多重免疫篩選分析的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供用于病原體的早期檢測、病原體的準(zhǔn)確鑒定并改進(jìn)疾病監(jiān)測的試劑盒和分析方法。更具體地，本發(fā)明公開了免疫分析，其引導(dǎo)在受感染患者的生物液體中針對廣泛范圍的傳染性病原體的抗體快速和同時(shí)檢測。這種免疫分析涉及含有AGT酶與病毒抗原的融合蛋白在可鑒定的固體支持物(例如，熒光微球)上的共價(jià)和定向偶聯(lián)，所述支持物預(yù)先用AGT底物包被。這種偶聯(lián)由AGT酶在其底物上不可逆的反應(yīng)所介導(dǎo)。因此，與通過標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)程序產(chǎn)生的抗原偶聯(lián)的微球相比，所獲得的抗原偶聯(lián)微球顯示特異性抗體的增強(qiáng)捕獲。與經(jīng)典ELISA或放射免疫沉淀分析相比，本發(fā)明的方法具有多重化、最小化生物樣本量的能力，并具有針對靶抗體的增強(qiáng)的靈敏度和特異性。
【專利說明】多重免疫篩選分析

【背景技術(shù)】
[0001] 由于疾病的嚴(yán)重程度、高致死性、某些介質(zhì)（agent)的人類間接觸傳染性以及對 其中的大多數(shù)缺乏有效治療，傳染病和病毒性出血熱（VHF)構(gòu)成顯著的公共衛(wèi)生問題。
[0002] 其中一些是由高傳染性的RNA病毒導(dǎo)致，所述RNA病毒來自幾個(gè)科，其包括包括 黃病毒科（Flaviviridae)(登革熱、黃熱病、西尼羅、日本腦炎、蜱傳腦炎、丙型肝炎病毒）、 披膜病毒科（Togaviridae)(基孔肯雅（Chikungunya)、羅斯河、馬雅羅、西方馬型腦炎、東 方馬型腦炎、委內(nèi)瑞拉馬型腦炎病毒）、本雅病毒科（Bunyaviridae)(克里米亞-剛果出血 熱、裂谷熱、施馬倫貝格病毒）、杯狀病毒科（Caliciviridae)(戊型肝炎病毒）、沙粒病毒科 (Arenaviridae)(拉沙熱）和絲狀病毒（Filoviridae)(埃博拉、馬爾堡）。通常通過與感 染的動(dòng)物貯主或節(jié)肢動(dòng)物載體接觸發(fā)生傳播。雖然大多數(shù)的這些病毒在熱帶和亞熱帶有更 高的發(fā)生率，但其天然貯主和載體地域擴(kuò)張、以及增加的國際旅行已經(jīng)使這些介質(zhì)在非流 行地區(qū)極有可能出現(xiàn)。疫情控制關(guān)鍵取決于快速檢測以及介質(zhì)的準(zhǔn)確鑒定，以定義和及時(shí) 實(shí)現(xiàn)并適當(dāng)行動(dòng)。在這種情況下，必須產(chǎn)生和驗(yàn)證用于暴發(fā)的早期檢測、精確鑒定病原體并 改進(jìn)疾病監(jiān)測的工具。
[0003] 在這方面，在體液中檢測抗體構(gòu)成了病毒引起的疾病、自身免疫性疾病的診斷以 及癌癥檢測的重要組成部分。事實(shí)上，因?yàn)橐阎承┛贵w存在與病原體的暴發(fā)有關(guān)，因此這 些抗體可作為診斷標(biāo)記物并可引導(dǎo)預(yù)后和治療。對于專門靶向病毒抗原的抗體的情況尤其 如此。
[0004] 目前用于檢測抗體存在的方法包括多種技術(shù)，諸如免疫突光顯微鏡、化學(xué)發(fā)光分 析、Western印跡、放射免疫沉淀法（RIP)和ELISA。例如，Kim H-J等人的團(tuán)隊(duì)最近開 發(fā)出一種競爭ELISA用于檢測針對在山羊和牛中的裂谷熱病毒的抗體（The Journal of Veterinay Medical Science, 2011)。然而，這種技術(shù)需要分開測量每種抗體，因而不適用 于在單個(gè)生物液體樣本中進(jìn)行多個(gè)抗體的平行、快速和高通量分析。因?yàn)樾?zhǔn)品和所述抗 體在相同的條件下進(jìn)行分析，通過減少個(gè)別分析（如ELISA)之間存在的基質(zhì)效應(yīng)，同時(shí)平 行檢測幾種抗體可特別地有用；因此，對在相同樣本中存在的多個(gè)抗體的測量，其將產(chǎn)生可 比較的結(jié)果。
[0005] 然而，使病原相關(guān)抗體的直接鑒定復(fù)雜化的是正常血清含有大量在復(fù)雜染色模式 中表現(xiàn)其自身的天然抗體（Avrameas S. Immunol. Today 1991)。這些天然抗體的存在可 使得疾病相關(guān)抗體與"自身免疫噪聲"（即天然存在的自身抗體）的復(fù)雜背景的差異復(fù)雜 化。這就是為什么大多數(shù)之前研究評估一個(gè)或幾個(gè)特異性疾病相關(guān)抗體，并通過ELISA或 RIA的方法僅篩選出有限數(shù)量的純化的同源或異源的蛋白作為抗原。不可能建立基于這些 抗體的診斷。在另一方面，因?yàn)閃estern印跡法允許同時(shí)篩選不同抗原的廣泛譜，Western 印跡法已經(jīng)發(fā)展成為檢測抗體的最重要工具。最近能夠同時(shí)分析Western印跡這些復(fù)雜 的染色模式的新技術(shù)，是基于數(shù)字圖像分析。這種技術(shù)已成功應(yīng)用于研究重癥肌無力、格 雷夫斯病和實(shí)驗(yàn)性葡萄膜炎（Zimmerman CW, Electrophoresis 1995)。還可使用表面增強(qiáng) 激光解吸/電離（SELDI)或基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜技術(shù)，優(yōu)選SELDI質(zhì)譜技術(shù)（US 2006/166268)在蛋白芯片陣列上檢測和測量抗體。然而，這些技術(shù)使用大型笨重設(shè)備，其是 復(fù)雜的和維護(hù)昂貴，并且需要大量的生物樣本來實(shí)現(xiàn)低量抗體的檢測。
[0006] 鑒于上述情況，需要可尋址系統(tǒng)和方法，其可對產(chǎn)生抗體的疾病的分子診斷提供 高通量、成本效益和精確性的進(jìn)一步改善。本發(fā)明滿足了這些和其它需要。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0007] 圖1表示嵌合AGT-抗原蛋白定向偶聯(lián)至底物包被的微球上。偶聯(lián)的第一步由通過 氨基偶聯(lián)將AGT底物BG-PEG-NH2偶聯(lián)至活化的微球所組成。第二步由使底物包被的微球與 含AGT的融合蛋白（例如，SNAP突變體）相接觸所組成，所述酶意欲共價(jià)附至其BG-PEG-NH2 底物，即至微球上。
[0008] 圖2顯示嵌合SNAP-病毒抗原蛋白的偶聯(lián)效率（SNAP-DVL EDIII、SNAP-DV2. EDIII、SNAP. DV3. EDIII、SNAP. DV4. EDIII、SNAP-WNV、SNAP-YF、SNAP-JE、SNAP-ZIKA)，接著 是抗-SNAP抗體。
[0009] 圖3比較了用于檢測純化的單克隆抗-DV2抗體對嵌合SNAP-DV2.EDIII蛋白的免 疫分析實(shí)驗(yàn)的靈敏度，所述嵌合SNAP-DV2.EDIII蛋白通過hAGT蛋白的底物（本發(fā)明的偶 聯(lián)）綴合至微球、或者通過標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)方法，例如Bio-Plex胺偶聯(lián)試劑盒BI0RAD進(jìn)行偶 聯(lián)。
