專利名稱：檢測自身免疫性疾病抗體的免疫印跡試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測多種自身免疫性疾病相關(guān)抗體的免疫印跡試劑盒，還涉及該免疫印跡試劑盒的制備方法及使用方法，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自身免疫性疾病(autoimmune diseases)是指機(jī)體對自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害所引起的疾病，WHO (World Health Organization,世界衛(wèi)生組織)曾指出其患病人數(shù)在占總?cè)巳旱?飛％，據(jù)權(quán)威統(tǒng)計(jì)，我國自身免疫性疾病患者的發(fā)病率在6000萬人以上。自身免疫性疾病好發(fā)于女性和中老年人，其特點(diǎn)是起病緩慢，病程長且反復(fù)發(fā)作，疾病的中晚期對健康危害很大，患者的生活質(zhì)量低，療效差，早期診斷有助于自身免疫性疾病的臨床控制。許多自身抗體在相關(guān)疾病的發(fā)病前一段時(shí)間就可從血清中檢測到。幾十年來，免疫學(xué)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多數(shù)自身免疫性疾病患者血清中存在著特異性自身抗體，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡的抗Sm抗體和抗dsDNA抗體，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的抗CCP抗體，干燥綜合征的抗SSA抗體和抗SSB抗體，I型糖尿病的抗GAD抗體、抗ICA抗體和抗IA-2A抗體，自身免疫性甲狀腺疾病的抗TG抗體、原發(fā)性膽汁性肝硬化的抗AMA-M2抗體，許多特異性自身抗體是自身免疫性疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)中重要的組成部分。系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、I型糖尿病、自身免疫性甲狀腺疾病、原發(fā)性膽汁性肝硬化等是常見的自身免疫疾病，其臨床表現(xiàn)的特點(diǎn)往往被患者忽視，因此，需要定期進(jìn)行體檢篩查。目前，國內(nèi)外臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域已有少數(shù)用于單一自身免疫性疾病相關(guān)抗體檢測的免疫印跡產(chǎn)品，但尚無用于多種自身免疫性疾病體檢篩查的免疫印跡產(chǎn)品。已有免疫印跡試劑基本采用SDS-PAGE技術(shù)將抗原按分子量大小轉(zhuǎn)移到印跡膜上，在此過程中許多抗原決定簇的構(gòu)象可能遭到破壞，不能與臨床樣本中的特異性抗體發(fā)生結(jié)合或發(fā)生非特異性結(jié)合，造成結(jié)果判斷錯(cuò)誤。并且，現(xiàn)有產(chǎn)品質(zhì)控體系不完善，不便于操作者對顯色結(jié)果進(jìn)行快速、直觀、準(zhǔn)確的判斷。

發(fā)明內(nèi)容
綜上所述，本發(fā)明的目的在于針對目前尚無用于多種自身免疫性疾病體檢篩查的免疫印跡產(chǎn)品，以及已有的免疫印跡試劑存在上述不足，而提出的一種檢測自身免疫性疾病抗體的免疫印跡試劑盒及其制備方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用如下的技術(shù)方案:
