專利名稱：一種正品半夏的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及正品半夏的檢測方法，屬于中藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
半夏來源于天南星科植物半夏Pinellia ternata (Thunb. ) breit.的干燥塊莖， 呈類球形，有的稍偏斜少數(shù)為長遠球形，直徑f1. 5cm;表面白色或淺黃色，頂端有凹陷的莖痕，周圍密布麻點狀根痕；下面鈍圓，較光滑；質(zhì)堅實，斷面潔白，富粉性，粉末嗅之嗆鼻； 氣微，味辛辣、麻舌而刺喉。
近幾年半夏的市場需求量持續(xù)增加，野生資源逐年減少，人工栽培發(fā)展緩慢，使得半夏資源蘊藏量和產(chǎn)量都在大幅下降。導(dǎo)致市場上出現(xiàn)了很多偽品，給半夏藥材的質(zhì)量、用藥的安全性及有效性帶來了很大的沖擊。
通過對中藥材市場的調(diào)研發(fā)現(xiàn)，半夏的偽品主要為水半夏、虎掌南星和禹白附。
水半夏，為天南星科植物鞭檐的干燥塊莖。呈近圓形、橢圓形、圓錐形或倒卵形，直徑O. 5^1. 5cm，高O. 8 3cm。表面類白色或淡黃色，不平滑，遍體隱約可見狀根痕；上端類圓形，常用有偏斜而凸起的葉痕或芽痕，黃棕色，下端有點兒略尖。質(zhì)堅實，斷面白色，粉性。氣微，味辛辣，麻舌而刺喉。
虎掌南星，為天南星科植物掌葉半夏的干燥塊莖。呈近球形，直徑3 4cm，外皮粗糙，褐色，剝?nèi)ネ馄轭惏咨虻攸S色，頂端有深陷的莖痕，有的周邊生有數(shù)個扁球狀塊莖，形如虎掌，氣微，味辛辣。
禹白附，為天南星科植物獨角蓮的干燥塊莖。呈橢圓形或卵圓形，直徑f2cm，高 2 5cm。表面白色或黃白色，略粗糙，有環(huán)紋及根痕，頂端具凹陷莖痕，下端鈍圓。質(zhì)堅硬，難折斷，斷面類白色，粉性。氣微，味淡，嚼之麻辣刺舌。
目前，正品半夏的有效檢測方法是傳統(tǒng)形態(tài)特征和理化特性的鑒別方法，其非常復(fù)雜并具有一定的局限性。發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種正品半夏的檢測方法。
本發(fā)明正品半夏的檢測方法，包括如下步驟
(I)取待檢樣品，加f 3倍重量的水，水溫為0°C飛。C，勻漿，離心，得上清液；
(2)用SDS-PAGE電泳方法檢測步驟(I)的上清液，其在Rm值O. 208、0.232、 O. 312,0. 335,0. 383,0. 405,0. 429,0. 491,0. 615,0. 85 和 / 或 O. 897 有譜帶，所述電泳濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度12%。
其中，步驟(I)中，所述冰水重量為待檢樣品重量的2倍，所述離心為2000r/min離心 2min。
其中，步驟(2)中，所述上清液在Rm 值 O. 208,0. 232,0. 312,0. 335,0. 383,0. 405、 O. 429,0. 491,0. 615,0. 85 和 O. 897 有譜帶。
SDS-PAGE電泳十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
Rm值相對遷移率或者相對泳動率=蛋白絕對遷移距離/溴酚藍遷移距離。
其中，所述步驟(2)包括如下步驟
I)取上清液，加入O. Γ1倍體積樣品緩沖液，混勻，離心，得上樣液，所述樣品緩沖液是lmol/1 Tris-鹽酸緩沖液，并添加有O. 15mol/l SDS和O. 03mol/l溴酚藍；
2)取步驟I)的上樣液上樣，電泳，固定，染色，洗脫即可，所述電泳緩沖液為 Tris-甘氨酸緩沖液。
其中，步驟I)中，所述樣品緩沖液為上清液的O.1倍；混勻后在沸水中加熱3min ； 所述離心的條件是4000r/min離心離心30s。
其中，步驟I)中，所述樣品緩沖液還添加有20% (v/v)甘油和10% (ν/ν) β -巰基乙醇。
其中，步驟2)中，所述固定采用的固定液為10%的三氯醋酸溶液；所述染色采用的染色液為考馬氏亮藍染色液；所述洗脫采用的洗脫液為考馬氏亮藍洗脫液。
優(yōu)選地，所述染色是用考馬氏亮藍染色液浸泡凝膠，50°C 60°C水浴加熱15min， 并不斷振蕩，放冷后傾去染色液。
