專利名稱：犬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物醫(yī)學(xué)免疫檢測(cè)領(lǐng)域，具體是涉及一種檢測(cè)犬早孕因子的膠體金試紙卡的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
假孕癥是犬在繁殖季節(jié)常見(jiàn)的一種疾病，多發(fā)于3 5歲母犬，是指母犬發(fā)情后在未交配或配后沒(méi)有受孕的情況下，全身狀況和行為出現(xiàn)妊娠所特有變化的一種綜合征。犬假孕有時(shí)伴有子宮疾病，會(huì)引起嚴(yán)重的后果，輕則不孕，重則死亡。近年來(lái)，隨著養(yǎng)犬業(yè)和寵物行業(yè)的蓬勃發(fā)展，母犬假孕的發(fā)生率也隨之升高，據(jù)報(bào)道交配假孕率高達(dá)50% 75%，這是目前母犬繁殖率低下的一個(gè)重要原因，也給養(yǎng)犬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，對(duì)犬進(jìn)行早期妊娠診斷可以盡早確定犬是否發(fā)生假孕，及時(shí)采取復(fù)配及治療措施，以便縮短空懷期。目前多種妊娠診斷方法中B超檢測(cè)準(zhǔn)確率高，但B超確診受孕要在母犬配種后30天左右，且需要價(jià)格昂貴的設(shè)備，在犬飼養(yǎng)場(chǎng)及家庭寵物犬主中應(yīng)用存在困難。如能開(kāi)發(fā)檢測(cè)快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、使用簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉的膠體金試紙卡將具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為解決上述技術(shù)問(wèn)題的不足，提供一種犬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡及其制備方法和應(yīng)用，可以臨床快速檢測(cè)母犬早孕因子，用于母犬早期妊娠的臨床診斷。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題的不足，所采用的技術(shù)方案是:犬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡，所述檢測(cè)試紙卡由卡槽和膠體金試紙條組成，卡槽具有一個(gè)容置空腔，且卡槽上設(shè)置有觀察區(qū)和加樣孔，膠體金試紙條主要由支撐薄片、纖維素膜、含有金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜、載樣墊和吸水墊組成，所述的纖維素膜設(shè)置在支撐薄片的中部，纖維素膜一側(cè)的支撐薄片上依次粘貼有含有金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜和載樣墊，纖維素膜另一側(cè)的支撐薄片上粘貼有吸水墊，所述纖維素膜的中部有一條含有犬早孕因子抗體的檢測(cè)線和一條含有羊抗兔二抗的質(zhì)控線，膠體金試紙條設(shè)置在卡槽的容置空腔內(nèi)，卡槽的觀察區(qū)對(duì)應(yīng)膠體金試紙條的顯色區(qū)，加樣孔對(duì)應(yīng)膠體金試紙條的載樣墊。所述載樣墊中金標(biāo)抗體為兔抗犬早孕因子多克隆抗體。所述纖維素膜中犬早孕因子抗體為鼠源單克隆抗體。所述纖維素膜中羊抗兔二抗為羊抗兔IgG抗體。犬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡的制備方法，包括以下步驟:
O制備含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的纖維素膜
a、采用體外提取并濃縮的犬早孕因子蛋白作為免疫原以5-10ug免疫Balb/c小鼠，取脾臟細(xì)胞與SP2/0瘤細(xì)胞進(jìn)行融合后獲得單克隆抗體；
b、采用噴膜機(jī)，調(diào)整噴液量為30ul/40cm，用包被緩沖液稀釋單克隆抗體，濃度為50ug/ml，在纖維素膜中適當(dāng)位置劃線，即為檢測(cè)線，晾干備用；C、采用噴膜機(jī)，調(diào)整噴液量為30ul/40cm，用包被緩沖液稀釋羊抗兔IgG抗體，濃度為lmg/ml，在纖維素膜上與檢測(cè)線平行的位置劃線，間隔5mm，即為質(zhì)控線，晾干得到含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的纖維素膜；
d、用封閉工作液將步驟c制備的纖維素膜于室溫封閉60分鐘，取出后置37°C下晾干，封存?zhèn)溆茫?br> 2)制備涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜
a、采用體外提取并濃縮的犬早孕因子蛋白作為免疫原以10-20ug免疫家兔后采血，提取IgG抗體,制備多克隆抗體；
b、將上述步驟a制備的多克隆抗體置于透析袋中在中進(jìn)行透析除鹽，調(diào)整膠體金溶液PH值為9.2 9.5，在電磁攪拌下，以0.2mg/min的滴加速度將抗體溶液逐滴加入膠體金溶液中，然后在電磁攪拌下加入牛血清白蛋白，使溶液中牛血清白蛋白的濃度為1%，即得粗制金標(biāo)抗體；
C、將粗制的金標(biāo)抗體以1500r/min低速離心Ih,取上清液在4°C溫度下以15000r/min的轉(zhuǎn)速離心操作lh，取沉淀以原體積溶于緩沖液中，即得純化的金標(biāo)抗體；
d、將純化的金標(biāo)抗體均勻噴涂于玻璃纖維膜中，干燥，得到涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜，封存?zhèn)溆茫?br> 3)制備犬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡
將涂有檢測(cè)線和質(zhì)控線的纖維素膜粘貼在支撐薄片的中部，在纖維素膜的一側(cè)依次粘貼含有金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜和載樣墊，在纖維素膜的另一側(cè)粘貼吸水墊，得到試紙板，將試紙板切割成不同寬度的試紙條，將試紙條安放于卡槽中即為犬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡。 所述步驟I)中的包被緩沖液為經(jīng)過(guò)0.45u濾膜過(guò)濾的0.05M、PH9.6的碳酸鹽緩沖液。所述步驟I)中的封閉工作液為2%牛血清白蛋白、2%脫脂奶粉和0.01M、PH7.0的碳酸鹽緩沖液混合后用0.45u濾膜過(guò)濾得到的封閉工作液。所述步驟2)中的透析除鹽使用的透析液為雙蒸水或0.005M、PH7.0低濃度的鹽水。犬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡在診斷犬早期妊娠中應(yīng)用，經(jīng)脈采集母犬血液
0.5ml,于ImlEP管中靜置分離血清，將所得的血清滴加在本試紙卡的載樣墊中，在試紙卡的檢測(cè)線、質(zhì)控線位置均出現(xiàn)紅色條帶時(shí)，早孕因子檢測(cè)為陽(yáng)性；僅質(zhì)控線出現(xiàn)一條紅色條帶時(shí)，為陰性結(jié)果；在試紙卡的質(zhì)控線未出現(xiàn)紅色條帶時(shí)為無(wú)效結(jié)果。有益效果
本發(fā)明所述的膠體金試紙卡利用現(xiàn)代國(guó)際最先進(jìn)的膠體金免疫層析技術(shù)，通過(guò)試紙卡中纖維素膜上分別噴涂含犬早孕因子抗體的檢測(cè)線和含羊抗兔IgG抗體的質(zhì)控線，能夠臨床檢測(cè)犬早孕因子，為寵物犬愛(ài)好者、家犬養(yǎng)殖場(chǎng)和寵物醫(yī)院等提供一種臨床診斷母犬早期妊娠的試紙卡，該試紙卡具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)快速的優(yōu)點(diǎn)，且不需要使用儀器設(shè)備，成本低廉，操作方便，能廣泛應(yīng)用于寵物犬愛(ài)好者、家犬養(yǎng)殖場(chǎng)和寵物醫(yī)院對(duì)犬早期妊娠的診斷，為了解母犬孕情和對(duì)母犬假孕進(jìn)行診斷奠定了基礎(chǔ)。


圖1是本發(fā)明的膠體金試紙卡的結(jié)構(gòu)示意 圖中:1、卡槽，2、支撐薄片，3、纖維素膜，4、含有金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜，5、載樣墊，6、吸水墊，7、加樣孔，8、觀察區(qū)。
具體實(shí)施例方式以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例:
O制備含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的纖維素膜
a、采用體外提取并濃縮的犬早孕因子蛋白作為免疫原以5-10ug免疫Balb/c小鼠，取脾臟細(xì)胞與SP2/0瘤細(xì)胞進(jìn)行融合后獲得單克隆抗體；
具體方法為:以體外提取并濃縮的犬早孕因子蛋白作為免疫原免疫Balb/c小鼠，按