檢測自身免疫性疾病抗體的免疫印跡試劑盒，包括:反應(yīng)膜條、酶結(jié)合物、顯色底物、洗滌液、樣本稀釋液和終止液，其特征在于:所述的反應(yīng)膜條由載體和固定在載體上的硝酸纖維素膜或尼龍膜所組成，在所述的硝酸纖維素膜或尼龍膜上含有:分別由dsDNA、Sm/RNP、CCP, SSA, SSB、GAD、ICA、IA-2A、TG、AMA-M2共10種中的至少兩種天然或重組抗原包被而成的兩條以上平行的檢測線，I條包被濃度為30-50 μ g/ml的高濃度質(zhì)控帶，I條包被濃度為15-25 μ g/ml的中濃度質(zhì)控帶，及I條包被濃度為1_10 μ g/ml的低濃度質(zhì)控帶。所述的載體為雙面粘性的PVC板，正面與所述的硝酸纖維膜或尼龍膜固定粘接，背面固定粘接有透明的PET底襯板。所述的高濃度質(zhì)控帶、中等濃度質(zhì)控帶和低濃度質(zhì)控帶由人IgG,或抗鼠IgG或抗羊IgG劃線而成。所述的酶結(jié)合物為辣根過氧化酶標(biāo)記的鼠抗人IgG ;所述的顯色底物為四甲基聯(lián)苯胺；所述的洗滌液為20 X Tris緩沖液；所述樣本稀釋液為含封閉劑的Tris緩沖液；所述的終止液為0.1M/L硫酸。制備所述試劑盒的方法，包括有反應(yīng)膜條制備方法，其特征在于所述反應(yīng)膜條制備方法包括有以下步驟:
1)配制點(diǎn)樣溶液:將dsDNA、Sm/RNP、CCP, SSA, SSB、GAD、ICA、IA-2A、TG 和 AMA-M2 抗原，及人IgG、抗鼠IgG或抗羊IgG配制成相應(yīng)的包被濃度；
2)固定抗原:根據(jù)免疫印跡點(diǎn)樣器的大小，將硝酸纖維膜或尼龍膜裁成膜片，通過物理吸附和共價(jià)結(jié)合的方式，將I)中配置好的點(diǎn)樣溶液以一定的排列次序固定在膜片上，形成獨(dú)立的檢測線；
3)封閉:將膜片放在無關(guān)蛋白或血清的溶液中對其非點(diǎn)樣部位進(jìn)行封閉，所述的無關(guān)蛋白或血清包括脫脂奶粉、酪蛋白、牛血清白蛋白、飽和賴氨酸和小牛血清；
4)干燥:將封閉好的膜片條放入37°C恒溫箱中干燥2小時(shí)；
5)貼膜:將干燥好的膜片貼于雙面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用；
6)切膜:將5)中貼好的膜片按照獨(dú)立檢測線切成一定寬度的條帶；
7)組裝:通過模具，將6)中的條帶按次序貼于透明的PET底襯板上；
8)切條:用切條機(jī)將組裝好的條帶切成單人份反應(yīng)膜條。在2)步完成點(diǎn)樣后，將膜片從免疫印跡點(diǎn)樣器取出室溫下放置I小時(shí)。固定抗原和質(zhì)控的點(diǎn)樣量控制在10ng 30ng。質(zhì)控帶的寬度均為7mm,抗原條帶的寬度均為5mm。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
本發(fā)明通過一份臨床樣本和一次檢測反應(yīng)檢測多種自身抗體,克服單一自身抗體檢測靈敏度和特異性不足、數(shù)種疾病相關(guān)自身抗體逐一單獨(dú)檢測在操作上的繁瑣，大大提高檢測效率和結(jié)果判斷的準(zhǔn)確度。涉及的自身免疫性疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、I型糖尿病、自身免疫性甲狀腺疾病、原發(fā)性膽汁性肝硬化。另外還有:
1、反應(yīng)膜條上包被的抗原為從動(dòng)物組織中提取的天然抗原或采用昆蟲細(xì)胞或桿狀病毒真核表達(dá)的方式獲得的重組蛋白，提高了自身免疫疾病診斷的敏感性和特異性；
2、抗原包被采用全自動(dòng)點(diǎn)樣儀，保證膜條上質(zhì)控帶及各抗原帶位置的準(zhǔn)確性，且可根據(jù)檢測需求進(jìn)行合理排序，區(qū)別于傳統(tǒng)的SDS-PAGE技術(shù)按分子量大小將抗原依次分開轉(zhuǎn)移至印跡膜上，同時(shí)保證了抗原決定簇構(gòu)象的完整性；