[0010] 圖4比較用于檢測純化的單克隆抗-DV1抗體對嵌合SNAP-DV1. EDIII蛋白的免 疫分析實(shí)驗(yàn)的靈敏度，所述嵌合SNAP-DV1. EDIII蛋白以單重格式綴合至微球，或者與其它 嵌合 SNAP-病毒 Ag 蛋白（SNAP-DV2. EDIII、SNAP. DV3. EDIII、SNAP. DV4. EDIII、SNAP-WNV、 SNAP-YF、SNAP-JE、SNAP-TBE)以多重格式偶聯(lián)至微球。
[0011] 圖5顯示用于檢測純化的單克隆抗-WNV抗體的稀釋液對偶聯(lián)至微球的嵌合 SNAP-病毒 Ag 蛋白（SNAP-DV1. EDIII、SNAP-DV2. EDIII、SNAP. DV3. EDIII、SNAP. DV4. EDIII、 SNAP-WNV、SNAP-YF、SNAP-JE、SNAP-TBE)的多重免疫分析實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)性和特異性。
[0012] 圖6顯示以多重免疫分析對偶聯(lián)至微球的嵌合SNAP-病毒Ag蛋白（SNAP-DV1. EDIII、SNAP-DV2. EDIII、SNAP. DV3. EDIII、SNAP. DV4. EDIII、SNAP-WNV、SNAP-YF、SNAP-JE、 SNAP-WSL、SNAP-R0CI0、SNAP-MVE、SNAP-SLE、SNAP-ZIKA)進(jìn)行的在小鼠多克隆血清中針對 DV3的抗-DV3 IgG檢測（A)以及在小鼠多克隆血清中針對YF的抗-YF IgG檢測（B)的反 應(yīng)性和特異性。
[0013] 圖7顯示在DV1感染的人類患者血清中以多重免疫分析對偶聯(lián)至微球的嵌合 SNAP-病毒 Ag 蛋白（SNAP-DV1. EDIII、SNAP-DV2. EDIII、SNAP. DV3. EDIII、SNAP. DV4. EDIII、 SNAP-WNV、SNAP-YF、SNAP-JE、SNAP-WSL、SNAP-R0CI0、SNAP-MVE、SNAP-SLE、SNAP-ZIKA、 SNAP-TBE)進(jìn)行的抗-DV1 IgM檢測（A)和抗-DV1 IgG檢測（B)的反應(yīng)性和特異性。
[0014] 圖 8 公開 pDeSNAPuniv 盒（cassette)的結(jié)構(gòu)。
[0015] 圖 9 公開 pDeSNAPuniv/SBV. N 盒的結(jié)構(gòu)。
[0016] 圖10顯示（A)使用Cd2+誘導(dǎo)10天（+)或未誘導(dǎo)的（-)的S2/SNAP-SBV. N細(xì)胞上 清中進(jìn)行的免疫印跡分析。使用抗-Hisss抗體檢測分泌的嵌合蛋白SNAP-SBV. N(理論麗 50kDa)，與限定量的高純度嵌合蛋白SNAP-T0S.N(理論MW 49kDa)進(jìn)行比較。（B)在尺寸排 阻層析柱的餾分（fraction)上進(jìn)行的免疫印跡（PAGE-SDS的考馬斯藍(lán)染色）對應(yīng)于來自 誘導(dǎo)10天的S2/SNAP+SBV. N細(xì)胞的分泌SNAP+SBV. N蛋白的最后純化步驟。
[0017] 圖11顯示含有本發(fā)明的抗原包被微球的裝置的實(shí)例。

【具體實(shí)施方式】
[0018] 6-烷基鳥嘌呤-DNA-烷基轉(zhuǎn)移酶（AGT，也被稱為ATase或MGMT，以下稱為"AGT"） 在IUBMB酶命名法中編號為EC 2. 1. 1.63。它是207個(gè)氨基酸殘基的6-烷基鳥嘌呤-DNA-烷 基轉(zhuǎn)移酶的DNA修復(fù)酶，其在細(xì)胞內(nèi)的功能是修復(fù)烷基化DNA。更精確地，AGT通過將S N2反 應(yīng)中的甲基不可逆地轉(zhuǎn)移至反應(yīng)性半胱氨酸殘基（Cys 145)對DNA中的06-甲基化鳥嘌呤 發(fā)揮作用。目前，已經(jīng)證明一些06-芐基鳥嘌呤衍生物通過將其芐基轉(zhuǎn)移至AGT酶的活性位 點(diǎn)半胱氨酸上來與所述酶進(jìn)行不可逆反應(yīng)（參見Damoiseaux等人，ChemBiochem.，2001，W0 2004/031404 和 TO 2005/085470)。
[0019] 本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)和驗(yàn)證了這樣的免疫分析，其導(dǎo)向由廣泛疾病，特別是蟲媒病 毒疾病和VHF產(chǎn)生的幾種抗體在生物液體中的快速和同時(shí)檢測。
[0020] 為實(shí)現(xiàn)對低量抗體檢測最佳靈敏度和特異性兩者，已經(jīng)開發(fā)出定向抗原偶聯(lián)方 法。這個(gè)定向抗原偶聯(lián)方法基于AGT酶和其底物（06-芐基鳥嘌呤衍生物）之間的共價(jià)相互 作用，所述底物通過將其芐基轉(zhuǎn)移至酶的活性位點(diǎn)半胱氨酸上與AGT酶不可逆反應(yīng)。相應(yīng) 地，一些靶抗原可融合至AGT酶的部分，從而導(dǎo)致不同的嵌合融合蛋白（以下稱為[AGT-抗 原]的融合蛋白），即可以用作對存在于生物樣本中的抗體的捕獲試劑。本發(fā)明人已證明， 得益于特異性AGT-底物相互作用，當(dāng)這些融合蛋白結(jié)合到固體支持物上時(shí)這種抗體捕獲 得以增強(qiáng)。因此，使用AGT-底物包被所述固體支持物是本發(fā)明免疫分析的必要步驟。
[0021] 更確切地說，在本發(fā)明的上下文中，用于將抗原偶聯(lián)至固體支持物的方法包括以 下兩個(gè)步驟：i)用AGT底物（例如，BG-PEG-氨基）包被固體表面，以及ii)使用AGT底物作 為錨點(diǎn)來共價(jià)固定嵌合[AGT-抗原]融合蛋白（參見圖1)。固體表面使用所述AGT底物包 被之前，所述固體表面有利地是官能化的，優(yōu)選通過使用優(yōu)化的兩步碳二亞胺處理（Kufer SK，Eur. Biophys. J，2005)，從而使AGT底物共價(jià)附著到固體表面。一旦這些步驟已經(jīng)完成， 所述固體表面攜帶AGT底物被不可逆地連接到嵌合[AGT-抗原]融合蛋白上。由于這種反 應(yīng)的高特異性，所述融合蛋白專門通過含有半胱氨酸的AGT酶結(jié)構(gòu)域偶聯(lián)，因此使抗原因 其與抗體的相互作用而可被接近。
[0022] 這種偶聯(lián)過程是非常有利的，因?yàn)槠湓试S抗原在固體支持物上以定向的方式結(jié) 合。此外，這種抗原偶聯(lián)方法有利地使得能夠獲得在固體表面上的多聚體抗原結(jié)構(gòu)，從而增 強(qiáng)免疫球蛋白G、以及可能的免疫球蛋白Μ的捕獲效率。因此，與通過標(biāo)準(zhǔn)的非定向胺偶聯(lián) 程序產(chǎn)生的抗原偶聯(lián)微球相比，在本申請實(shí)驗(yàn)部分中開發(fā)的抗原偶聯(lián)的微球已顯示出增強(qiáng) 的特異性抗體捕獲（參見以下實(shí)驗(yàn)部分和圖3)。最后，這種抗原偶聯(lián)方法使得能夠獲得抗 原綴合微球的高偶聯(lián)效率與長期穩(wěn)定性（在4°C，>6個(gè)月）。
[0023] 重要的是，在本發(fā)明的免疫分析中使用的固體支持物應(yīng)是本質(zhì)上可區(qū)分的，因此 有可能準(zhǔn)確地確定何種固體支持物上攜帶何種抗原。然后，抗原偶聯(lián)的和可區(qū)分的固體支 持物用作特異性人免疫球蛋白的捕獲試劑，并因此接觸患者的生物樣本。
[0024] 本發(fā)明的方法的最后一步涉及檢測有效地結(jié)合到免疫球蛋白的固體支持物。免疫 球蛋白包被的固體支持物的鑒定能夠診斷哪種病原體在感染患者（因?yàn)槊糠N固體支持物 與限定的致病抗原相匹配）。這個(gè)最后檢測步驟通過任何常規(guī)方法進(jìn)行，例如通過使用標(biāo)記 的檢測抗體以及通過鑒定固體支持物的性質(zhì)。