本發(fā)明方法可以準確檢測正品半夏，準確度高，檢測方法簡單、快速，可以替代傳統(tǒng)檢測方法，具有良好的應(yīng)用前景。
顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過實施例形 式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。


圖1樣品處理方法檢測結(jié)果，其中，泳道I 9 :方法I 9，M :標準蛋白；
圖2染色方法檢測結(jié)果；
圖3待見樣品檢測結(jié)果；
圖4待見樣品檢測結(jié)果；
圖5待見樣品檢測結(jié)果。
具體實施方式
試劑
A液1. 5MTris-HCL溶液(分離膠儲存液)
精密稱取Tris堿(分析純)18. 15g，加適量的超純水溶解，用濃鹽酸(分析純)調(diào) PH值至8.8，加超純水定容至10011^。貼上標貼，4°C保存。此溶液有效使用期限為三個月。
B液IMTris-HCL溶液(濃縮膠儲存液)
精密稱取Tris堿(分析純)12.1g,加適量的超純水溶解，用濃鹽酸(分析純)調(diào) pH值至6. 8，加超純水定容至100mL。貼上標貼，4°C保存。此溶液有效使用期限為三個月。
C液30%丙烯酰胺儲存液
精密稱取丙烯酰胺(Acr，分析純)29. 2g、N，N’ -甲叉雙丙烯酰胺(分析純)O. Sg, 加適量的超純水溶解，再定容至IOOmL,用濾紙過濾，貼上標貼，避光4°C保存。此溶液有效使用期限為三個月。
D 液10%SDS 溶液
精密稱取SDS (分析純)10g，用超純水溶解至IOOmL,貼上標貼，室溫儲存。此溶液有效使用期限為三個月。
E液10%過硫酸胺(AP)溶液
精密稱取過硫酸胺(分析純)10g，用超純水溶解至IOOmL,貼上標貼，_20°C保存。 此溶液最好于臨用前配置。
F 液1%TEMED 溶液
精密吸取T液lmL，加超純水定容至IOOmL,置于棕色瓶中于4°C保存。
取上述原料，配制濃度為5%濃縮膠和濃度為12%的分離膠。
電泳緩沖液精密稱取稱取Tris堿(分析純)6g、甘氨酸(分析純)28. 8g、SDS (分析純)10g，加超純水定容至IOOOmL,臨用前加超純水稀釋10倍，貼上標貼，室溫儲存。
樣品緩沖液精密稱取SDS(分析純)4g，溴酚藍(分析純)0. 2g,加20mL甘油 (分析純)，IOmLlMTris-HCl (ρΗ6· 8)溶液，IOmL β -巰基乙醇(分析純)，加超純水溶解至 IOOmL,貼上標貼，室溫儲存。
考馬氏亮藍染色液精密稱取考馬氏亮藍R — 250 (分析純)lg，加甲醇(分析純)200mL,冰醋酸(分析純)50mL,以超純水定容至500mL，貼上標貼，室溫儲存。
考馬氏亮藍洗脫液量取乙醇(分析純)250mL,冰醋酸(分析純)80mL,加超純水定容至IOOOmL,貼上標貼，室溫儲存。
染色固定液10%的三氯醋酸溶液。
實施例1本發(fā)明檢測方法
1、檢測方法
(I)供試品的制備
稱取半夏藥材2g，加冰水4mL，在研缽中快速研磨，立即轉(zhuǎn)移至離心管中，于 2000r/min條件下離心2min ；
取上清液50 μ 1，加樣品 緩沖液5 μ 1，混勻后于沸水中加熱3min，于4000r/min條件下離心30s，冷凍儲存?zhèn)溆谩?br> (2)電泳
制備濃縮膠和分尚膠，待分尚膠與濃縮膠充分凝固后，在電泳槽中加入稀釋10倍的電泳緩沖液，加入量以沒過玻璃板為準。然后用移液槍吸取20μ I樣品，注入加樣孔中。 接通電源，起始電壓為100V，當(dāng)指示劑進入分離膠后，電壓調(diào)至220V進行恒壓電泳。待指示劑行至電泳槽下端Icm處時停止電泳。
(3)固定、染色及脫色
電泳停止后，取出玻璃板，將凝膠慢慢剝離下來，置于10%的三氯醋酸染色固定液，放置30min后除去固定液，用純凈水沖洗；
用考馬氏亮藍染色液浸泡凝膠，50°C 60°C水浴加熱15min，并不斷振蕩，放冷后傾去染色液，先用蒸餾水漂洗幾次，然后反復(fù)用洗脫液進行洗脫，最后再用蒸餾水沖洗。
(4)計算 Rm 值
檢測凝膠的電泳條帶在Rm 值 O. 208、O. 232、O. 312、O. 335、O. 383、O. 405、O. 429、 O. 491,0. 615,0. 85 和 / 或 O. 897 否有譜帶。
