存的主要能源(K0UF0PAN0S，1989)。如今，利用多年生草本植物發(fā)展生物質(zhì)能源產(chǎn)業(yè)是可再生能源發(fā)展的一個新方向。關(guān)于木質(zhì)纖維素能源植物的研究近年來受到普遍關(guān)注，纖維素類原料是地球上最豐富的可再生資源，植物干重的35%?50%是纖維素，20%?35%是半纖維素，還有5%?30%是木質(zhì)素。全球光合作用產(chǎn)生的植物生物量每年高達(dá)1.1 X 1012t,纖維素原料占全球生物量的60%?80%(袁振宏，2005)。近些年來，全世界正努力利用可生物降解及對環(huán)境友好的天然纖維用于非傳統(tǒng)用途，這引起了人們對這些纖維新的研究興趣(Bassam，1998 ；Venendaal, 1997)。例如用油菜、大豆、玉米、甘蔗、甜高粱等作物來生產(chǎn)生物柴油或纖維乙醇，用這樣的可再生清潔能源來替代化石燃料(杜風(fēng)光，2007)。因此通過測定不同植物的木質(zhì)纖維素含量，可以發(fā)掘更多能源植物(孫智謀，2007 ;永安東，2003)。芒屬植物因其高生物產(chǎn)量、強(qiáng)適應(yīng)性等特點(diǎn)，作為纖維素類能源資源，具有極大的開發(fā)潛力。
[0003]纖維素是一種直鏈多糖，水解可得到葡萄糖，再經(jīng)酵母發(fā)酵可得乙醇。半纖維素是戊糖(含木糖、阿拉伯糖)、己糖(含甘露糖、葡萄糖、半乳糖)和糖酸所組成的不均一聚糖，為異質(zhì)多糖，結(jié)構(gòu)和纖維素不同，水解后產(chǎn)生混合糖。木質(zhì)素是一種高分子芳香族化合物，不能水解成糖，但可用作燃料。纖維素和半纖維素的降解利用主要受到分子間大量氫鍵的制約，同時也受到其與木質(zhì)素間的化學(xué)鍵的影響(謝新明，2008)。目前，國內(nèi)外很多學(xué)者認(rèn)為，降低木質(zhì)素含量，提高纖維素含量，這對木質(zhì)纖維素的降解和轉(zhuǎn)化乙醇非常有利。但木質(zhì)素含量過低，對植物的生長發(fā)育又有影響。而植物中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素形成過程都與維管束的生長與消失過程有明顯關(guān)聯(lián)，對維管束的生長情況只有通過制片后經(jīng)顯微鏡觀察得到。
[0004]目前，植物制片前需要進(jìn)行前處理，將植物材料進(jìn)行切成便于觀察的薄片才行，有兩種方法進(jìn)行:一種為徒手切片法、另一種為石蠟切片法。徒手切片是用手持雙面刀片或剃刀，將新鮮材料或預(yù)先固定好的材料(切前水洗)切成薄片，不經(jīng)染色或經(jīng)簡單染色后，用水封片作臨時裝片觀察。徒手切片法的優(yōu)點(diǎn)是不需要復(fù)雜的設(shè)備，方法簡便，制片迅速，而且能觀察到植物組織的自然色澤和活體結(jié)構(gòu)，常用于研究植物解剖結(jié)構(gòu)、細(xì)胞組織化學(xué)成分，植物資源鑒定等。同時，它具有利于臨時觀察、能夠較快的得到結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是對于體積過小、太軟、太硬的材料則難于切片，而且不能制成連續(xù)切片。
[0005]而石蠟切片法是最常用的一種制片法。其制作過程是:取材一固定一沖洗一脫水—透明一浸蠟一包埋一切片一貼片一烤片一脫蠟一復(fù)水一染色一脫水一透明一封藏。石蠟制片是一個連續(xù)的操作過程，往往要連續(xù)幾天才能完成，容易與其它工作發(fā)生沖突，也會因前后順序顛倒或超過了規(guī)定的時間，給科研工作帶來不小的損失。制片的各個步驟都是互相關(guān)聯(lián)的，如脫水不徹底就會影響到透明的程度，以至影響蠟塊的質(zhì)量。
[0006]本試驗運(yùn)用快速切片法，通過顯微鏡觀察在田間可以觀察到不同時期的芒屬莖段生長情況，了解芒屬植物資源在纖維素、半纖維素和木質(zhì)素形成過程中維管束的生長與消失過程，可為今后該類植物的遺傳育種工作中選擇親本材料提供參考依據(jù)，并為大面積推廣種植芒屬植物，推動其工業(yè)化利用奠定一定的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的就是要提供一種方法簡單、成本低、便于快速化鏡檢，準(zhǔn)確率高的快速切片方法，可用于顯微鏡觀察。