[0025] 有利地，本發(fā)明的方法僅涉及在患病患者中檢測抗體的存在，而不需要關(guān)于那些 抗體身份的知識。
[0026] 如在本申請的實(shí)驗(yàn)部分所示，本發(fā)明人用本發(fā)明的抗原偶聯(lián)方法來生成一些不同 抗原包被的熒光微球。目前，16組不同的微球已與16種純化嵌合[AGT-抗原]融合蛋白 相偶聯(lián)，從而允許滴定對以下不同蛋白特異的16種血清抗體：登革血清型1至4、西尼羅、 黃熱病、日本腦炎、蝶傳腦炎、圣路易腦炎、墨累谷腦炎（Murray Valley encephalitis)、 威塞爾布朗（Wesselsbron)、寨卡（Zika)、羅西奧（Rocio)、烏蘇圖（Usutu)、裂谷熱和基孔 肯雅病毒。這16組不同微球已被混合在單一樣本中而不影響檢測的靈敏度和特異性（參 見圖5)。這種系統(tǒng)的生產(chǎn)是高度時(shí)間效益和成本效益好的，因?yàn)橹恍铇O少量的重組抗原 (<50yg)來產(chǎn)生一組抗原偶聯(lián)的微球（?1.25X 106微球），這樣的組足以進(jìn)行500個(gè)個(gè) 體分析。
[0027] 在第一方面，本發(fā)明涉及用于在生物樣本中檢測至少兩個(gè)靶抗體的方法，其包 括：
[0028] (a)使第一固體支持物與生物樣本相接觸，所述第一固體支持物包含共價(jià)偶聯(lián)至 第一融合蛋白的AGT底物，所述第一融合蛋白包含具有06-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶活 性的AGT多肽和由第一靶抗體識別的第一表位；
[0029] (b)使第二固體支持物與生物樣本相接觸，所述第二固體支持物包含共價(jià)偶聯(lián)至 第二融合蛋白的AGT底物，所述第二融合蛋白包含具有06-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶活 性的AGT多肽和由第二靶抗體識別的第二表位；以及
[0030] (c)檢測兩個(gè)靶抗體的存在與否。
[0031] 更確切地說，本發(fā)明涉及用于在來自受試者的生物樣本中檢測至少兩種不同靶抗 體存在的體外分析方法，所述方法包括以下步驟：
[0032] (a)提供第一融合蛋白，其包括：
[0033] -含有由第一靶抗體識別的第一表位的多肽，以及
[0034] -具有06-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶活性的AGT多肽；
[0035] (b)使所述第一融合蛋白與第一固體支持物相接觸，所述支持物與所述AGT多肽 的底物共價(jià)偶聯(lián)；
[0036] (c)獲得與第一靶抗體識別的第一表位共價(jià)偶聯(lián)的第一固體支持物；
[0037] (d)提供第二融合蛋白，其包括
[0038] -含有第二表位的多肽，所述第二表位由第二靶抗體而不是由所述第一靶抗體所 識別，以及
[0039] -具有06-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶活性的AGT多肽；
[0040] (e)使所述第二融合蛋白與第二固體支持物相接觸，所述支持物與所述AGT多肽 的底物共價(jià)偶聯(lián)；
[0041] (f)獲得第二固體支持物，其與由第二靶抗體而不是由所述第一靶抗體識別的第 二表位共價(jià)偶聯(lián)，
[0042] 其中所述第一和第二固體支持物可彼此被特異性地鑒定出；
[0043] (g)使所述生物樣本與獲自步驟（c)和（f)的第一和第二固體支持物相接觸；
[0044] (h)檢測所述至少兩種靶抗體的存在。
[0045] 如下文所用，術(shù)語"抗體"、"融合蛋白"、"表位"、"抗原"、"AGT多肽"、"固體支持物" 等明顯理解為本領(lǐng)域通常的，即以廣義方式所理解的。特別是，它們不僅包括具體的單一分 子還包括一些所述分子。例如，術(shù)語"固體支持物"包括許多相同固體支持物的子集，術(shù)語 "微粒"包括許多相同的微粒的子集，以及術(shù)語"融合蛋白"包括一些相同的單一蛋白分子。 在本發(fā)明的上下文中，值得注意的是固體支持物攜帶一些相同的融合蛋白，所述融合蛋白 除AGT多肽以外還含有相同的抗原，并因此具有相同表位，以便在固體支持物上待檢測的 抗體可以被毫無疑義地鑒定。
[0046] 如本文所用，術(shù)語"融合蛋白"指含有通過人工連接兩個(gè)或更多多肽而產(chǎn)生的蛋白 或多肽的多肽。在本發(fā)明的免疫分析中，所述融合蛋白包含AGT多肽和含有至少一個(gè)表位 的抗原。融合蛋白可通過融合基因的遺傳工程而獲得。這通常涉及從編碼的第一個(gè)蛋白的 cDNA序列中去除終止密碼子，然后通過連接或重疊延伸PCR符合閱讀框地加上第二蛋白的 cDNA序列。然后，所述DNA序列將作為單一蛋白由細(xì)胞表達(dá)。所述蛋白可被工程化以包括 原始蛋白兩者的完整序列，或僅其中一部分。如果這兩個(gè)實(shí)體是蛋白，可以加入接頭（或 "間隔區(qū)"）肽，這使得蛋白獨(dú)立地折疊和如預(yù)期地行為更有可能。特別地，通過提供含有與 表位或抗原的編碼序列在閱讀框中的AGT編碼序列的載體，可以獲得本發(fā)明的融合蛋白， 所述表位或抗原的編碼序列可附著至AGT DNA序列的N末端或至C末端側(cè)。這些載體可引 入到原核宿主，其包括如大腸桿菌細(xì)菌的真細(xì)菌，或真核宿主，例如酵母、昆蟲細(xì)胞或哺乳 動(dòng)物細(xì)胞，以及重組融合蛋白可以在適當(dāng)條件下產(chǎn)生。典型的結(jié)構(gòu)存在于本申請的實(shí)驗(yàn)部 分。
[0047] 如本文所用，術(shù)語"抗體"意在包括單克隆抗體、多克隆抗體和嵌合抗體。優(yōu)選地， 待用本發(fā)明的免疫分析來檢測的抗體是多克隆抗體，其存在于患病患者的生物樣本中，并 且因此由不同B細(xì)胞來源產(chǎn)生。因此，其識別由致病抗原展示的不同表位（在另一方面，單 克隆抗體源自單一細(xì)胞系并識別相同表位）。
[0048] 抗體（或"免疫球蛋白"）由糖蛋白組成，所述糖蛋白包含由二硫鍵相連的至少兩 條重（H)鏈和兩條輕鏈（L)。每條重鏈包含重鏈可變區(qū)（或結(jié)構(gòu)域）（在本文中縮寫為HCVR 或VH)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域，CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可 變區(qū)（本文縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個(gè)結(jié)構(gòu)域CL。VH和VL 區(qū)可以進(jìn)一步細(xì)分為高變區(qū)，稱為"互補(bǔ)決定區(qū)"（CDR)或"高變區(qū)"，其主要負(fù)責(zé)結(jié)合抗原 表位并且其散布在更加保守稱為骨架區(qū)（FR)的區(qū)中。每個(gè)VH和VL由三個(gè)CDR和四個(gè)FR 組成，所述CDR和FR從氨基端到羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、 FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫 球蛋白結(jié)合至宿主組織或因子，包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞（例如，效應(yīng)細(xì)胞）和經(jīng)典補(bǔ)體系 統(tǒng)的第一成分（Clq)。