實施例2本發(fā)明方法的參數(shù)篩選實驗
1、樣品處理方法的優(yōu)選
樣品處理方法按照如下方法廣9，其余方法同實施例1。
方法1:取上清液50μ 1，加樣品緩沖液50μ 1，混勻后于沸水中加熱3min，于 4000r/min條件下離心30s。
方法2 :取上清液50 μ 1，加樣品緩沖液50 μ I，不加熱處理，于4000r/min條件下離心30s。
方法3 :取上清液50μ I,加樣品緩沖液50μ I,再加loading buffer5 μ I,不加熱處理，于4000r/min條件下離心30s。
方法4 :取上清液50 μ I,加樣品緩沖液50 μ I,再加loading buffer5 μ I,混勻后于沸水中加熱3min，于4000r/min條件下離心30s。
方法5 :取上清液50 μ I,加β -巰基乙醇100 μ I,再加loading buffer5yl,混勻后于沸水中加熱3min，于4000r/min條件下離 心30s。
方法6 :取上清液50 μ I,加β -巰基乙醇50 μ I,再加loading buffer5yl,混勻后于沸水中加熱3min，于4000r/min條件下離心30s。
方法7 :取上清液50 μ I,加β -巰基乙醇50 μ I,再加loading buffer5yl,不加熱處理,于4000r/min條件下離心30s。
方法8 :取上清液50 μ I,加loading buffer5 μ I,混勻后于沸水中加熱3min,于 4000r/min條件下離心30s。
方法9 :取上清液50 μ I,加loading buffer5 μ I,不加熱處理,于4000r/min條件下離心30s。
如圖1所示，Marker的泳道以及本發(fā)明方法處理的樣品的泳道(泳道f 4和8、) 的條帶均清楚，尤其是泳道8的條帶最為清楚，而其他處理方法制備的樣品的泳道(泳道 5^7)則出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，說明上述方法f 4和8、的樣品處理方法均是有效的，其中，以方法 8的樣品處理方法最優(yōu)。
2、染色方法
染色方法按照如下方法f 9，其余方法同實施例1。
方法1:用考馬氏亮藍染色液浸泡凝膠3h，并且不斷振蕩，傾去染色液，先用蒸餾水漂洗幾次，然后反復(fù)用洗脫液進行洗脫，最后再用蒸餾水沖洗。
方法2 :用考馬氏亮藍染色液浸泡凝膠，50°C 60°C水浴加熱15min，并不斷振蕩， 放冷后傾去染色液，先用蒸餾水漂洗幾次，然后反復(fù)用洗脫液進行洗脫，最后再用蒸餾水沖洗。
方法3 :用考馬氏亮藍染色液浸泡凝膠，置于微波爐(中火)中加熱3min，取出，放冷后傾去染色液，先用蒸餾水漂洗幾次，然后反復(fù)用洗脫液進行洗脫，最后再用蒸餾水沖洗。
結(jié)果如圖2所示，本發(fā)明用考馬斯亮藍的方法可以有效染色，其中，染色方法I時間較長，且染色后不易洗脫，條帶不夠清晰；染色方法3須經(jīng)微波爐處理，染色后雖易洗脫， 條帶也較清晰，但條帶多因微波加熱而發(fā)生變形，另外加熱過程中凝膠邊緣多皺縮；染色方法2染色較快，較易洗脫，并且條帶清晰，是最優(yōu)的染色方法。
以下以實驗例的方式說明本發(fā)明的有益效果
實驗例I用本發(fā)明方法檢測待檢樣品
實驗材料從市場購買的4批藥材，第I批藥材9份(BI B9)，第2批藥材9份 (SI S9)，第3批藥材16份(NI N16)，第4批藥材11份(Fl F11)，分別用本發(fā)明方法和傳統(tǒng)檢測方法檢測。
1、檢測方法
(I)本發(fā)明檢測
稱取樣品2g，加冰水4mL，在研缽中快速研磨，立即轉(zhuǎn)移至離心管中，于2000r/min 條件下離心2min,取上清液50 μ I,加樣品緩沖液50 μ I,再加loading buffer5 μ I,混勻后于沸水中加熱3min,于4000r/min條件下離心30s,冷凍儲存?zhèn)溆谩?br> 待分尚膠與濃縮膠充分凝固后，在電泳槽中加入稀釋10倍的電泳緩沖液,加入量以沒過玻璃板為準。然后用移液槍吸取20μ I樣品，注入加樣孔中。接通電源，起始電壓為 100V,當(dāng)指示劑進入分離膠后，電壓調(diào)至220V進行恒壓電泳。待指示劑行至電泳槽下端Icm 處時停止電泳。
