抗spla2-x抗體和其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的分離抗體和其用途。
【專利說(shuō)明】抗SPLA2-X抗體和其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及新穎的針對(duì)人X型分泌型磷脂酶A2(sPLA2-X)的抗體和其在診斷和治 療方法中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 分泌型磷脂酶A2(sPLA2)形成了結(jié)構(gòu)相關(guān)的酶的一個(gè)家族，這些酶催化磷脂的 sn-2脂肪?；I發(fā)生水解，從而釋放游離脂肪酸和溶血磷脂。通過(guò)催化這個(gè)反應(yīng)，sPLA2 酶在多種生物過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，所述生物過(guò)程包括細(xì)胞膜的穩(wěn)態(tài)平衡、脂質(zhì)消化、 宿主防御、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和脂質(zhì)介體（例如類(lèi)二十烷酸和溶血磷脂衍生物）產(chǎn)生（Valentin 等人 2000, Bioch.Biophys. Act. 59-70 ;Lambeau，G?和 Gelb，M.H. 2008, Annu. Rev. Biochem. 77, 495-520)。這個(gè)家族包括11個(gè)成員/同種型，命名為sPLA2-IB、sPLA2-IIA、 sPLA2-IIC、sPLA2-IID、sPLA2-IIE、sPLA2-IIF、sPLA2-III、sPLA2-V、sPLA2-X、SPLA2-XIIA 和 SPLA2-XIIB。
[0003] 在蛋白質(zhì)層面對(duì)具體同種型的定量已被證明是困難的，因?yàn)槊富钚允穷?lèi)似的并且 不存在同種型特異性SPLA2抗體。
[0004] Nevalainen等人開(kāi)發(fā)了一種針對(duì)SPLA2-X的抗體，其應(yīng)用在時(shí)間分辨熒光免疫分 析（TR-FIA)中。這種多克隆抗體是通過(guò)用重組人類(lèi)SPLA2-X蛋白對(duì)兔進(jìn)行免疫來(lái)獲得的。 TR-FIA的分析靈敏度被描述為2 ng/ml。在來(lái)自膿毒性休克患者和健康血液供體的血清樣 品中分析SPLA2-X水平：作者發(fā)現(xiàn)，在兩種類(lèi)型的樣品中，SPLA2-X的血清濃度都低于所述 測(cè)試的分析靈敏度。
[0005] Santa Cruz Biotechnology 以編號(hào) sc-365730 提供了一種單克隆抗體 H-9。根據(jù) 發(fā)明人所獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，H-9抗體具有約9. 1(T9 M的結(jié)合人類(lèi)SPLA2-X的Kd(參看實(shí)施 例）。
[0006] 當(dāng)前需要針對(duì)SPLA2-X的抗體，其允許對(duì)生物樣品、例如血清樣品中的SPLA2-X進(jìn) 行更精確且更靈敏的檢測(cè)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的一個(gè)目的是一種針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的分離抗體，其中所述抗體具有小于 1(T9M的結(jié)合人類(lèi)SPLA2-X的Kd。
[0008] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的分離抗體包含：重鏈可變區(qū)，所述重 鏈可變區(qū)包含至少一個(gè)以下⑶R :
[0009] VH-CDR1 : GFTFSN (SEQ ID NO : 1)或 GYTFTN (SEQ ID NO : 2)； VH-CDR2:TISSGGDDTY(SEQ ID N0:3)或 WIKTNTGEPT(SEQ ID N0:4);和
[0010] VH-CDR3:PQLGP(SEQ ID N0:5)或 GNYYRPRRYFDY(SEQ ID N0:6)，
[0011] 或具有與SEQ ID NO: 1-6具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R，
[0012] 或其中輕鏈可變區(qū)包含至少一個(gè)以下⑶R :
[0013] VL-CDR1:RSSKSLLHSNGITYLY(SEQ ID N0:7)或 RASENLYSNLA(SEQ ID N0:8);
[0014] VL-CDR2:YMSNLAS(SEQ ID N0:9)或 AATNLAD(SEQ ID N0:10);和
[0015] VL-CDR3:MQSLEYPLT(SEQ ID N0:11)或 QHFYVTPYT(SEQ ID N0:12)，
[0016] 或具有與SEQ ID NO: 7-12具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R。
[0017] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的分離抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈 可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含上文所定義的CDR中的至少一個(gè)并且所述輕鏈可變區(qū)包含上 文所定義的⑶R中的至少一個(gè)。
[0018] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的分離抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈 可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含上文所定義的CDR并且所述輕鏈可變區(qū)包含上文所定義的 CDR。
[0019] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的分離抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈 可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含以下 CDR:GFTFSN(SEQ ID N0:1)、TISSGGDDTY(SEQ ID N0:3) 和 PQLGP(SEQ ID N0:5)，并且所述輕鏈可變區(qū)包含以下 CDR:RSSKSLLHSNGITYLY(SEQ ID 勵(lì):7)、￥]^145(5￡〇10勵(lì):9)和]\^51^￥?1^(5￡〇10勵(lì)：11)，或具有與所述5￡〇10勵(lì)：1、 3、 5、7、9、11具有至少60 %同一性的氨基酸序列的任何⑶R。
[0020] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的分離抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈 可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含以下 CDR:GYTFTN(SEQ ID N0:2)、WIKTNTGEPT(SEQ ID N0:4) 和 GNYYRPRRYFDY(SEQ ID N0:6)，并且所述輕鏈可變區(qū)包含以下 CDR:RASENLYSNLA(SEQ ID N0:8)、AATNLAD(SEQ ID N0:10)和QHFYVTPYT(SEQ ID N0:12)，或具有與所述SEQ ID N0:2、 4、 6、8、10、12具有至少60 %同一性的氨基酸序列的任何⑶R。
[0021] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的分離抗體包含編碼重鏈可變區(qū)的 氨基酸序列SEQ ID N0:13或SEQ ID N0:15,和編碼輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列SEQ ID N0:14 或SEQ ID NO: 16,或具有與所述SEQ ID NO: 13-16具有至少60%同一性的氨基酸序列的任 何序列。
[0022] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種表達(dá)載體，其包含SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID NO: 19和SEQ ID N0:20中的至少一個(gè)、或具有與所述SEQ ID NO: 17-20具有至少60% 同一性的核酸序列的任何序列。