[0049] 抗體可以是不同的同種型（即IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)的。IgG和IgM型抗體 兩者可通過本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測。值得注意的是，這些同種型的組成是由二硫鍵連接的 兩條相同重鏈和兩條相同的輕鏈。重要的是，IgM抗體形成聚合物，其中多個(gè)免疫球蛋白通 過二硫鍵共價(jià)連接在一起，主要是作為五聚體也可作為六聚體以使其具有約900kDa的分 子量（以其五聚體形式）。因?yàn)槊總€(gè)單體具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，五聚體IgM有10個(gè)結(jié)合 位點(diǎn)。然而，通常IgM抗體不能在同一時(shí)間結(jié)合10個(gè)抗原，因?yàn)榇蠖鄶?shù)抗原的大尺寸阻礙 結(jié)合至附近的位點(diǎn)。由于IgM的聚合物性質(zhì)，其具有高親和力。
[0050] 由于本發(fā)明的方法也可以檢測到抗體片段。此術(shù)語意在包括Fab、Fab'、F(ab'）2、 scFv、dsFv、ds-scFv、二聚體、微體、雙體及其多聚體以及雙特異性抗體片段。
[0051] 單克隆抗體可以在本免疫分析中使用；例如，用于檢測結(jié)合至固體支持物的免疫 球蛋白。如本文中所用，"單克隆抗體"定義了從同源抗體群中所產(chǎn)生的抗體。更具體而言， 除了可以以最小比例發(fā)現(xiàn)的幾個(gè)可能天然存在的突變以外，群體的單個(gè)抗體是相同的。換 言之，單克隆抗體由源自單一細(xì)胞克?。ɡ珉s交瘤、由編碼均質(zhì)性抗體的DNA分子轉(zhuǎn)染的 真核宿主細(xì)胞、由編碼均質(zhì)性抗體的DNA分子所轉(zhuǎn)染的原核宿主細(xì)胞等）生長的均質(zhì)性抗 體所組成，并且通常表征為一種且僅一類和亞類的重鏈，以及僅一種類型的輕鏈。單克隆抗 體是高度特異性的并且針對單一抗原。另外，與通常包括針對各種決定簇或表位的各種抗 體的多克隆抗體的制備相反，每種單克隆抗體針對抗原的單一表位。
[0052] 術(shù)語"抗原"在本文中意為任何物質(zhì)，其引發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對所述物質(zhì)的抗體。 "免疫原性的"抗原是抗原的特定類型，其在自身被注入時(shí)能夠刺激適應(yīng)性免疫應(yīng)答。因此， 在分子水平上，抗原表征為其"結(jié)合"到抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的能力。
[0053] 在本發(fā)明的上下文中，如果抗體對所述抗原（或表位）具有高于105ΜΛ優(yōu)選高于 1〇 6ΜΛ更優(yōu)選高于10V的親和常數(shù)Ka(其為解離常數(shù)的倒數(shù)，即1/Kd)，則說所述抗體"結(jié) 合"限定的抗原（或表位）或"識別"所述抗原（或表位）。這種親和性可以通過例如平衡 透析或熒光淬滅來測量，這兩種技術(shù)在本領(lǐng)域中是常規(guī)使用的。
[0054] 在本發(fā)明的上下文中，抗原或表位包括：蛋白、脂蛋白、多糖以及糖蛋白。所述 蛋白包括病毒、細(xì)菌、寄生蟲、動(dòng)物和真菌蛋白如白蛋白、破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、百日 咳類毒素、細(xì)菌外膜蛋白（包括腦膜炎球菌外膜蛋白）、RSV-F蛋白、瘧疾衍生肽、B-乳球 蛋白B、抑肽酶、卵白蛋白、溶菌酶、線性肽、寡肽等。所述抗原也可以是腫瘤相關(guān)抗原如 癌胚抗原（CEA)、CA15-3、CA125、CA19-9、前列腺特異性抗原（PSA)、TAA復(fù)合物、SSX2或 NERCMSL。所述抗原還可以是半抗原以及其它含有低分子量分子的部分，如糖、寡糖、多糖、 肽、粘蛋白、毒素和變應(yīng)原（花粉、蛋清）。傳染性毒素是本領(lǐng)域公知的。可以列舉，例如 肉毒桿菌神經(jīng)毒素、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens)的ε毒素、蓖麻毒素、蛤 蛘毒素（saxitoxin)、志賀毒素（shigatoxin)、河豚毒素、葡萄球菌腸毒素等。粘蛋白也 是本領(lǐng)域中公知的。MUC5AC、MUC5B和MUC2是其實(shí)例。特別地，其可以是天然存在的多 糖，例如B組鏈球菌（steptococcal)和肺炎球菌莢膜多糖（包括III型）、銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) mucoexo多糖和莢膜多糖（包括費(fèi)希爾I型）、以及流感嗜血桿 菌（Haemophilus influenzae)多糖。
[0055] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原或表位通過選自以下的病毒表達(dá)：流感病 毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、HIV病 毒、黃熱病毒、登革熱病毒、日本腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒、烏蘇圖或西尼羅病毒、裂谷熱或 托斯卡納病毒、基孔肯雅病毒、呼吸道合胞（synticial)病毒、羅西奧病毒、麻疹病毒、穆 雷腦炎病毒、威塞爾布朗（Wesselbron)病毒、寨卡（Zika)病毒、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎 (choreomeningitis)病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、克里米亞-剛果出血熱病毒、拉沙 (Lassa)病毒、胡寧（Junin)病毒、馬丘波（Machupo)病毒、薩比亞（Sabia)病毒、瓜納里多 (Guanarito)病毒、腿腺炎病毒、狂犬病病毒、風(fēng)疫病毒、水痘帶狀皰疫病毒、單純皰疫1和2 型，更通常的ct病毒、腺病毒、艾柯病毒、輪狀病毒、黃病毒、鼻病毒、正本雅（orthobunya) 病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、人細(xì)小病毒、腸病毒、冠狀病毒、人乳頭狀瘤病毒、人巨細(xì)胞病毒、愛 潑斯坦-巴爾病毒、來自1、2和3型的副流感病毒、或任何鑒定的病毒。
[0056] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原或表位由屬于這樣科的病毒來表達(dá)，所述科 選自：黃病毒科（登革熱、黃熱、西尼羅、日本腦炎、蝶傳腦炎、丙型肝炎病毒）、披膜病毒科 (基孔肯雅、羅斯河、馬雅羅、西部馬腦炎、東部馬腦炎、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒）、本雅病毒科 (克里米亞-剛果出血熱、裂谷熱、施馬倫貝格病毒）、杯狀病毒科（戊型肝炎病毒）、沙粒病 毒科（拉沙）和絲狀病毒科（埃博拉、馬爾堡）。