3、單人份膜條上同時(shí)包被有10種抗原,可實(shí)現(xiàn)一份臨床樣本一次實(shí)驗(yàn)最多可同時(shí)檢測10種抗體，為多種自身免疫性疾病的臨床診斷提供血清學(xué)依據(jù)；
4、具有高濃度質(zhì)控帶、中濃度質(zhì)控帶和低濃度質(zhì)控帶，使結(jié)果判斷更為直觀準(zhǔn)確，為自身免疫性疾病的病程監(jiān)測及治療預(yù)后提供全面指導(dǎo)。


圖1為本發(fā)明所述試劑盒中反應(yīng)膜條上抗原及質(zhì)控帶分布示意 圖2為本發(fā)明所述試劑盒中反應(yīng)膜條上抗原及質(zhì)控帶截面示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種檢測多種自身免疫性疾病相關(guān)抗體的免疫印跡試劑盒及其制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，通過適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)而實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明所要求保護(hù)的技術(shù)方案之內(nèi)。本發(fā)明的產(chǎn)品及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的檢測自身免疫性疾病抗體的免疫印跡試劑盒包括:反應(yīng)膜條、酶結(jié)合物、顯色底物、洗滌液、樣本稀釋液和終止液；所述的反應(yīng)膜條由載體和固定在載體上的硝酸纖維素膜或尼龍膜所組成，在所述的硝酸纖維素膜或尼龍膜上含有:分別由dsDNA、Sm/RNP、CCP, SSA、SSB、GAD、ICA、IA-2A、TG、AMA-M2共10種天然或重組抗原包被而成的10條平行的檢測線f 10，I條包被濃度為30-50 μ g/ml的高濃度質(zhì)控帶11，I條包被濃度為15-25μ g/ml的中濃度質(zhì)控帶12，及I條包被濃度為1-10 μ g/ml的低濃度質(zhì)控帶13。實(shí)現(xiàn)單人份膜條上同時(shí)包被有10種抗原，可實(shí)現(xiàn)一份臨床樣本和一次檢測反應(yīng)檢測多種自身抗體，最多可同時(shí)檢測10種抗體，為多種自身免疫性疾病的臨床診斷提供血清學(xué)依據(jù)，如:自身免疫性疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、I型糖尿病、自身免疫性甲狀腺疾病、原發(fā)性膽汁性肝硬化。參照圖1和圖2中所示，所述反應(yīng)膜條的載體為雙面粘性的PVC板15，正面與形成檢測線和質(zhì)控帶之后的所述硝酸纖維膜或尼龍膜16固定粘接，背面固定粘接有透明的PET底襯板14。所述的高濃度質(zhì)控帶、中等濃度質(zhì)控帶和低濃度質(zhì)控帶由人IgG,或抗鼠IgG或抗羊IgG劃線而成。所述的酶結(jié)合物為辣根過氧化酶標(biāo)記的鼠抗人IgG ;所述的顯色底物為四甲基聯(lián)苯胺；所述的洗滌液為20XTris緩沖液；所述樣本稀釋液為含封閉劑的Tris緩沖液；所述的終止液為0.1M/L硫酸。本發(fā)明的檢測自身免疫性疾病抗體的免疫印跡試劑盒的制備方法，包括有反應(yīng)膜條制備方法，其特征在于所述反應(yīng)膜條制備方法包括有以下步驟:
1)配制點(diǎn)樣溶液:將dsDNA、Sm/RNP、CCP, SSA、SSB、GAD、ICA、IA-2A、TG 和 AMA-M2 抗原，及人IgG、抗鼠IgG或抗羊IgG質(zhì)控配制成相應(yīng)的包被濃度；