[0023] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是產(chǎn)生針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的抗體的雜交瘤細(xì)胞系，登記為 CNCM 1-4523 和 CNCM 1-4524。
[0024] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種組合物，其包含上文所定義的針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的抗 體。
[0025] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是上文所定義的針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的抗體，其用于治療 SPLA2-X相關(guān)病狀，其中所述抗體抑制內(nèi)源SPLA2-X的活性。
[0026] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是上文所定義的針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的抗體，其用于檢測(cè)生物 樣品中的SPLA2-X。
[0027] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種體外診斷或預(yù)后分析，其用于使用上文所定義的針對(duì) 人類(lèi)SPLA2-X的抗體測(cè)定生物樣品中的SPLA2-X的存在。
[0028] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述體外診斷或預(yù)后分析是夾心ELISA，其使用抗體8D9作為 包被抗體并且使用抗體9C12作為暴露抗體。
[0029] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種試劑盒，其包含至少一種上文所定義的針對(duì)人類(lèi) SPLA2-X的抗體。
[0030] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒包含抗體8D9和抗體9C12。

【具體實(shí)施方式】
[0031] 發(fā)明人開(kāi)發(fā)了新穎的針對(duì)SPLA2-X的抗體，其對(duì)SPLA2-X顯示了比現(xiàn)有抗體更佳 的親和力并且允許對(duì)生物樣品中的SPLA2-X進(jìn)行更精確且更靈敏的檢測(cè)，如實(shí)施例中所 /_J、i 〇
[0032] 此外，發(fā)明人提供了針對(duì)SPLA2-X的單克隆抗體，其提供以下優(yōu)勢(shì)：（i)比多克隆 抗體更具特異性，和（ii)由于和單克隆本質(zhì)相關(guān)聯(lián)的結(jié)果的可重現(xiàn)性，允許所述抗體的工 業(yè)應(yīng)用。
[0033] 定義
[0034] SPLA2-X是sPLA2家族的一個(gè)同種型。人類(lèi)SPLA2-X蛋白的完整氨基酸序列（SEQ ID N0:21) (GenBank 登錄號(hào) NP 003552)是：
[0035] MGPLPVCLPMLLLLLPSLLLLLLLPGPGSG (信號(hào)肽）
[0036] EASRILRVHRR (前肽）
[0037] GILELAGTVGCVGPRTPIAYMKYGCFCGLGGHGQPRDAIDWCCHGHDCCYTRAEEAGCSPKTERYSWQC VNQSVLCGPAENKCQELLCKCDQEIANCLAQTEYNLKYLFYPQFLCEPDSPKCD (成熟蛋白）
[0038] 如本文所使用的術(shù)語(yǔ)"抗體"（Ab)包括單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體 (例如雙特異性抗體）和抗體片段，條件是這些抗體片段展現(xiàn)所期望的生物活性。術(shù)語(yǔ)"免 疫球蛋白"（Ig)和"抗體"在本文中是互換使用的。
[0039] "分離抗體"是已經(jīng)從其天然環(huán)境的組分中分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的 污染組分是將會(huì)干擾所述抗體的診斷或治療應(yīng)用的材料，并且可包括酶、激素和其它蛋白 質(zhì)類(lèi)或非蛋白質(zhì)類(lèi)組分。在優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體（1)被純化成大于95重量％的抗體，并 且最優(yōu)選地超過(guò)99重量％，如通過(guò)Lowry法所測(cè)定；（2)被純化到足以通過(guò)使用轉(zhuǎn)杯式序 列分析儀獲得N端或內(nèi)部氨基酸序列的至少15個(gè)殘基的程度；或（3)被純化成均質(zhì)，如通 過(guò)SDS-PAGE在還原或非還原條件下并且使用考馬斯藍(lán)（Coomassie blue)或優(yōu)選使用銀染 色法所顯示。分離抗體包括在重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體，因?yàn)榭贵w的天然環(huán)境的至少一種組 分將不存在。然而，分離抗體通常將通過(guò)至少一個(gè)純化步驟制備。
[0040] 基本的四鏈抗體單位是由兩個(gè)相同輕（L)鏈和兩個(gè)相同重（H)鏈構(gòu)成的異四聚體 糖蛋白。來(lái)自任何脊椎動(dòng)物物種的L鏈可以基于其恒定域（CL)的氨基酸序列被歸類(lèi)為兩個(gè) 明顯不同的類(lèi)型（稱為k ([K])和A ([ A ]))中的一個(gè)。取決于其重鏈的恒定域（CH)的氨 基酸序列，免疫球蛋白可以被歸類(lèi)為不同的類(lèi)別或同型。免疫球蛋白有5個(gè)類(lèi)別：IgA、IgD、 IgE、IgG 和 IgM，其分別具有命名為 a ([a])、6 ([6])、e ([e])、y(|>])和 y (|>]) 的重鏈。[Y ]和[a ]類(lèi)基于CH序列和功能的相對(duì)較小差異進(jìn)一步分成子類(lèi)，例如，人表達(dá) 以下子類(lèi)：IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。每個(gè)L鏈都通過(guò)一個(gè)共價(jià)二硫鍵連接到 H鏈上，而兩個(gè)H鏈則通過(guò)兩個(gè)或多個(gè)二硫鍵（取決于H鏈同型）彼此連接。每個(gè)H和L鏈 也都具有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫橋。每個(gè)H鏈都在N端具有可變域（VH)，隨后是3個(gè)恒定域 (CH)(對(duì)于[a ]和[Y ]鏈中的每一者來(lái)說(shuō)）和4個(gè)CH域（對(duì)于[y ]和[e ]同型來(lái)說(shuō)）。 每個(gè)L鏈都在N端具有可變域（VL)，隨后是在其另一端的恒定域（CL)。VL與VH對(duì)齊，并 且CL與重鏈的第一個(gè)恒定域（CH1)對(duì)齊。認(rèn)為特定氨基酸殘基形成輕鏈可變域與重鏈可 變域之間的界面。VH與VL的配對(duì)一起形成單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。IgM抗體由與額外的被稱 為J鏈的多肽在一起的5個(gè)基本的異四聚體單位組成，并且因此含有10個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)， 而分泌型IgA抗體可以聚合形成多價(jià)聚集體，所述聚集體包含與J鏈在一起的2-5個(gè)基本 的4鏈單位。就IgG來(lái)說(shuō)，4鏈單位通常是約150, 000道爾頓。關(guān)于不同類(lèi)別的抗體的結(jié)構(gòu) 和性質(zhì)，例如可以參看Basic and Clinical Immunology,第 8版，Daniel P.Stites，Abba I. Terr 和 Tristram G. Parslow (編），Appleton&Lange, Norwalk, Conn.，1994，第 71 頁(yè)和第 r> .~tV. b早。