[0057] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原或表位通過以下表達(dá)：寄生原蟲（例如 那些來自于利什曼蟲屬或剛地弓形蟲（Toxoplasma Gondii)、痢疾阿米巴（Entamoeba histolytica)、惡性痕原蟲（Plasmodium falciparum)、月市囊蟲（Pneumocystis carinii)、 或賈第鞭毛蟲（Giardia lamblia)、懦蟲（例如，線蟲、絳蟲、或吸蟲）、或節(jié)肢動(dòng)物（例如， 甲殼類、昆蟲、蛛形綱）。
[0058] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原或表位通過傳染性細(xì)菌表達(dá)，例如沙門 氏菌屬（Salmonella)、志賀氏菌屬（Shigella)、鏈球菌屬（Streptococcus)、葡萄球 菌屬（Staphylococcus)、支原體屬（Mycoplasma)、白喉（Diphteriae)、鉤端螺旋體屬 (Leptospirosa)、立克次氏體（Rickettsia)或埃希氏菌屬（Escherichia)中。在另一 優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)菌屬于選自以下種之一：流感嗜血桿菌（H. influenzae)、肺 炎鏈球菌（S. pneumoniae)、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae)、金黃色葡萄球菌 (S. aureus)、炭疽芽抱桿菌（Bacillus anthracis)、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes)、百日咳桿菌（Bordetella pertussis)、破傷風(fēng)桿菌（Clostridium tetani)、表皮葡萄球菌（S. epidermidis)、腦膜炎雙球菌（Ν· meningiditis)、綠膿桿 菌（Pseudomonas aeruginosa)、沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis)、結(jié)核桿菌 (Mycobacterium tuberculosis)、伯納特氏立克次體（Coxiella burnetii)、問號鉤端螺旋 體（Leptospirosa interrogans)和大腸桿菌（Ε· coli) 〇
[0059] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方案，所述抗原或表位由真菌或酵母（例如，來自物種念 珠菌屬（Candida)、曲霉屬（Aspergillus)、隱球菌屬（Cryptococcus)、組織胞楽菌屬 (Histoplasma)、肺孢子蟲屬（Pneumocystis)、或葡萄穗霉屬（Stachybotrys))表達(dá)。
[0060] 抗原通常存在幾個(gè)表面特征，其可作為對特異性抗體相互作用的點(diǎn)。任何這樣獨(dú) 特的分子特征組成表位。如本文所用，術(shù)語"表位"因此指定抗原的特定分子表面特征，例 如抗原的片段，其能夠結(jié)合至少一種抗體。因此，在分子水平上，表位對應(yīng)于抗原的特定分 子表面特征（例如，抗原的片段），其能被特定抗體識別和結(jié)合。在本發(fā)明的上下文中，"融 合蛋白"包含被靶抗體識別的至少一個(gè)表位。優(yōu)選地，所述融合蛋白包括包含幾個(gè)表位的整 個(gè)抗原。這些表位可以是線性或構(gòu)象表位。如本文所用，線性的（或順序的）表位是通過 其線性氨基酸序列或一級結(jié)構(gòu)被抗體所識別的抗原。與之相反，構(gòu)象表位是通過其特定的 三維形狀被識別。優(yōu)選地，本發(fā)明的融合蛋白含有構(gòu)象表位，因?yàn)榇蠖鄶?shù)多克隆抗體識別相 同的。
[0061] 然而，重要的是這種抗原不存在交叉反應(yīng)表位，即由其所結(jié)合的非特異性抗體識 別的表位。如果是的話，本發(fā)明方法的特異性將降低。
[0062] 在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述表位存在于病毒蛋白中，所述病毒蛋白選自：由 SEQIDN0:3編碼的登革病毒1的EDIII蛋白、由SEQIDN0:4編碼的登革病毒2的EDIII 蛋白、由SEQ ID N0:5編碼的登革病毒3的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:6編碼的登革病毒4 的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:7編碼的西尼羅病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:8編碼的黃 熱病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:9編碼的日本腦炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:10 編碼的寨卡病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:11編碼的威塞爾布朗（Wesselbron)病毒的 EDIII蛋白、由SEQ ID N0:12編碼的羅西奧病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:13編碼的穆 雷腦炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:14編碼的圣路易斯腦炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:54編碼的基因型1的日本腦炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:55編碼的基因型2 的日本腦炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:56編碼的基因型4的日本腦炎病毒的EDIII 蛋白、由SEQ ID N0:57編碼的基因型5的日本腦炎病毒的EDIII蛋白、以及由SEQ ID N0:58 編碼的拉本斯堡（Rabensburg)病毒的EDIII蛋白、以及HIV1、HIV2、乙型肝炎病毒、丙型肝 炎病毒、戊型肝炎病毒、西尼羅病毒、以及致癌HPV株例如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、 52、56、58、59、66和68的病毒蛋白。
[0063] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在本發(fā)明方法中使用的與hAGT酶融合在融合蛋白中的第 一和第二表位（或抗原）屬于同一分類級別，即其屬于相同科（例如，黃病毒科家族、本雅 病毒科、沙粒病毒科或絲狀病毒科）或?qū)倩蚍N，但具有不同的血清型。換言之，所述第一和 第二表位可通過密切相關(guān)的病毒來表達(dá)，例如屬于相同科、屬或種但具有不同血清型，如登 革病毒1、2、3、或4。
[0064] 或者，在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第一和第二表位（或抗原）屬于不相關(guān)生物的 科或?qū)倩蚍N。