[0008]本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括:取新鮮的芒屬植物莖段3-lOcm，經(jīng)酒精浸泡、適度軟化處理、切片、對切下的薄片進(jìn)行染色、固定、脫色后再次染色后制片用于顯微鏡觀察。
[0009]因此，本發(fā)明提供芒屬植物快速切片染色的方法，其具體步驟包括:
[0010](I)取新鮮的芒屬植物莖段3-10cm用70%的乙醇浸泡30秒，加入50-60%丙二酸水溶液進(jìn)行軟化處理30-60min ；
[0011](2)將材料取出，用氫氧化鈉溶液浸泡5-10min，用蒸餾水沖洗三次，再用帶柄手術(shù)刀快速切片，得到大量的芒屬植物莖段薄片；
[0012](3)對切下的薄片進(jìn)行用蒸餾水沖洗兩次，加入1%番紅染色I(xiàn)h ；
[0013](4)番紅染色后去掉染色液用蒸餾水沖洗一次，依次用30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇分別浸泡10-30秒；
[0014](5)再次用0.5%固綠染色20-60秒，用95%乙醇浸泡30秒，再用100%乙醇浸泡5min ；
[0015](6)用乙醇二甲苯溶液浸泡3min，再用100%二甲苯浸泡5min，重復(fù)一次，取出薄片用樹膠封片，在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察維管束的生長情況。
[0016]在一個具體實施方案中，步驟(2)所述氫氧化鈉溶液是指10-6.5-10-5.5mol/L氫氧化鈉水溶液。
[0017]在一個具體實施方案中，步驟(6)所述乙醇二甲苯溶液為100%乙醇與100% 二甲苯等體積混合制成的。
[0018]技術(shù)效果:
[0019]1、本發(fā)明方法中充分考慮到芒屬植物在生長過程中存在不同硬度的情況，將不同硬度的材料進(jìn)行處理，使其硬度完全一致便于快速切片，由于所用設(shè)備只需要顯微鏡，大大地降低了對切片條件要求，便于田間規(guī)?；M(jìn)行鏡檢不同芒屬樣品；
[0020]2、本切片制片方法操作簡單、快速，大大縮短了檢測時間，在較短的時間內(nèi)就可以檢測出結(jié)果。
[0021]3、與常規(guī)石蠟切片方法相比，無需要長時間進(jìn)行制片且也具有很高的準(zhǔn)確率和靈敏度，植物細(xì)胞不會發(fā)生變形，而與徒手切片方法相比，具有更高的準(zhǔn)確率和靈敏度，制片時間不長，也很適合野外實驗需要。
[0022]4、本發(fā)明在檢測過程中采用丙二酸進(jìn)行軟化，相比其它方法，軟化程度更易把握，不會出現(xiàn)過硬或過軟等問題，易于切片的完整性，更利于后期的染色和制片?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0023]圖1:10X 10倍顯微鏡觀察圖片；
[0024]圖2:10X 10倍顯微鏡觀察圖片；
[0025]圖3:10X 10倍顯微鏡觀察圖片；
[0026]圖4:10X 10倍顯微鏡觀察圖片；
[0027]圖5:10X 10倍顯微鏡觀察圖片；
[0028]圖6:10X 10倍顯微鏡觀察圖片；
[0029]圖7:10 X 4倍顯微鏡觀察圖片；
[0030]圖8:10X 10倍顯微鏡觀察圖片；
[0031]圖9:10X10倍顯微鏡觀察圖片；
[0032]圖10:10 X 10倍顯微鏡觀察圖片；
[0033]圖11:10X 10倍顯微鏡觀察圖片；
[0034]圖12:10X 10倍顯微鏡觀察圖片；
[0035]圖13:10X10倍顯微鏡觀察圖片。
【具體實施方式】
[0036]下面，本發(fā)明將用實施例進(jìn)行進(jìn)一步的說明，但是它并不限于這些實施例的任一個或類似實例。
[0037]實施例1
[0038]取新鮮的芒屬植物莖段3-lOcm用70%的乙醇浸泡30秒，加入55%丙二酸水溶液進(jìn)行軟化處理40min ;將材料取出，用10_6mol/L氫氧化鈉溶液浸泡8min，用蒸餾水沖洗三次，再用帶柄手術(shù)刀快速切片，得到大量的芒屬植物莖段薄片；對切下的薄片進(jìn)行用蒸餾水沖洗兩次，加入1%番紅染色I(xiàn)h ;番紅染色后去掉染色液用蒸餾水沖洗一次，依次用30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇分別浸泡30秒；再次用0.5%固綠染色60秒，用95%乙醇浸泡30秒，再用100%乙醇浸泡IOmin ;用乙醇二甲苯溶液浸泡3min，再用100% 二甲苯浸泡5min，重復(fù)一次，取出薄片用樹膠封片，在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察維管束的生長情況。結(jié)果見圖1-5。