[0041] 術(shù)語(yǔ)"可變"是指在抗體之間，V結(jié)構(gòu)域的某些區(qū)段在序列上大規(guī)模不同。V結(jié)構(gòu) 域調(diào)節(jié)抗原結(jié)合并且規(guī)定特定抗體對(duì)其特定抗原的特異性。然而，可變性在可變域的110 個(gè)氨基酸的鏈段之間并不是均勻分布的。實(shí)際上，V區(qū)是由15-30個(gè)氨基酸的被稱為框架區(qū) (FR)的相對(duì)不變的鏈段組成，所述FR被各自有9-12氨基酸長(zhǎng)的被稱為"高變區(qū)"的變異性 極高的較短區(qū)域隔開(kāi)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含4個(gè)FR，所述FR主要采取[0 ]折 疊構(gòu)形并且由3個(gè)高變區(qū)連接，所述高變區(qū)形成環(huán)，所述環(huán)連接[0]折疊結(jié)構(gòu)并且在一些 情況下形成[0]折疊結(jié)構(gòu)的一部分。每個(gè)鏈中的高變區(qū)通過(guò)FR緊靠在一起，并且與來(lái)自另 一條鏈的高變區(qū)一起形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)（參看Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，Md. (1991))。恒定域并不直接參與到抗體和抗原的結(jié)合中，但是展現(xiàn)各 種效應(yīng)子功能，例如使抗體參與到抗體依賴性細(xì)胞毒性（ADCC)中。
[0042] 術(shù)語(yǔ)"高變區(qū)"在本文中使用時(shí)是指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高 變區(qū)通常包含來(lái)自"互補(bǔ)決定區(qū)"或"⑶R"的氨基酸殘基（例如，當(dāng)根據(jù)Kabat編號(hào)系 統(tǒng)編號(hào)時(shí)，在VL的大約殘基24-34 (LI)、50-56 (L2)和89-97 (L3)周?chē)?，和在VH的大 約 31-35(H1)、50_65(H2)和 95-102(H3)周?chē)?；Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，Md. (1991));和/或來(lái)自"高變環(huán)"的那些殘基（例如，當(dāng)根據(jù) Chothia編號(hào)系統(tǒng)編號(hào)時(shí)，VL中的殘基24-34(Ll)、50-56(L2)和89-97(L3)，和VH中的 26-32(Hl)、52-56(H2)和 95-101 (H3) ;Chothia 和 Lesk，J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)); 和/或來(lái)自"高變環(huán)"/CDR的那些殘基（例如，當(dāng)根據(jù)MGT編號(hào)系統(tǒng)編號(hào)時(shí)，VL中 的殘基 27-38 (L1)、56-65(L2)和 105-120 (L3)，和 VH 中的 27-38(H1)、56-65(H2)和 105-120(H3);Lefranc，M.P?等人 Nucl.Acids Res.27:209-212(1999)，Ruiz，M?等人 Nucl.Acids Res.28:219_221(2000))。當(dāng)根據(jù) AHo(Honneger，A?和 Plunkthun，A.J.Mol. Biol. 309:657-670(2001))編號(hào)時(shí)，抗體任選地在一個(gè)或多個(gè)以下點(diǎn)處具有對(duì)稱插入物： VL 中的 28、36(L1)、63、74-75(L2)和 123(L3)，和 VH 中的 28、36(H1)、63、74-75(H2)和 123(H3)。
[0043] 本文使用的術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"是指從基本上同質(zhì)的抗體的群體獲得的抗體，即除 了可以少量存在的可能的天然存在的突變以外，所述群體中包含的各抗體是相同的。單克 隆抗體是高特異性的，其針對(duì)單個(gè)抗原位點(diǎn)。此外，與包含針對(duì)不同決定簇（表位）的不同 抗體的多克隆抗體制劑相比，每個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。除了其特異性以 夕卜，單克隆抗體的有利之處還在于其可以在不被其它抗體污染的情況下合成。修飾語(yǔ)"單克 隆"不應(yīng)解釋為必需通過(guò)任何特定方法產(chǎn)生所述抗體。舉例來(lái)說(shuō)，可用于本發(fā)明的單克隆抗 體可以通過(guò)由Kohler等人，Nature, 256:495 (1975)首次描述的雜交瘤方法制備，或者可以 使用重組DNA方法在細(xì)菌、真核動(dòng)物或植物細(xì)胞中制得（參看例如美國(guó)專利第4, 816, 567 號(hào)）。"單克隆抗體"也可以使用例如Clackson等人，Nature, 352:624-628(1991)和Marks 等人，J. Mol. Biol.，222:581-597(1991)中描述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫(kù)分離得到。
[0044] 本文中的單克隆抗體包括："嵌合"抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來(lái)源于 特定物種或?qū)儆谔囟贵w類(lèi)別或子類(lèi)的抗體中的對(duì)應(yīng)序列是相同的或同源的，而所述鏈 的剩余部分與來(lái)源于另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類(lèi)別或子類(lèi)的抗體中的對(duì)應(yīng)序列是相同的 或同源的；以及所述抗體的片段，條件是所述片段展現(xiàn)期望的生物活性（參看美國(guó)專利第 4, 816, 567 號(hào)；和Morrison 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))。本發(fā)明 提供來(lái)源于人類(lèi)抗體的可變域抗原結(jié)合序列。因此，本文首要關(guān)注的嵌合抗體包括具有一 個(gè)或多個(gè)人類(lèi)抗原結(jié)合序列（例如CDR)并且含有一個(gè)或多個(gè)來(lái)源于非人抗體的序列（例 如FR或C區(qū)域序列）的抗體。此外，本文首要關(guān)注的嵌合抗體還包括那些包含一種抗體類(lèi) 別或子類(lèi)的人類(lèi)可變域抗原結(jié)合序列和來(lái)源于另一種抗體類(lèi)別或子類(lèi)的另一序列（例如 FR或C區(qū)域序列）的抗體。本文關(guān)注的嵌合抗體還包括那些含有與本文所描述的那些相關(guān) 的或來(lái)源于不同物種（例如非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物（例如舊世界猴（Old World Monkey)、猿等）） 的可變域抗原結(jié)合序列的抗體。嵌合抗體還包括靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物化和人源化抗體。此外，嵌合 抗體可以包含在受體抗體中或在供體抗體中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的殘基。這些修飾是用于進(jìn)一步改善 抗體性能。關(guān)于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，請(qǐng)參看Jones等人，Nature 321:522-525 (1986) ;Riechmann 等人，Nature 332:323-329 (1988);和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。