[0065] 重要的是，本發(fā)明的免疫分析依賴于檢測大量已知或未知的抗體。"大量"在本文 中理解為至少5種，更優(yōu)選至少15種，更優(yōu)選至少50種以及甚至更優(yōu)選至少100種抗體。 因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的分析方法用于從受試者的生物樣本中檢測至少5種， 更優(yōu)選至少15種，和優(yōu)選至少50種以及甚至更優(yōu)選至少100種靶抗體。對于本發(fā)明的方 法而言，無所謂具體抗體是否被適當(dāng)表征，因?yàn)樗龇椒▋H依賴于檢測所述抗體的存在而 不是其性質(zhì)。
[0066] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，與所述第一和第二固體支持物偶聯(lián)的所述第一和第 二融合蛋白選自以下：
[0067] -SEQ ID NO :21(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-DEN1.EDIII])
[0068] -SEQ ID NO :42(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-SBV. N])
[0069] -SEQ ID NO :49(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-EV71. VP1])
[0070] -SEQ ID N0 :51 (對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-JE. sE])
[0071] -SEQ ID NO :53(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-JE-1.EDIII])
[0072] -SEQ ID NO :60(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-JE-2. EDIII])
[0073] -SEQ ID NO :62(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-JE-4. EDIII])
[0074] -SEQ ID NO :64(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-JE-5. EDIII])
[0075] -SEQ ID NO :66(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-RabV. EDIII])
[0076] -SEQ ID NO :68(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-黃病毒.EDIII])
[0077] -SEQ ID NO :70(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-RR. sE2])
[0078] -SEQ ID NO :72(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-MAY. sE2])
[0079] -SEQ ID NO :74(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-WEE. sE2])
[0080] -SEQ ID NO :76(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-EEE. sE2])
[0081] -SEQ ID NO :78(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-VEE. sE2])
[0082] -SEQ ID NO :80(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-AKA. N])
[0083] -SEQ ID NO :82(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-AIN. N])
[0084] -SEQ ID NO :84(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-SHA. N])
[0085] -SEQ ID NO :86(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-huCOV. N])
[0086] -SEQ ID NO :88(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-huCOV. S])
[0087] -SEQ ID NO :90(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-HCV. C])
[0088] -SEQ ID NO :92(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-MSP+AMA])
[0089] -SEQ ID NO :94(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-HbpAl])
[0090] -SEQ ID NO :96(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-MUB40])
[0091] -SEQ ID NO :98(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-moCLEC5A])
[0092] -SEQ ID NO :100(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-huCLEC5A])
[0093] -SEQ ID NO :102(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-cxVAGO])
[0094] -SEQ ID NO :104(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-aaVAGO])
[0095] -SEQ ID NO :109(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-CCHF. N])
[0096] -SEQ ID NO :111 (對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-EBO. N])
[0097] -SEQ ID NO :113(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-MAR. N])
[0098] -SEQ ID NO :115(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-LAS. N])
[0099] -SEQ ID NO : 117 (對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-JUN. N])
[0100] -SEQ ID NO :119(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-MAC. N])
[0101] -SEQ ID NO :121(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-GUA.N])