2)固定抗原:根據(jù)免疫印跡點(diǎn)樣器的大小，將硝酸纖維膜或尼龍膜裁成膜片，通過物理吸附和共價(jià)結(jié)合的方式，將I)中配置好的點(diǎn)樣溶液以一定的排列次序固定在膜片上，形成獨(dú)立的檢測線；固定抗原和質(zhì)控的點(diǎn)樣量控制在IOnglOng ;質(zhì)控帶的寬度均為7mm，抗原條帶的寬度均為5_ ;完成點(diǎn)樣后，將膜片從免疫印跡點(diǎn)樣器取出室溫下放置I小時(shí)。3)封閉:將膜片放在無關(guān)蛋白或血清的溶液中對其非點(diǎn)樣部位進(jìn)行封閉，所述的無關(guān)蛋白或血清包括脫脂奶粉、酪蛋白、牛血清白蛋白、飽和賴氨酸和小牛血清；優(yōu)選5%的脫脂奶粉，在室溫下封閉0.5小時(shí)。用經(jīng)20倍稀釋的濃縮洗滌液洗滌。4)干燥:將封閉好的膜片條放入37°C恒溫箱中干燥2小時(shí)；
5)貼膜:將干燥好的膜片貼于雙面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用；
6)切膜:將5)中貼好的膜片按照獨(dú)立檢測線切成一定寬度的條帶；其中，3條質(zhì)控帶的寬度均為7mm，10種抗原條帶的寬度均為5mm。7)組裝:通過模具，將6)中的條帶按次序貼于透明的PET底襯板上；
8)切條:用切條機(jī)將組裝好的條帶切成單人份反應(yīng)膜條，優(yōu)選寬度為2mm。本發(fā)明試劑盒的使用方法
樣品要求:人血清或EDTA、肝素或檸檬酸鹽抗凝的血漿。1、洗滌液配制:用19份蒸餾水稀釋I份20 X的濃縮洗滌液，混勻，備用。2、檢測步驟
1)將反應(yīng)膜條放入孵育盤(通用實(shí)驗(yàn)耗材)中，加入Iml的樣本稀釋液潤濕膜條，I分鐘后移棄稀釋液；
2)加入Iml已稀釋的樣本，置搖床輕搖，室溫孵育30分鐘，然后棄除已稀釋的樣本，不留殘液；
3)用1.5ml洗滌液洗滌反應(yīng)膜條，置搖床輕搖，每次5分鐘，洗滌完后棄除洗滌液，重復(fù)3次；
4)加入Iml酶結(jié)合物溶液，置搖床輕搖，室溫孵育30分鐘，棄除酶結(jié)合物溶液；
5)重復(fù)步驟3)；
6)加入Iml顯色底物溶液，置搖床輕搖，室溫避光孵育10分鐘，棄除底物溶液；
7)用1.5ml蒸懼水洗漆,置搖床輕搖，I分鐘后棄除蒸懼水；
8)加入Iml終止液,置搖床輕搖,室溫孵育5分鐘,棄除終止液；
9)取出反應(yīng)膜條，用吸水紙吸干其上的殘留液體；
3、結(jié)果判斷
反應(yīng)完成后，可采用目測、手工粘貼到掃描儀掃描固定卡然后借助特定的判讀軟件或使用全自動(dòng)的判讀分析儀器對檢測結(jié)果進(jìn)行判讀，結(jié)果可判斷為陰性、弱陽性、中等陽性、強(qiáng)陽性或輸出為量化的數(shù)值。
權(quán)利要求
1.檢測自身免疫性疾病抗體的免疫印跡試劑盒，包括:反應(yīng)膜條、酶結(jié)合物、顯色底物、洗滌液、樣本稀釋液和終止液，其特征在于:所述的反應(yīng)膜條由載體和固定在載體上的硝酸纖維素膜或尼龍膜所組成，在所述的硝酸纖維素膜或尼龍膜上含有:分別由dsDNA、Sm/RNP、CCP、SSA、SSB、GAD、ICA、IA-2A、TG、AMA-M2共10種中的至少兩種天然或重組抗原包被而成的兩條以上平行的檢測線，I條包被濃度為30-50 μ g/ml的高濃度質(zhì)控帶，I條包被濃度為15-25 μ g/ml的中濃度質(zhì)控帶，及I條包被濃度為1_10 μ g/ml的低濃度質(zhì)控帶。
2.根據(jù)專利要求I所述的試劑盒，其特征在于:所述的載體為雙面粘性的PVC板，正面與所述的硝酸纖維膜或尼龍膜固定粘接，背面固定粘接有透明的PET底襯板。