[0045] "抗體片段"包含完整抗體的一部分，優(yōu)選是完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。抗 體片段的實(shí)例包括Fab、Fab'、F (ab'）2和Fv片段；雙價(jià)抗體（diabody);線性抗體（參看美 國(guó)專利第 5,641,870 號(hào)；Zapata 等人，Protein Eng. 8 (10) :1057-1062 [1995]);單鏈抗體 分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。短語(yǔ)抗體的"功能片段或類(lèi)似物"是和全長(zhǎng)抗體 具有相同定性生物活性的化合物。舉例來(lái)說(shuō)，抗IgE抗體的功能片段或類(lèi)似物是可以以下 述方式結(jié)合到IgE免疫球蛋白上的化合物，所述方式防止所述分子具有結(jié)合到高親和力受 體Fc[ e ]RI上的能力或顯著降低所述能力。抗體的木瓜蛋白酶消化產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原 結(jié)合片段（稱為"Fab"片段）和一個(gè)殘余"Fc"片段（所述名稱反映了容易結(jié)晶的能力）。 Fab片段由與H鏈的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域（VH)在一起的整條L鏈和一個(gè)重鏈的第一恒定域（CH1) 組成。每個(gè)Fab片段就抗原結(jié)合來(lái)說(shuō)都是單價(jià)的，即其具有單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)抗體的 木瓜蛋白酶處理產(chǎn)生單個(gè)大的F (ab'）2片段，其大體上對(duì)應(yīng)于具有二價(jià)抗原結(jié)合活性的由 兩個(gè)二硫鍵連接的Fab片段并且能夠交聯(lián)抗原。Fab'片段和Fab片段的不同之處在于，在 CH1結(jié)構(gòu)域的羧基端具有額外的一些殘基，所述殘基包括來(lái)自于抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè) 半胱氨酸。Fab'-SH在本文中是對(duì)其中恒定域的半胱氨酸殘基具有游離巰基的Fab'的命 名。F(ab'）2抗體片段最初是作為在其之間具有鉸鏈半胱氨酸的成對(duì)Fab'片段產(chǎn)生?？贵w 片段的其它化學(xué)偶合也是已知的。
[0046] "人源化"或"人類(lèi)"抗體是指其中一個(gè)或多個(gè)人類(lèi)免疫球蛋白的恒定區(qū)和可變框 架區(qū)與動(dòng)物免疫球蛋白的結(jié)合區(qū)（例如CDR)融合的抗體。所述抗體被設(shè)計(jì)成維持結(jié)合區(qū)所 來(lái)源的非人抗體的結(jié)合特異性，但避免針對(duì)非人抗體的免疫反應(yīng)。所述抗體可以從轉(zhuǎn)基因 小鼠或已經(jīng)被"工程改造"從而可以響應(yīng)于抗原激發(fā)（antigenic challenge)而產(chǎn)生特異性 人類(lèi)抗體的其它動(dòng)物獲得（參看例如Green等人（1994) Nature Genet 7:13 ;Lonberg等人 (1994)Nature 368:856 ;Taylor 等人（1994) Int Immun 6:579,其全部教授內(nèi)容以引用的 方式并入本文中）。也可以通過(guò)在所屬領(lǐng)域中都已知的基因或染色體轉(zhuǎn)染方法以及噬菌體 展示技術(shù)（參看例如McCafferty等人（1990) Nature 348:552-553)構(gòu)建完全人類(lèi)抗體。也 可以通過(guò)體外激活的B細(xì)胞產(chǎn)生人類(lèi)抗體（參看例如美國(guó)專利第5, 567, 610和5, 229, 275 號(hào)，其以引用的方式全部并入本文中）。因此，"靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物化"抗體是指其中一個(gè)或多個(gè)靈 長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物免疫球蛋白的恒定區(qū)和可變框架區(qū)與非靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物免疫球蛋白的結(jié)合區(qū)（例如 ⑶R)融合的抗體。
[0047] "嵌合抗體"是下述的抗體分子，其中：(a)恒定區(qū)或其部分被改變、替換或交換以 使得抗原結(jié)合位點(diǎn)（可變區(qū)）連接到不同的或改變的類(lèi)別、效應(yīng)子功能和/或物種的恒定 區(qū)上，或連接到賦予嵌合抗體新特性的完全不同的分子上，所述分子例如有酶、毒素、激素、 生長(zhǎng)因子、藥物等；或（b)可變區(qū)或其部分被具有不同的或改變的抗原特異性的可變區(qū)改 變、替換或交換。
[0048] "Fc"片段包含通過(guò)二硫鍵保持在一起的兩個(gè)H鏈的羧基端部分?？贵w的效應(yīng)子功 能是由Fc區(qū)中的序列決定，所述區(qū)域也是被在某些類(lèi)型的細(xì)胞上所發(fā)現(xiàn)的Fc受體（FcR) 識(shí)別的部分。
[0049] "Fv"是含有完整抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。這個(gè)片段由非共價(jià)緊密結(jié) 合的一個(gè)重鏈可變結(jié)構(gòu)域和一個(gè)輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的二聚體組成。通過(guò)這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的折 疊獲得6個(gè)高變環(huán)（分別從H和L鏈得到3個(gè)環(huán)），所述高變環(huán)構(gòu)成用于抗原結(jié)合的氨基酸 殘基并且對(duì)抗體賦予抗原結(jié)合特異性。然而，即使單一可變域（或只包含對(duì)抗原具有特異 性的3個(gè)CDR的一半Fv)也具有識(shí)別和結(jié)合抗原的能力，雖然其親和力低于整個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。
[0050] "單鏈Fv"，也縮寫(xiě)成"sFv"或"scFv"，是包含連接到單一多肽鏈中的VH和VL抗體 結(jié)構(gòu)域的抗體片段。優(yōu)選地，sFv多肽另外包含在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽連接子，其導(dǎo)致 sFv能夠形成用于抗原結(jié)合的期望結(jié)構(gòu)。關(guān)于sFv，請(qǐng)參看Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第 113 卷，Rosenburg 和 Moore 編，Springer-Verlag, New York, 第 269-315 頁(yè)（1994) ;Borrebaeck 1995,下文。
[0051] 術(shù)語(yǔ)"雙價(jià)抗體"是指通過(guò)構(gòu)建sFv片段（參看前述段落）而制備的小抗體片段， 所述sFv片段在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間具有短連接子（約5-10個(gè)殘基），使得V結(jié)構(gòu)域發(fā)生 鏈間配對(duì)而不是鏈內(nèi)配對(duì)，從而產(chǎn)生二價(jià)片段，即具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的片段。雙特異性 雙價(jià)抗體是兩個(gè)"交叉" sFv片段的異二聚體，其中這兩個(gè)抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域存在于不 同的多肽鏈上。雙價(jià)抗體更充分地描述在例如EP 404,097 ;W0 93/11161 ;和Hoi linger等 人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)中。
[0052] 如本文所使用，如果抗體以可檢測(cè)的水平與抗原反應(yīng)，優(yōu)選地以親和力常數(shù)Ka大 于或等于約1〇4 M'或大于或等于約105 M'大于或等于約106 M'大于或等于約107 M' 或大于或等于1〇8 M'或大于或等于109 M'或小于或等于101° if1與抗原反應(yīng)，那么所述抗 體被認(rèn)為"具有免疫特異性"、對(duì)抗原"具有特異性"或"特異性地結(jié)合"抗原?？贵w對(duì)其同 源抗原的親和力通常也表示成解離常數(shù)Kd，并且在某些實(shí)施方案中，如果抗體以小于或等 于10_4 M、小于或等于約10_5 M、小于或等于約10_6 M、小于或等于10_7 M、或小于或等于10_8 M、 或小于或等于5. 1(T9 M、或小于或等于1(T9 M、或小于或等于5. 10% M的Kd結(jié)合，那么 所述抗體特異性地結(jié)合抗原。抗體的親和力可以使用常規(guī)技術(shù)例如Scatchard等人（Ann. N. Y. Acad. Sci. USA 51:660(1949))所描述的技術(shù)容易地測(cè)定?？贵w對(duì)其抗原、細(xì)胞或組織 的結(jié)合性質(zhì)通常可以使用免疫檢測(cè)方法測(cè)定和評(píng)定，所述免疫檢測(cè)方法包括例如基于免疫 熒光的分析，例如免疫組織化學(xué)（IHC)和/或熒光激活細(xì)胞分選（FACS)。