0.5ml/只皮下多點(diǎn)注射，間隔10天，進(jìn)行3次。融合前，小鼠腹腔注射0.3ml抗原進(jìn)行加強(qiáng)免疫。取小鼠脾臟淋巴細(xì)胞和用含10%犢牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的SP2/0細(xì)胞按10:1比例加聚乙二醇2000進(jìn)行融合，將融合孔中的上清液用ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，確定陽(yáng)性孔。將檢測(cè)到的陽(yáng)性孔中的雜交瘤細(xì)胞采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，直至雜交瘤細(xì)胞上清液的陽(yáng)性率達(dá)到100%，建立雜交瘤細(xì)胞系。將建系的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，提取并濃縮上清液中的抗體，即得單克隆抗體。犬早孕因子蛋白的分離、純化:取經(jīng)超生波檢測(cè)的妊娠18天的孕犬動(dòng)脈血，血液凝結(jié)后取自然析出的血清，在該血清中加中性鹽至35%濃度沉淀蛋白質(zhì)，離心操作后取上清液，在上清液中加入中性鹽至45%離心濃度，離心后取上清，獲得沉淀物后，在56°C溫度下、30min滅活，采用DEAE-瓊脂糖凝膠及CM-瓊脂糖凝膠離子交換層析技術(shù)、抗孕犬全血清Ig-Sepharose 4B親和層析技術(shù)對(duì)該沉淀物進(jìn)行分離純化,用玫瑰花環(huán)抑制實(shí)驗(yàn)對(duì)該沉淀物活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，經(jīng)層析過(guò)柱后的提取物具有EPF (早孕因子)活性，經(jīng)SD-PAGE銀染顯色證實(shí)該沉淀物為多肽。b、采用噴膜機(jī)，調(diào)整噴液量為30ul/40cm，用包被緩沖液稀釋單克隆抗體，濃度為50ug/ml，在纖維素膜3中適當(dāng)位置劃線，即為檢測(cè)線，晾干備用；
C、采用噴膜機(jī)，調(diào)整噴液量為30ul/40cm，用包被緩沖液稀釋羊抗兔IgG抗體，濃度為lmg/ml，在纖維素膜3上與檢測(cè)線平行的位置劃線，間隔5mm，即為質(zhì)控線，晾干得到含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的纖維素膜3;
d、用封閉工作液將步驟c制備的纖維素膜3于室溫封閉60分鐘，取出后置37°C下晾干，封存?zhèn)溆茫?br> 包被緩沖液的制備:將0.05M、PH9.6的碳酸鹽緩沖液，用0.45u濾膜過(guò)濾，置于4°C保
存?zhèn)溆?。封閉緩沖液的制備:將0.01M、PH7.0的碳酸鹽緩沖液，用0.45u濾膜過(guò)濾，置于
4 °C保存?zhèn)溆?。封閉工作液的配制:將含2%牛血清白蛋白、2%脫脂奶粉；0.01M、PH7.0的碳酸鹽緩沖液，用0.45u濾膜過(guò)濾,置于4°C保存?zhèn)溆谩?)制備涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜
a、采用體外提取并濃縮的犬早孕因子蛋白作為免疫原以10_20ug免疫家兔后采血，提取IgG抗體，制備多克隆抗體；
具體方法為:犬早孕因子Img蛋白家兔背部多點(diǎn)注射，間隔10天，連續(xù)注射3次，最后一次采用靜脈注射2mg該蛋白，經(jīng)脈注射一周后耳經(jīng)脈采取，采用ELISA方法測(cè)定抗體效價(jià)，抗體效價(jià)合格后心臟采血，分離血清；兔抗犬早孕因子血清經(jīng)飽和硫酸銨鹽析法粗體、透析，再經(jīng)過(guò)G25和纖維素柱進(jìn)一步純化，將收集的蛋白質(zhì)于透析袋中濃縮，即得多克隆抗體。b、將上述步驟a制備的多克隆抗體置于透析袋中在雙蒸水或0.005M、PH7.0低濃度的鹽水中進(jìn)行透析除鹽，中間換3次透析液。在膠體金標(biāo)記抗體最低穩(wěn)定量的基礎(chǔ)上再加上20%即為為穩(wěn)定膠體金所需抗體的實(shí)際量，根據(jù)用以標(biāo)記的膠體金的總量計(jì)算所需的待標(biāo)記抗體的總量。調(diào)整膠體金溶液PH值到9.2-9.5。在電磁攪拌下，將抗體溶液逐滴加入膠體金溶液中，速度控制在0.2mg/min。在電磁攪拌下加入牛血清白蛋白，使溶液中牛血清白蛋白的濃度為1%，即得粗制金標(biāo)抗體。C、將粗制的金標(biāo)抗體以1500r/min低速離心Ih,取上清液在4°C溫度下以15000r/min的轉(zhuǎn)速離心操作lh，取沉淀以原體積溶于緩沖液中，即得純化的金標(biāo)抗體；
d、將純化的金標(biāo)抗體均勻噴涂于玻璃纖維膜中，干燥，得到涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜4，封存?zhèn)溆茫?br> 3)制備犬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡
將涂有檢測(cè)線和質(zhì)控線的纖維素膜3粘貼在支撐薄片2的中部，在纖維素膜3的一側(cè)依次粘貼含有金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜4和載樣墊5,在纖維素膜3的另一側(cè)粘貼吸水墊6,得到試紙板，將試紙板切割成不同寬度的試紙條，將試紙條安放于卡槽I中，卡槽的觀察區(qū)8對(duì)應(yīng)膠體金試紙條的顯色區(qū)，加樣孔7對(duì)應(yīng)膠體金試紙條的載樣墊，即為犬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡。本試紙卡可用來(lái)檢測(cè)疑似早期妊娠階段母犬血清中的早孕因子，操作時(shí)，經(jīng)脈采集母犬血液0.5ml，于ImlEP管中靜置分離血清，將所得的血清滴加在本試紙卡的載樣墊51中，在試紙卡的檢測(cè)線4、質(zhì)控線5位置均出現(xiàn)紅色條帶時(shí)，早孕因子檢測(cè)為陽(yáng)性；僅質(zhì)控線5出現(xiàn)一條紅色條帶時(shí)，為陰性結(jié)果；在試紙卡的質(zhì)控線未出現(xiàn)紅色條帶時(shí)為無(wú)效結(jié)果。該試紙卡具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)快速的優(yōu)點(diǎn)，且不需要使用儀器設(shè)備，成本低廉，操作方便，能廣泛應(yīng)用于寵物犬愛(ài)好者、家犬養(yǎng)殖場(chǎng)和寵物醫(yī)院對(duì)犬早期妊娠的診斷，為了解母犬孕情和對(duì)母犬假孕進(jìn)行診斷奠定了基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.犬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡，其特征在于:所述檢測(cè)試紙卡由卡槽和膠體金試紙條組成，卡槽具有一個(gè)容置空腔，且卡槽上設(shè)置有觀察區(qū)和加樣孔，膠體金試紙條主要由支撐薄片、纖維素膜、含有金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜、載樣墊和吸水墊組成，所述的纖維素膜設(shè)置在支撐薄片的中部，纖維素膜一側(cè)的支撐薄片上依次粘貼有含有金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜和載樣墊，纖維素膜另一側(cè)的支撐薄片上粘貼有吸水墊，所述纖維素膜的中部有一條含有犬早孕因子抗體的檢測(cè)線和一條含有羊抗兔二抗的質(zhì)控線，膠體金試紙條設(shè)置在卡槽的容置空腔內(nèi)，卡槽的觀察區(qū)對(duì)應(yīng)膠體金試紙條的顯色區(qū)，加樣孔對(duì)應(yīng)膠體金試紙條的載樣墊。
2.如權(quán)利要求所述的犬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡，其特征在于:所述載樣墊中金標(biāo)抗體為兔抗犬早孕因子多克隆抗體。
3.如權(quán)利要求所述的犬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡，其特征在于:所述纖維素膜中犬早孕因子抗體為鼠源單克隆抗體。
4.如權(quán)利要求所述的犬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡，其特征在于:所述纖維素膜中羊抗兔二抗為羊抗兔IgG抗體。
5.如權(quán)利要求1所述的犬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: O制備含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的纖維素膜 a、采用體外提取并濃縮的犬早孕因子蛋白作為免疫原以5 IOug免疫Balb/c小鼠，取脾臟細(xì)胞與SP2/0瘤細(xì)胞進(jìn)行融合后獲得單克隆抗體； b、采用噴膜機(jī)，調(diào)整噴液量為30ul/40cm，用包被緩沖液稀釋單克隆抗體，濃度為50ug/ml，在纖維素膜中適當(dāng)位置劃線，即為檢測(cè)線，晾干備用； C、采用噴膜機(jī)，調(diào)整噴液量為30ul/40cm，用包被緩沖液稀釋羊抗兔IgG抗體，濃度為lmg/ml，在纖維素膜上與 檢測(cè)線平行的位置劃線，間隔5mm，即為質(zhì)控線，晾干得到含有檢測(cè)線和質(zhì)控線的纖維素膜； d、用封閉工作液將步驟c制備的纖維素膜于室溫封閉60分鐘，取出后置37°C下晾干，封存?zhèn)溆茫? 2)制備涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜a、采用體外提取并濃縮的犬早孕因子蛋白作為免疫原以10 