電泳停止后，取出玻璃板，將凝膠慢慢剝離下來，置于10%的三氯醋酸染色固定液中，放置30min后除去固定液,用純凈水沖洗。然后用考馬氏亮藍染色液浸泡凝膠,水浴加熱15min，并不斷振蕩，放冷后傾去染色液，先用蒸餾水漂洗幾次，然后反復(fù)用洗脫液進行洗脫，最后再用蒸餾水沖洗。
檢測凝膠的電泳條帶在Rm 為 O. 208、O. 232、O. 312、O. 335、O. 383、O. 405、O. 429、 O. 491,0. 615,0. 85 和 / 或 O. 897 否有譜帶。
(2)傳統(tǒng)檢測方法
形態(tài)和理化性質(zhì)鑒定。
2實驗結(jié)果
( I)本發(fā)明方法檢測結(jié)果
檢測結(jié)果如表I所示
表I本發(fā)明方法的檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種正品半夏的檢測方法，其特征在于包括如下步驟(1)取待檢樣品，加廣3倍重量的水，水溫(TC飛。C，勻漿，離心，得上清液；(2)用SDS-PAGE電泳方法檢測步驟(I)的上清液，其在Rm值O.208,0. 232、0· 312、O.335、O. 383、O. 405、O. 429、0. 491、0. 615、0. 85 和 / 或 O. 897 有譜帶，所述電泳的濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于步驟(I)中，所述水為待檢樣品重量的2倍；所述離心為2000r/min離心2min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于步驟(2)中，所述上清液在Rm值O.208,0. 232,0. 312,0. 335,0. 383,0. 405,0. 429,0. 491,0. 615,0. 85 和 O. 897 有譜帶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述步驟(2)包含如下步驟1)將上清液加入O.Γ1倍體積樣品緩沖液，混勻，離心，得上樣液，所述樣品緩沖液是 lmol/1 Tris-HCl 緩沖液，且添加有 0.03mol/l 溴酚藍和 O. 15mol/l SDS ；2)取步驟I)的上樣液上樣，電泳，固定，染色，洗脫即可，所述電泳緩沖液為Tris-甘氨酸緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于步驟I)中，所述樣品緩沖液為上清液的O.1倍；所述上清液與樣品緩沖液混勻之后，先在沸水中加熱3min，再離心；所述離心是 4000r/min 離心 30s。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于步驟I)中，所述樣品緩沖液還添加有20% (v/v)甘油和10% (ν/ν) β-巰基乙醇。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于步驟2)中，所述固定采用的固定液為10%(w/w)三氯醋酸溶液；所述染色采用的染色液為考馬氏亮藍染色液；所述洗脫采用的洗脫液為考馬氏亮藍洗脫液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于所述染色是用考馬氏亮藍染色液浸泡凝膠，5(T60°C水浴加熱15min，并不斷振蕩，冷卻后傾去染色液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種正品半夏的檢測方法，包括如下步驟(1)取待檢樣品，加1~3倍重量的水，水溫0℃~5℃，勻漿，離心，得上清液；(2)用SDS-PAGE電泳方法檢測步驟(1)的上清液，在Rm值0.208、0.232、0.312、0.335、0.383、0.405、0.429、0.491、0.615、0.85和/或0.897有譜帶，所述電泳的濃縮膠濃度為5%，分離膠為濃度12%。本發(fā)明正品半夏的檢測方法準確度高，操作方便，成本低廉，市場應(yīng)用前景良好。
文檔編號G01N27/447GK103048373SQ20131001931
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月18日
發(fā)明者李敏, 盧道會, 楊小艷 申請人:成都中醫(yī)藥大學(xué)