[0039]對照實施例1
[0040]取新鮮的芒屬植物莖段3-10cm放入1:1過氧化氫和乙酸各半的混合液(或2:1)中，每隔20或30分鐘至I小時用鑷子取出樣品，流水沖洗約10分鐘后，用刀片試切，若手感柔軟，即可投入水中沖洗一天后切片。也可保存在甘油-乙醇各半的混合液中待用；對切下的薄片進(jìn)行用蒸餾水沖洗兩次，加入1%番紅染色I(xiàn)h ;番紅染色后去掉染色液用蒸餾水沖洗一次，依次用30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇分別浸泡30秒；再次用0.5%固綠染色60秒,用95%乙醇浸泡30秒,再用100%乙醇浸泡IOmin ;用乙醇二甲苯溶液浸泡3min，再用100% 二甲苯浸泡5min，重復(fù)一次，取出薄片用樹膠封片，在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察維管束的生長情況，結(jié)果見圖6-9。
[0041]對照實施例2
[0042]取新鮮的芒屬植物莖段3-lOcm用70%、乙醇50%乙醇各浸泡I小時，加入15%氫氟酸水溶液進(jìn)行軟化處理10?15天；將材料取出，用蒸餾水沖洗三次，再用帶柄手術(shù)刀快速切片，得到大量的芒屬植物莖段薄片；對切下的薄片進(jìn)行用蒸餾水沖洗兩次，加入1%番紅染色I(xiàn)h ;番紅染色后去掉染色液用蒸餾水沖洗一次，依次用30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇分別浸泡30秒；再次用0.5%固綠染色60秒，用95%乙醇浸泡30秒，再用100%乙醇浸泡IOmin ;用乙醇二甲苯溶液浸泡3min,再用100% 二甲苯浸泡5min,重復(fù)一次，取出薄片用樹膠封片，在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察維管束的生長情況，見圖10-13。
【權(quán)利要求】
1.本發(fā)明提供芒屬植物快速切片染色的方法，其具體步驟包括: (1)取新鮮的芒屬植物莖段3-lOcm用70%的乙醇浸泡30秒，加入50-60%丙二酸水溶液進(jìn)行軟化處理30-60min ； (2)將材料取出，用氫氧化鈉溶液浸泡5-10min，用蒸餾水沖洗三次，再用帶柄手術(shù)刀快速切片，得到大量的芒屬植物莖段薄片； (3)對切下的薄片進(jìn)行用蒸餾水沖洗兩次，加入1%番紅染色I(xiàn)h； (4)番紅染色后去掉染色液用蒸餾水沖洗一次，依次用30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇分別浸泡30秒；(5)再次用0.5%固綠染色60秒，用95%乙醇浸泡30秒，再用100%乙醇浸泡IOmin ； (6)用乙醇二甲苯溶液浸泡3min,再用100%二甲苯浸泡5min,重復(fù)一次,取出薄片用樹膠封片，在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察維管束的生長情況。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，步驟(2)所述氫氧化鈉溶液是指10-6.5-10-5.5mol/L氫氧化鈉水溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，步驟(6)所述乙醇二甲苯溶液為100%乙醇與100%二甲苯等體積混合制成的。
【文檔編號】G01N1/30GK103528871SQ201310429048
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月20日
【發(fā)明者】覃靜萍, 易自力, 蔣建雄 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)