3.根據(jù)專利要求I所述的試劑盒，其特征在于:所述的高濃度質(zhì)控帶、中等濃度質(zhì)控帶和低濃度質(zhì)控帶由人IgG,或抗鼠IgG或抗羊IgG劃線而成。
4.根據(jù)專利要求I所述的試劑盒，其特征在于:所述的酶結(jié)合物為辣根過氧化酶標(biāo)記的鼠抗人IgG ;所述的顯色底物為四甲基聯(lián)苯胺；所述的洗滌液為20XTris緩沖液；所述樣本稀釋液為含封閉劑 的Tris緩沖液；所述的終止液為0.1M/L硫酸。
5.權(quán)利要求Γ4任一項(xiàng)所述試劑盒的制備方法，包括有反應(yīng)膜條制備方法，其特征在于所述反應(yīng)膜條制備方法包括有以下步驟: 1)配制點(diǎn)樣溶液:將dsDNA、Sm/RNP、CCP, SSA, SSB, GAD、ICA、ΙΑ-2Α、TG 和 AMA-M2 抗原，及人IgG、抗鼠IgG或抗羊IgG質(zhì)控配制成相應(yīng)的包被濃度； 2)固定抗原:根據(jù)免疫印跡點(diǎn)樣器的大小，將硝酸纖維膜或尼龍膜裁成膜片，通過物理吸附和共價(jià)結(jié)合的方式，將I)中配置好的點(diǎn)樣溶液以一定的排列次序固定在膜片上，形成獨(dú)立的檢測線； 3)封閉:將膜片放在無關(guān)蛋白或血清的溶液中對其非點(diǎn)樣部位進(jìn)行封閉，所述的無關(guān)蛋白或血清包括脫脂奶粉、酪蛋白、牛血清白蛋白、飽和賴氨酸和小牛血清； 4)干燥:將封閉好的膜片條放入37°C恒溫箱中干燥2小時(shí)； 5)貼膜:將干燥好的膜片貼于雙面粘性的PVC板的正面，PVC板的背面待用； 6)切膜:將5)中貼好的膜片按照獨(dú)立檢測線切成一定寬度的條帶； 7)組裝:通過模具，將6)中的條帶按次序貼于透明的PET底襯板上； 8)切條:用切條機(jī)將組裝好的條帶切成單人份反應(yīng)膜條。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于:所述的封閉用無關(guān)蛋白選用5%的脫脂奶粉，在室溫下封閉0.5小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于:在2)步完成點(diǎn)樣后，將膜片從免疫印跡點(diǎn)樣器取出室溫下放置I小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于:固定抗原和質(zhì)控的點(diǎn)樣量控制在10ng^30ngo
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于:質(zhì)控帶的寬度均為7mm，抗原條帶的寬度均為5mm。
全文摘要
檢測自身免疫性疾病抗體的免疫印跡試劑盒及其制備方法，涉及一種檢測多種自身免疫性疾病相關(guān)抗體的免疫印跡試劑盒，解決目前尚無用于多種自身免疫性疾病體檢篩查的免疫印跡產(chǎn)品的技術(shù)不足；在所述的硝酸纖維素膜或尼龍膜上含有分別由dsDNA、Sm/RNP、CCP、SSA、SSB、GAD、ICA、IA-2A、TG、AMA-M2共10種中的至少兩種天然或重組抗原包被而成的兩條以上平行的檢測線，1條高濃度質(zhì)控帶，1條中濃度質(zhì)控帶，及1條低濃度質(zhì)控帶。克服單一自身抗體檢測靈敏度和特異性不足、數(shù)種疾病相關(guān)自身抗體逐一單獨(dú)檢測在操作上的繁瑣，大大提高檢測效率和結(jié)果判斷的準(zhǔn)確度。
文檔編號G01N33/531GK103105489SQ20131002474
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月23日
發(fā)明者胡鹍輝, 陽輝, 劉清波, 何林 申請人:深圳市亞輝龍生物科技有限公司