[0102] -SEQ ID NO :123(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-SAB. N])
[0103] -SEQ ID NO :125(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-OMSK. EDIII])
[0104] -SEQ ID NO :127(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-KYA. EDIII])
[0105] -SEQ ID NO :129(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-ALK. EDIII])
[0106] -SEQ ID NO :131 (對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-LAS. ectoGPl])
[0107] -SEQ ID NO :133(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-JUN. ectoGPl])
[0108] -SEQ ID NO :135(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-MAC. ectoGPl])
[0109] -SEQ ID NO :137(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-GUA. ectoGPl])
[0110] -SEQ ID NO :139(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-SAB. ectoGPl])
[0111] -SEQ ID NO :141(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-LAS. ectoGP2])
[0112] -SEQ ID NO :143(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-JUN. ectoGP2])
[0113] -SEQ ID NO :145(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-MAC. ectoGP2])
[0114] -SEQ ID NO :147(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-GUA. ectoGP2])
[0115] -SEQ ID NO : 149 (對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-SAB. ectoGP2])，以及
[0116] -SEQIDN0:151(對應(yīng)于融合蛋白[SNAP-HEV·C])。
[0117] 因此，本發(fā)明的體外方法能夠檢測為病毒、細(xì)菌、酵母或真菌介導(dǎo)感染的靶疾病。 優(yōu)選地，所述病毒感染是由以下導(dǎo)致：乳頭瘤病毒或來自黃病毒科（登革、黃熱、西尼羅、 日本腦炎、蜱傳腦炎、丙型肝炎病毒）的RNA病毒、披膜病毒科（基孔肯雅、羅斯河、馬雅 羅、西部馬腦炎、東部馬腦炎、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒）、本雅病毒科（克里米亞-剛果出血 熱、裂谷熱、施馬倫貝格病毒）、杯狀病毒科（戊型肝炎病毒）、沙粒病毒科（拉沙）和絲狀 病毒科（埃博拉、馬爾堡）。優(yōu)選地，所述細(xì)菌感染是由問號鉤端螺旋體（L印tospirosa Interrogans)導(dǎo)致的。優(yōu)選地，所述感染是由惡性痕原蟲（Plasmodium falciparum)導(dǎo)致 的。
[0118] 如本文所用，術(shù)語"生物樣本"是指從患者已經(jīng)獲得的并可能含有抗體的任何樣 本。優(yōu)選地，所述生物樣本是生物液體，例如未經(jīng)過濾的生物液體如尿液、腦脊液、胸膜液、 滑膜液、腹膜液、羊水、胃液、血液、血清、血漿、淋巴液、組織液、唾液、生理分泌物、眼淚、粘 液、汗液、乳汁、精子、精液、陰道分泌物、來自潰瘍和其它表面皮疹、水泡、以及膿腫的液體。 其也指組織提取物，包括正常、惡性以及可疑組織的活檢、或可含有抗體的身體的任何其它 成分。在所述生物樣本可以在使用前預(yù)先處理，例如從血液制備血漿、稀釋粘性流體等；治 療方法可以包括過濾、蒸餾、濃縮、干擾化合物的失活、以及加入試劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案 中，所述生物樣本選自全血、血清、血漿、尿液、精液、腦脊髓液和唾液。
[0119] 在本發(fā)明方法中可以使用任何具有06-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽。 出于本發(fā)明的目的，這些多肽將稱為"AGT多肽"。
[0120] AGT從其底物06-烷基鳥嘌呤-DNA上將烷基不可逆地轉(zhuǎn)移至其半胱氨酸殘基之 一。迅速與AGT反應(yīng)的底物類似物是06-芐基鳥嘌呤，其二級速率常數(shù)為約103秒
[0121] 在本發(fā)明的上下文中，如果多肽能夠從含有ο6-烷基鳥嘌呤的分子上將烷基不可 逆地轉(zhuǎn)移至其自己的半胱氨酸殘基之一上，則認(rèn)為多肽具有"0 6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn) 移酶的活性"（或"AGT活性")。例如，通過接觸已知標(biāo)記的06-芐基鳥嘌呤衍生物并監(jiān)測所 述標(biāo)記轉(zhuǎn)移至測試多肽，可證明所述多肽的"06-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶的活性"。如 果在細(xì)胞（in cellulo)或在細(xì)胞提取物中進(jìn)行分析，宿主細(xì)胞的內(nèi)源性AGT反應(yīng)應(yīng)加以控 制以使內(nèi)源性AGT不干擾所述多肽。因此，優(yōu)選使用已知的AGT-缺陷細(xì)胞系。現(xiàn)在，鑒定 AGT活性的分析是公知的。幾個(gè)06-芐基鳥嘌呤衍生物是商業(yè)上可獲得的（例如通過Santa Cruz生物技術(shù)分銷得到0 6-芐基鳥嘌呤，以及熒光標(biāo)記的06-芐基-鳥嘌呤衍生物可從New England Biolabs NEB 獲得）。這些分析中的一些在 W0 2005/085470 和 W02004/031405 中 公開。
[0122] 在本發(fā)明的上下文中，AGT多肽的"催化結(jié)構(gòu)域"對應(yīng)于所述酶的活性位點(diǎn)，或者 換句話說，對應(yīng)于酶的部分，其中發(fā)生從其底物0 6-烷基鳥嘌呤-DNA將烷基至反應(yīng)半胱氨 酸殘基的轉(zhuǎn)移。在hAGT于其活性位點(diǎn)結(jié)合06-芐基鳥嘌呤的結(jié)構(gòu)中，4個(gè)氨基酸在芐基 環(huán)（Prol40、Serl59、Glyl60)上接近，或可以接觸核堿基（Asnl57)的N9。之前已證明在 位置Prol40和Glyl60上的突變影響hAGT與0 6-芐基鳥嘌呤的反應(yīng)（Xu-Welliver等人， Biochemical Pharmacology 1999):認(rèn)為在位置140上的脯氨酸對于其與節(jié)基環(huán)的相互作 用是至關(guān)重要的，以及突變Glyl60Trp已被證明增加 hAGT對06-芐基鳥嘌呤的反應(yīng)性。