[0053] "分離核酸"是與天然伴隨天然序列的其它基因組DNA序列以及蛋白質(zhì)或復(fù)合物 (例如核糖體和聚合酶）基本上分離的核酸。所述術(shù)語(yǔ)涵蓋已經(jīng)從其天然存在的環(huán)境中取 出的核酸序列，并且包括重組或克隆DNA分離物，以及化學(xué)合成的類(lèi)似物或通過(guò)異源系統(tǒng) 生物合成的類(lèi)似物?；旧霞兊暮怂岚ê怂岬姆蛛x形式。當(dāng)然，這是指原始分離的核酸 并且不排除隨后人工添加到分離核酸中的基因或序列。
[0054] 術(shù)語(yǔ)"多肽"以其常規(guī)意義使用，即作為氨基酸的序列。多肽不限于特定長(zhǎng)度的產(chǎn) 物。多肽的定義中包括肽、寡肽和蛋白質(zhì)，并且除非另外明確說(shuō)明，否則所述術(shù)語(yǔ)在本文中 可以互換使用。這個(gè)術(shù)語(yǔ)也不涉及或排除天然存在的和非天然存在的對(duì)多肽的表達(dá)后修飾 (例如糖基化、乙?；?、磷酸化等）以及所屬領(lǐng)域中已知的其它修飾。多肽可以是整個(gè)蛋白 質(zhì)或其子序列。本發(fā)明的上下文中所關(guān)注的特定多肽是包含CDR并且能夠結(jié)合抗原的氨基 酸子序列。"分離多肽"是已經(jīng)從其天然環(huán)境的組分中鑒別和分離和/或回收的多肽。在 優(yōu)選實(shí)施方案中，分離多肽（1)被純化成大于95重量％的多肽，并且最優(yōu)選地超過(guò)99重 量％，如通過(guò)Lowry法所測(cè)定；(2)被純化到足以通過(guò)使用轉(zhuǎn)杯式序列分析儀獲得N端或內(nèi) 部氨基酸序列的至少15個(gè)殘基的程度；或（3)被純化成均質(zhì)，如通過(guò)SDS-PAGE在還原或非 還原條件下并且使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選使用銀染色法所顯示。分離多肽包括在重組細(xì)胞內(nèi)的 原位多肽，因?yàn)槎嚯牡奶烊画h(huán)境的至少一種組分將不存在。然而，分離多肽通常將通過(guò)至少 一個(gè)純化步驟制備。
[0055] "天然序列"多核苷酸是和來(lái)源于自然界的多核苷酸具有相同的核苷酸序列的多 核苷酸。"天然序列"多肽是和來(lái)源于自然界（例如來(lái)源于任何物種）的多肽（例如抗體） 具有相同的氨基酸序列的多肽。所述天然序列多核苷酸和多肽可以從自然界分離或者可以 通過(guò)重組或合成方法產(chǎn)生。
[0056] 在本文中使用的術(shù)語(yǔ)多核苷酸"變異體"是與本文中具體公開(kāi)的多核苷酸典型地 不同的多核苷酸，不同之處在于一個(gè)或多個(gè)取代、缺失、添加和/或插入。所述變異體可以 是天然存在的，或者可以例如通過(guò)下述方式合成地產(chǎn)生：修飾本發(fā)明的多核苷酸序列中的 一個(gè)或多個(gè)并且如本文所描述和/或使用所屬領(lǐng)域中眾所周知的多種技術(shù)中的任一種評(píng) 估被編碼多肽的一種或多種生物活性。在本文中使用的術(shù)語(yǔ)多肽"變異體"是與本文中具 體公開(kāi)的多肽典型地不同的多肽，不同之處在于一個(gè)或多個(gè)取代、缺失、添加和/或插入。 所述變異體可以是天然存在的，或者可以例如通過(guò)下述方式合成地產(chǎn)生：修飾本發(fā)明的以 上多肽序列中的一個(gè)或多個(gè)并且如本文所描述和/或使用所屬領(lǐng)域中眾所周知的多種技 術(shù)中的任一種評(píng)估多肽的一種或多種生物活性。修飾可以在本發(fā)明的多核苷酸和多肽的結(jié) 構(gòu)中進(jìn)行，并且仍然獲得編碼具有期望特征的變異體或衍生物多肽的功能分子。當(dāng)期望改 變多肽的氨基酸序列以產(chǎn)生本發(fā)明多肽的等效的或甚至改良的變異體或部分時(shí)，所屬領(lǐng)域 技術(shù)人員將典型地改變編碼DNA序列的一個(gè)或多個(gè)密碼子。舉例來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的某 些氨基酸可以被取代成其它氨基酸，而不會(huì)導(dǎo)致其結(jié)合其它多肽（例如抗原）或細(xì)胞的能 力顯著喪失。因?yàn)槭堑鞍踪|(zhì)的結(jié)合能力和性質(zhì)定義該蛋白質(zhì)的生物功能活性，所以可以在 蛋白質(zhì)序列進(jìn)行某些氨基酸序列取代，當(dāng)然，也可以在其基礎(chǔ)DNA編碼序列中進(jìn)行某些氨 基酸序列取代，并且仍然獲得具有類(lèi)似性質(zhì)的蛋白質(zhì)。因此考慮到可以在所公開(kāi)的組合物 的肽序列中或編碼所述肽的對(duì)應(yīng)DNA序列中進(jìn)行各種改變，而不會(huì)導(dǎo)致其生物效用或活性 顯著喪失。在許多情況下，多肽變異體將含有一個(gè)或多個(gè)保守取代。"保守取代"是其中一 個(gè)氨基酸被取代成具有類(lèi)似性質(zhì)的另一個(gè)氨基酸、使得肽化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將預(yù)期該多 肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和親疏水性（hydropathic)基本上沒(méi)有變化的取代。如上文概述，氨基酸取 代因此通常是基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)類(lèi)似性，例如其疏水性、親水性、電荷、大小等。 考慮到各種上述特征的示例性取代對(duì)于所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是眾所周知的并且包括：精 氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、 亮氨酸和異亮氨酸。氨基酸取代還可以基于殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/ 或兩親性性質(zhì)方面的類(lèi)似性進(jìn)行。舉例來(lái)說(shuō)，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶 正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；并且攜帶具有類(lèi)似親水性值的不帶電荷的極性頭基 的氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及絲 氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸?？梢员憩F(xiàn)保守性變化的其它群組的氨基酸包括：（1)ala、 pro、gly、glu、asp、gin、asn、ser、thr ; (2) cys、ser、tyr、thr ; (3) val、ile、leu、met、ala、 phe ;(4)lys、arg、his ;和（5)phe、tyr、trp、his。變異體也可以或替代性地含有非保守性 的變化。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，變異多肽與天然序列的不同之處在于5個(gè)或更少氨基酸 的取代、缺失或添加。變異體也可以（或替代性地）通過(guò)例如缺失或添加對(duì)多肽的免疫原 性、二級(jí)結(jié)構(gòu)和親疏水性具有最小影響的氨基酸來(lái)進(jìn)行修飾。