20ug免疫家兔后采血，提取IgG抗體,制備多克隆抗體； b、將上述步驟a制備的多克隆抗體置于透析袋中在中進(jìn)行透析除鹽，調(diào)整膠體金溶液PH值為9.2 9.5，在電磁攪拌下，以0.2mg/min的滴加速度將抗體溶液逐滴加入膠體金溶液中，然后在電磁攪拌下加入牛血清白蛋白，使溶液中牛血清白蛋白的濃度為1%，即得粗制金標(biāo)抗體； C、將粗制的金標(biāo)抗體以1500r/min低速離心Ih,取上清液在4°C溫度下以15000r/min的轉(zhuǎn)速離心操作lh，取沉淀以原體積溶于緩沖液中，即得純化的金標(biāo)抗體； d、將純化的金標(biāo)抗體均勻噴涂于玻璃纖維膜中，干燥，得到涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜，封存?zhèn)溆茫? 3)制備犬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡 將涂有檢測(cè)線和質(zhì)控線的纖維素膜粘貼在支撐薄片的中部，在纖維素膜的一側(cè)依次粘貼含有金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜和載樣墊，在纖維素膜的另一側(cè)粘貼吸水墊，得到試紙板，將試紙板切割成不同寬度的試紙條，將試紙條安放于卡槽中即為犬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡。
6.如權(quán)利要求5所述的犬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡的制備方法，其特征在于:所述步驟I)中的包被緩沖液為經(jīng)過(guò)0.45u濾膜過(guò)濾的0.05M、PH9.6的碳酸鹽緩沖液。
7.如權(quán)利要求5所述的犬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡的制備方法，其特征在于:所述步驟I)中的封閉工作液為2%牛血清白蛋白、2%脫脂奶粉和0.01M、PH7.0的碳酸鹽緩沖液混合后用0.45u濾膜過(guò)濾得到的封閉工作液。
8.如權(quán)利要求5所述的犬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡的制備方法，其特征在于:所述步驟2)中的透析除鹽使用的透析液為雙蒸水或0.005M、PH7.0低濃度的鹽水。
9.如權(quán)利要求1所述的犬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡在診斷犬早期妊娠中應(yīng)用，其特征在于:所述應(yīng)用的具體步驟為:經(jīng)脈采集母犬血液0.5ml，于ImlEP管中靜置分離血清，將所得的血清滴加在本試紙卡的載樣墊中，在試紙卡的檢測(cè)線、質(zhì)控線位置均出現(xiàn)紅色條帶時(shí)，早孕因子檢測(cè)為陽(yáng)性；僅質(zhì)控線出現(xiàn)一條紅色條帶時(shí)，為陰性結(jié)果；在試紙卡的質(zhì)控線未出現(xiàn)紅色條帶 時(shí)為無(wú)效結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及犬早孕因子膠體金檢測(cè)試紙卡的制備方法和應(yīng)用，所述檢測(cè)試紙卡由卡槽和膠體金試紙條組成，膠體金試紙條由支撐薄片、纖維素膜、含有金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜、載樣墊和吸水墊組成，所述的纖維素膜設(shè)置在支撐薄片的中部，纖維素膜一側(cè)的支撐薄片上依次粘貼有含有金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜和載樣墊，纖維素膜另一側(cè)的支撐薄片上粘貼有吸水墊，所述纖維素膜的中部有一條含有犬早孕因子抗體的檢測(cè)線和一條含有羊抗兔二抗的質(zhì)控線，該試紙卡具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)快速的優(yōu)點(diǎn)，且不需要使用儀器設(shè)備，成本低廉，操作方便，能廣泛應(yīng)用于寵物犬愛(ài)好者、家犬養(yǎng)殖場(chǎng)和寵物醫(yī)院對(duì)犬早期妊娠的診斷，為了解母犬孕情和對(duì)母犬假孕進(jìn)行診斷奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)G01N33/558GK103149361SQ20131004782
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月6日
發(fā)明者司麗芳, 孔維麗, 熊建利, 任洪濤, 李健, 毛薇 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)