[0057] 當(dāng)用在兩種或更多種多肽的序列之間的關(guān)系中時(shí)，術(shù)語(yǔ)"同一性"或"相同"是 指多肽之間的序列相關(guān)程度，如通過(guò)兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的鏈段之間的匹配數(shù)所 確定。"同一性"衡量?jī)蓚€(gè)或更多個(gè)序列中較小序列之間的相同匹配的百分比，其中空 位比對(duì)（如果有的話）由特定數(shù)學(xué)模型或計(jì)算機(jī)程序（即"算法"）解決。相關(guān)多肽的 同一性可以容易地通過(guò)已知方法計(jì)算。所述方法包括（但不限于）在Computational Molecular Biology, Lesk, A. M.編，Oxford University Press,New York, 1988 ； Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. ff.編，Academic Press, New York, 1993 ;Computer Analysis of Sequence Data,第 1 部分，Griffin, A. M?和 Griffin, H. G.編,Humana Press, New Jersey, 1994 ；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press, 1987 ；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 和 Devereux，J?編，M. Stockton Press，New York, 1991;和 Carillo 等人，SIAM J. Applied Math. 48, 1073(1988)中所描述的方法。用于測(cè)定同一性的優(yōu)選方法被設(shè) 計(jì)成提供所測(cè)試的序列之間的最大匹配。公眾可以得到的計(jì)算機(jī)程序中描述了測(cè)定 同一性的方法。用于測(cè)定兩個(gè)序列之間的同一性的優(yōu)選計(jì)算機(jī)程序方法包括GCG程 序包（包括 GAP(Devereux 等人，Nucl. Acid. Res. \2,387 (I984) ;Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.))、BLASTP、BLASTN 和 FASTA(Altschul 等 人，J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990))。BLASTX 程序是公眾可以從 National Center for Biotechnology Information (NCBI)和其它來(lái)源（BLAST Manual, Altschul 等人，NCB/NLM/ NIH Bethesda, Md. 20894 ;Altschul 等人，上文）獲得的。眾所周知的 Smith Waterman 算 法也可以用于測(cè)定同一性。
[0058] 如本文中所使用的"哺乳動(dòng)物"是指任何哺乳動(dòng)物，包括人、家養(yǎng)和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、以及 動(dòng)物園動(dòng)物、競(jìng)技動(dòng)物或?qū)櫸飫?dòng)物，例如狗、貓、牛、馬、綿羊、豬、山羊、兔等。優(yōu)選地，哺乳動(dòng) 物是人。
[0059] "治療（treating) "或"治療（treatment) "或"緩解"是指治療性處理和預(yù)防性或 防范性措施；其中目的是預(yù)防或減緩（減輕）目標(biāo)病理病狀或病癥。需要治療的那些包括 已經(jīng)患病的那些以及有患病傾向的那些或需要預(yù)防病癥的那些。如果在根據(jù)本發(fā)明的方法 接受治療量的抗體之后，受試對(duì)象或者哺乳動(dòng)物顯示一種或多種以下情況的可觀測(cè)的和/ 或可測(cè)量的減少或不存在，那么該患者的感染被成功地"治療":病原性細(xì)胞數(shù)目的減少；具 有病原性的總細(xì)胞的百分比的下降；和/或與具體疾病或病狀相關(guān)的一種或多種癥狀在一 定程度上緩解；發(fā)病率和死亡率的下降；和生活質(zhì)量的提高。用于評(píng)定疾病的成功治療和 改善的以上參數(shù)可以通過(guò)醫(yī)師熟悉的常規(guī)程序容易地測(cè)量。
[0060] 術(shù)語(yǔ)"治療有效量"是指可有效"治療"受試對(duì)象或哺乳動(dòng)物的疾病或病癥的抗體 或藥物的量。
[0061] 本發(fā)明
[0062] 本發(fā)明涉及針對(duì)SPLA2-X的分離抗體。
[0063] 抗 SPLA2-X 抗體
[0064] 本發(fā)明的一個(gè)目的是一種針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的抗體，其中所述抗體結(jié)合人類(lèi) SPLA2-X的Kd小于1(T9 M，優(yōu)選地小于6. 10% M，更優(yōu)選地小于5. 10% M并且甚至更優(yōu)選 地小于4. KT1Q M。
[0065] 在測(cè)試A的條件下測(cè)定Kd :
[0066] 在室溫下用PBS (pH 7. 5)中的50 ng重組人類(lèi)SPLA2-X包被微板的各孔過(guò)夜。然 后用含有0.05% Tween 20的PBS洗滌樣品孔3次。最后一次洗滌之后，在室溫下用含有于 PBS緩沖液中的1%牛血清白蛋白（BSA)的封閉溶液處理樣品孔60分鐘。在用含有0.05% Tween 20的PBS洗滌之后，向包被有抗原的孔中添加遞增量（0. 1 ng/mL到10 ii g/mL)的 針對(duì)人類(lèi)PLA2-X的mAb，并且在室溫下培育120分鐘。在用含有0. 05 % Tween 20的PBS洗 滌之后，通過(guò)用結(jié)合有HRP的多克隆山羊抗小鼠IgG(Abcam ab7068)在室溫下處理60分鐘 來(lái)檢測(cè)mAb的結(jié)合。添加TMB，通過(guò)添加HC1終止反應(yīng)，并且測(cè)定450 nm下的吸光率。將數(shù) 據(jù)用單點(diǎn)飽和模型（one-site saturation model)擬合，并且從所述模型估計(jì)相對(duì)Kd值。
[0067] 本發(fā)明的一個(gè)目的是一種針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的抗體，其中重鏈可變區(qū)包含至少一 個(gè)以下⑶R :
[0068] VH-CDR1:GFTFSN(SEQ ID N0:1)或 GYTFTN(SEQ ID N0:2);
[0069] VH-CDR2:TISSGGDDTY(SEQ ID N0:3)或 WIKTNTGEPT(SEQ ID N0:4);和
[0070] VH-CDR3:PQLGP(SEQ ID N0:5)或 GNYYRPRRYFDY(SEQ ID N0:6)。
[0071] ⑶R編號(hào)和定義是根據(jù)Chothia定義進(jìn)行。
[0072] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的抗體，其中輕鏈可變區(qū)包含至少 一個(gè)以下CDR :
[0073] VL-CDR1:RSSKSLLHSNGITYLY(SEQ ID N0:7)或 RASENLYSNLA(SEQ ID N0:8);
[0074] VL-CDR2:YMSNLAS(SEQ ID N0:9)或 AATNLAD(SEQ ID N0:10);和
[0075] VL-CDR3:MQSLEYPLT(SEQ ID N0:11)或 QHFYVTPYT(SEQ ID N0:12)。
[0076] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗SPLA2-X抗體在其重鏈中包含GFTFSN(SEQ ID N0:1)或 GYTFTN(SEQ ID N0:2)中的一個(gè)VH-CDR1、TISSGGDDTY(SEQ ID N0:3)或 WIKTNTGEPT(SEQ ID N0:4)中的一個(gè)VH-CDR2、和PQLGP(SEQ ID N0:5)或GNYYRPRRYFDY(SEQ ID N0:6)中的一個(gè) VH-CDR3。
[0077] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗SPLA2-X抗體在其輕鏈中包含 RSSKSLLHSNGITYLY(SEQ ID N0:7)或 RASENLYSNLA(SEQ ID N0:8)中的一個(gè)VL-CDR1、 YMSNLAS(SEQ ID N0:9)或 AATNLAD(SEQ ID N0:10)中的一個(gè) VL-CDR2、和 MQSLEYPLT(SEQ ID N0:11)或 QHFYVTPYT(SEQ ID N0:12)中的一個(gè) VL-CDR3。
[0078] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗SPLA2-X抗體在其重鏈中包含3個(gè)⑶R SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:5。
[0079] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗SPLA2-X抗體在其重鏈中包含3個(gè)⑶R SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4 和 SEQ ID NO:6。
[0080] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗SPLA2-X抗體在其輕鏈中包含3個(gè)⑶R SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:9 和 SEQ ID N0:11。
[0081] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗SPLA2-X抗體在其輕鏈中包含3個(gè)⑶R SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10 和 SEQ ID NO:12。
[0082] 根據(jù)本發(fā)明，重鏈和輕鏈的⑶R 1、2和3中的任一個(gè)都可以表征為具有與對(duì)應(yīng)SEQ ID NO中列舉的特定CDR或成組CDR具有至少60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、 97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。
[0083] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗SPLA2-X抗體選自由以下各項(xiàng)組成的群組：
[0084] -具有⑴分別如SEQ ID N0:l、3和5中所示的重鏈CDR 1、2和3(VH-CDR1、 VH-⑶R2、VH-⑶R3)氨基酸序列和（ii)分別如SEQ ID N0:7、9和11中所示的輕鏈⑶R 1、 2 和 3 (VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3)氨基酸序列的抗體；
[0085] -具有⑴分別如SEQ ID N0:2、4和6中所示的重鏈CDR 1、2和3(VH-CDR1、 VH-⑶R2、VH-⑶R3)氨基酸序列和（ii)分別如SEQ ID N0:8、10和12中所示的輕鏈⑶R 1、 2 和 3 (VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3)氨基酸序列的抗體；
[0086] 任選地，其中任何所述序列中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被不同氨基 酸取代。
[0087] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗SPLA2-X抗體（8D9抗體）包含序列SEQ ID N0 : 13的重鏈可變區(qū)和序列SEQ ID NO :14的輕鏈可變區(qū)。
[0088] (SEQ ID NO ：13)：
[0089] EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNYPMSWVRQTPAKRLEWVATISSGGDDTYYPDSVKGRFT ISRDNARNTLYLQMSCLRSEDTALYYCARPQLGPWGQGTTLTVSS
[0090] (SEQ ID NO :14):
[0091] DIVMTQAAPSVPVTP⑶SVSISCRSSKSLLHSNGITYLYWFLQRPGQSPQRLIYYMSNLASGVPDRFSG RGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCMQSLEYPLTFGAGTKLELKR
[0092] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，抗SPLA2-X抗體（9C12抗體）包含序列SEQ ID NO : 15的重鏈可變區(qū)和序列SEQ ID NO :16的輕鏈可變區(qū)。
[0093] (SEQ ID NO ：15)：
[0094] QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLK, VMGWIKTNTGEPTYAEEFKGRF AFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARGNYYRPRRYFDYWGQGTTLTVSS
[0095] (SEQ ID NO :16):
[0096] DIQMSQSPASLSASVGETVTMTCRASENLYSNLAWYQQKQGKSPQLLVYAATNLADGVPSRFSGSGSGT QFSLKINSLQPEDFGSYYCQHFYVTPYTFGGGTKLEIKR
[0097] 根據(jù)本發(fā)明，重鏈或輕鏈可變區(qū)的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸可以被不同氨 基酸取代。
[0098] 根據(jù)本發(fā)明，重鏈可變區(qū)涵蓋與SEQ ID N0:13或15具有60%、70%、75%、80%、 90%、95%、96%、97%、98%、99% 同一性的序列。
[0099] 根據(jù)本發(fā)明，輕鏈可變區(qū)涵蓋與SEQ ID N0:14或16具有60%、70%、75%、80%、 90%、95%、96%、97%、98%、99% 同一性的序列。
[0100] 在本發(fā)明的任何抗體例如8D9和9C12中，指定可變區(qū)和CDR序列可以包含保守性 序列修飾。保守性序列修飾是指不顯著影響或改變含有該氨基酸序列的抗體的結(jié)合特征的 氨基酸修飾。所述保守性修飾包括氨基酸取代、添加和缺失。修飾可以通過(guò)所屬領(lǐng)域中已 知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)（例如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變）引入本發(fā)明的抗體中。保守性氨基酸取 代典型地是其中氨基酸殘基被具有存在類(lèi)似物理化學(xué)性質(zhì)的側(cè)鏈的氨基酸殘基取代的氨 基酸取代。指定可變區(qū)和CDR序列可以包含一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)氨基酸插入、缺 失或取代。當(dāng)進(jìn)行取代時(shí)，優(yōu)選的取代是保守性修飾。具有類(lèi)似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在 所屬領(lǐng)域中已有定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈（例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸）、酸性側(cè) 鏈（例如天冬氨酸、谷氨酸）、不帶電的極性側(cè)鏈（例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨 酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸）、非極性側(cè)鏈（例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨 酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸）、￠-分支側(cè)鏈（例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）和芳香 族側(cè)鏈（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）的氨基酸。因此，在本發(fā)明抗體的CDR區(qū) 內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可以被來(lái)自同一側(cè)鏈家族的其它氨基酸殘基取代，并且可以使 用本文描述的分析測(cè)試經(jīng)過(guò)改變的抗體所保留的功能（即本文中闡明的性質(zhì)）。
[0101] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供一種結(jié)合與8D9或9C12抗體基本上相同的表位 的抗體。
[0102] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種分離核酸序列，其編碼序列SEQ ID N0:13的重鏈可變 區(qū)。優(yōu)選地，所述核酸序列是
[0103] ShQ ID NO: 17 (GAA (j TCi AAG CIG G IG CiAG i'C i CiGG CitiA GGC '1 TA G I G A AG CCT GO A GGG ICC CTO AAA CTC ICC TOT GCA GCC TCI GGA TTC ACT VW ACVI- AAC TAT CCC ATG TCT TGG GTT CGC CAG ACJ' CCG CCG AAG ACG CTG GAG TGG GTC GCA ACC ATT ACT ACT GGT GGT GAT GAC ,\rr ta(' tat （;.t G AC AA.T GCC AGG A AC ACC CTG TAC CTG C' A A ATG AGC TGT CTG AGG TrT clu; (iAr Arc; CCC： '['CSC； GGC C.AA GCiC ACC ACT C IC AC.：A G 1C \VC i'CA).
[0104] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種分離核酸序列，其編碼序列SEQ ID N0:14的輕鏈可變 區(qū)。優(yōu)選地，所述核酸序列是SEQ
[0105] ID NO:丨8 (G.\T ATT GTG ATG ACT C'G GCT GCA CCC TCT GTA ACT CCT GCSA GA'l' '1C A GTA ICC ATC TCC 1GC AGO TCT AG I AAC AGi' n......r era cat act a at cgc atc a( i......fac ire； tat tcg ttc ere cag AGG ex'八（;（;(' (V\G TCT CCT C'AG r rG .\TA TA C!T GCC TCA GGA CiiC' CCA GAC AGC. ilC： ACT GGC AG A C；(.iG 1(1? (；>GA ACT GAT T兀 丨零丨冒"). 產(chǎn)，丨丨冒", 9"W"K Jl ipv% tL A A A f"W"\ a a ifw*i jt ，丨丨囂丨丨， f jt (_尤;1 Lrl 丨 i A [丨 A(_ 1 U I A ]義丨 L 八_ \ . L 1 A GCVI GCI' GGG ACC AAG Cl'G CjAG CTG AAA CGG).
[0106] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種分離核酸序列，其編碼序列SEQ ID N0:15的重鏈可變 區(qū)。優(yōu)選地，所述核酸序列是
[0107] SLQ l!KN(): m(:AG ,\T(，(:AG AAG C：C."J GCjA GAG AC A (..；!(； AAC； A IC； ICC ICiC' AAC； CXI TC；i CGC； l.\i ACC TTC ACA AAC： TA'T GGA A i'G AAC TGCi CH'G AAG CAG GCI'- CCA GGA ,\AG GGT 'H'A -\A.C "l."GG A：['G GGC 'TOCS ATA. AAA ACC AAC" ACI' GGA GAG (XVX A(:A TAT CX叮（l.AA GAG TTC GAA ACC TCI GCC AGC ACT GCC TAT TIG CAG ATC AAC AAC C1C AAA ,\Ai' G-\C GAC ACC GCI AC.\ l'A 1' TR.： IXii GCA AG A GGG AAC； J'AC TA1 AGO CCC CGG AGA TAC 1，IT GAC TAC TGG GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA).
[0108] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種分離核酸序列，其編碼序列SEQ ID NO: 16的輕鏈可 變區(qū)。優(yōu)選地，所述核酸序列是SEQ
[0109]

【權(quán)利要求】
1. 一種針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的分離抗體，其中所述抗體具有小于1(T9 M的結(jié)合人類(lèi) SPLA2-X 的 Kd。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的分離抗體，其中重鏈可變區(qū)包含至少一 個(gè)以下⑶R : VH-CDR1:GFTFSN(SEQ ID N0:1)或 GYTFTN(SEQ ID N0:2); VH-CDR2:TISSGGDDTY(SEQ ID N0:3)或 WIKTNTGEPT(SEQ ID N0:4);和 VH-CDR3:PQLGP(SEQ ID N0:5)或 GNYYRPRRYFDY(SEQ ID N0:6)， 或具有與SEQ ID NO: 1-6具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R， 或其中輕鏈可變區(qū)包含至少一個(gè)以下CDR : VL-CDR1:RSSKSLLHSNGITYLY(SEQ ID N0:7)或 RASENLYSNLA(SEQ ID N0:8); VL-CDR2:YMSNLAS(SEQ ID N0:9)或AATNLAD(SEQ ID N0:10);和 VL-CDR3:MQSLEYPLT(SEQ ID N0:11)或 QHFYVTPYT(SEQ ID N0:12)， 或具有與SEQ ID NO: 7-12具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1到2中任一權(quán)利要求所述的針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的分離抗體，其中重 鏈可變區(qū)包含至少一個(gè)如權(quán)利要求2中所定義的⑶R，并且輕鏈可變區(qū)包含至少一個(gè)如權(quán) 利要求2中所定義的CDR。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一權(quán)利要求所述的針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的分離抗體，其中重 鏈可變區(qū)包含如權(quán)利要求2中所定義的CDR，并且輕鏈可變區(qū)包含如權(quán)利要求2中所定義的 CDR。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一權(quán)利要求所述的針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的分離抗體，其中重 鏈可變區(qū)包含以下 CDR:GFTFSN(SEQ ID N0:1)、TISSGGDDTY(SEQ ID N0:3)和 PQLGP(SEQ ID N0:5)，并且輕鏈可變區(qū)包含以下 CDR:RSSKSLLHSNGITYLY(SEQ ID N0:7)、YMSNLAS(SEQ 10勵(lì):9)和]\^51^￥?1^(5￡〇10勵(lì)：11)，或具有與所述5￡〇10勵(lì)：1、3、5、7、9、11具有至少 60 %同一性的氨基酸序列的任何⑶R。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一權(quán)利要求所述的針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的分離抗體， 其中重鏈可變區(qū)包含以下 CDR:GYTFTN(SEQ ID N0:2)、WIKTNTGEPT(SEQ ID N0:4)和 GNYYRPRRYFDY(SEQ ID N0:6)，并且輕鏈可變區(qū)包含以下CDR:RASENLYSNLA(SEQ ID N0:8)、 AATNLAD(SEQ ID N0:10)和QHFYVTPYT(SEQ ID N0:12)，或具有與所述SEQ ID N0:2、4、6、8、 10、12具有至少60%同一性的氨基酸序列的任何⑶R。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一權(quán)利要求所述的針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的分離抗體，其中編 碼重鏈可變區(qū)的氨基酸序列是SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15,并且編碼輕鏈可變區(qū)的氨基 酸序列是SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 16,或具有與所述SEQ ID NO: 13-16具有至少60% 同一性的氨基酸序列的任何序列。
8. -種表達(dá)載體，其包含5￡〇10勵(lì)：17、5￡〇10從)：18、5￡〇10勵(lì)：19和5￡〇10勵(lì):20 中的至少一個(gè)、或具有與所述SEQ ID NO: 17-20具有至少60%同一性的核酸序列的任何序 列。
9. 產(chǎn)生針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的抗體的雜交瘤細(xì)胞系，其登記為CNCM 1-4523和CNCM 1-4524。
10. -種組合物,其包含根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一權(quán)利要求所述的針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X 的抗體。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一權(quán)利要求所述的針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的抗體，其用于治療 SPLA2-X相關(guān)病狀，其中所述抗體抑制內(nèi)源SPLA2-X的活性。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一權(quán)利要求所述的針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的抗體，其用于檢測(cè) 生物樣品中的SPLA2-X。
13. -種體外診斷或預(yù)后分析，其用于使用根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一權(quán)利要求所述的 針對(duì)人類(lèi)SPLA2-X的抗體測(cè)定生物樣品中的SPLA2-X的存在。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的體外診斷或預(yù)后分析，其中所述分析是夾心ELISA，所述夾 心ELISA使用權(quán)利要求5的抗體作為包被抗體并且使用權(quán)利要求6的抗體作為暴露抗體。
15. -種試劑盒，其包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一權(quán)利要求所述的針對(duì)人類(lèi) SPLA2-X的抗體。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的試劑盒，其包含權(quán)利要求5的抗體和權(quán)利要求6的抗體。
【文檔編號(hào)】G01N33/53GK104220459SQ201280069243
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2012年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月7日
【發(fā)明者】G·朗博, E·瓦倫廷, M·雷恩諾 申請(qǐng)人:國(guó)家科學(xué)研究中心, 尼斯大學(xué)