[0123] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有06-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶活性的AGT多肽是序 列 SEQ ID NO: 1 的人 AGT 多肽（參考 ΝΡ_002403· 2)、鑒定為 ΝΡ_032624· 1 的小鼠 AGT(SEQ ID NO :18)、鑒定為NP_036993. 1的大鼠 MGMT(SEQ ID NO :19)或者其同源序列，所述源序列 具有〇6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶活性。
[0124] 如本文所用，術(shù)語"同源的"是指具有序列相似性的序列。術(shù)語"序列相似性"，以 其所有語法形式，是指核酸或氨基酸序列之間的同一性或?qū)?yīng)程度。在本發(fā)明的上下文中， 當(dāng)至少約80%、或者至少約81 %、或者至少約82%、或者至少約83%、或者至少約84%、或 者至少約85%、或者至少約86%、或者至少約87%、或者至少約88%、或者至少約89%、或 者至少約90%、或者至少約91 %、或者至少約92%、或者至少約93%、或者至少約94%、或 者至少約95%、或者至少約96%、或者至少約97%、或者至少約98%、或者至少約99%的氨 基酸相似時(shí)，兩條氨基酸序列是"同源的"。優(yōu)選，通過使用Needleman和ffunsch算法鑒定 相似或同源的多肽序列。
[0125] 優(yōu)選地，AGT酶的同源序列與SEQ ID NO: 1分享至少64%的氨基酸序列同一性， 優(yōu)選至少約65%的氨基酸序列同一性、或者至少約66%的氨基酸序列同一性、或者至少約 67%的氨基酸序列同一性、或者至少約68%的氨基酸序列同一性、或者至少約69%的氨基 酸序列同一性、或者至少約70%的氨基酸序列同一性、或者至少約71%的氨基酸序列同一 性、或者至少約72 %的氨基酸序列同一性、或者至少約73 %的氨基酸序列同一性、或者至 少約74 %的氨基酸序列同一性、或者至少約75 %的氨基酸序列同一性、或者至少約76% 的氨基酸序列同一性、或者至少約77%的氨基酸序列同一性、或者至少約78%的氨基酸序 列同一性、或者至少約79 %的氨基酸序列同一性、或者至少是80 %的氨基酸序列同一性、 或者至少約81 %的氨基酸序列同一性、或者至少約82%的氨基酸序列同一性、或者至少約 83%的氨基酸序列同一性、或者至少約84%的氨基酸序列同一性、或者至少約85%的氨基 酸序列同一性、或者至少約86%的氨基酸序列同一性、或者至少約87%的氨基酸序列同一 性、或者至少約88 %的氨基酸序列同一性、或者至少約89 %的氨基酸序列同一性、或者至 少約90%的氨基酸序列同一性、或者至少約91%的氨基酸序列同一性、或者至少約92%的 氨基酸序列同一性、或者至少約93%的氨基酸序列同一性、或者至少約94%的氨基酸序列 同一性、或者至少約95%的氨基酸序列同一性、或者至少約96%的氨基酸序列同一性、或 者至少約97%的氨基酸序列同一性、或者至少約98%的氨基酸序列同一性以及或者至少 約99%的氨基酸序列同一性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，SEQ ID N0 :1的同源序列與SEQ ID NO : 1至少64 %，優(yōu)選70 %，以及更優(yōu)選80 %相同。
[0126] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述同源多肽是SEQ ID NO: 1的hAGT多肽的片段或突變 體，所述片段或突變體具有〇6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶活性。
[0127] 所述片段可具有至少50種，優(yōu)選100種，以及更優(yōu)選150種氨基酸的尺寸，并且至 少包含如上定義的AGT多肽的"催化結(jié)構(gòu)域"，其負(fù)責(zé)AGT酶的0 6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn) 移酶活性。這些片段可使用技術(shù)人員已知的一般技術(shù)獲得。
[0128] 到目前為止，已經(jīng)描述了源自天然AGT的不同突變酶（Lim A.等人，1996 ;Daniels D.S.等人，2000 Juillerat Α·等人，2003、W0 2005/085470、W0 2004/031405)。尤其是， 獲得了含有突變 Cys62Ala、Lysl25Ala、Alal27Thr、Argl28Ala、Glyl31Lys、Glyl32Thr、 皿6七1341^11、4找135561'、〇78150561'、4811157617、561'1596111、在182位氨基酸被截短的201^^ 的突變蛋白（WO 2005/085470中所謂的"AGT26"突變體，在WO 2006/114409中也稱為 "SNAP 26"）。這種特定突變體"SNAP26"已被證明具有增強(qiáng)的標(biāo)記活性。
[0129] 在本發(fā)明的上下文中，更優(yōu)選的AGT多肽序列包含W0 2005/085470中描述的突 變，其位置相對于SEQ ID N0:1可以很容易地調(diào)換，SNAP26的起始蛋氨酸殘基對應(yīng)于SEQ ID N0 :1第32位的蛋氨酸殘基（因此，31個(gè)氨基酸應(yīng)加入到W0 2005/085470所公開的位 置中，從而獲得SEQ ID NO: 1中對應(yīng)的那些）。
[0130] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的AGT同源序列對應(yīng)著SEQ ID N0 :1的天然AGT 序列，其中在1和30個(gè)之間，優(yōu)選6和25個(gè)之間，以及特別是14、15、16、17、18、19、20、21、 22或23個(gè)氨基酸被其它氨基酸所取代，和/或在C-端1至40個(gè)，優(yōu)選1至20個(gè)，特別是 10至20個(gè)氨基酸，更優(yōu)選15個(gè)氨基酸被刪除。
[0131] 在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，與SEQ ID N0 :1相比，AGT同源序列包含以下突變：
[0132] (A)Lys31取代為Arg、或Met32取代為Ser、或Cys93取代為Ala、或Lysl56取代 為Ala、或Alal58取代為Thr、或Argl59取代為Ala、或Glyl62取代為Lys、或Glyl63取代 為Thr、或Metl65取代為Leu、或Argl66取代為Ser、或Cysl81取代為Ser、或Asnl88取代 為Gly、或Serl90取代為Glu、或Gly214取代為Pro、或Ser215取代為Ala、或Ser216取代 為Gly、或Gly217取代為lie、或Leu218取代為Gly、或Gly220取代為Pro、或Ala221取代 為Gly、或Trp222取代為Ser，或
[0133] (B)Lys31-Met32 取代為 Arg-Ser、或 Alal58-Argl59 取代為 Thr-Ala、或 Glyl62-Glyl63 取代為 Lys-Thr、或 Metl65-Argl66 取代為 Leu-Ser、或 Glyl62-Glyl63/ Metl65-Argl66 取代為 Lys-Thr/Leu-Ser、或 Asnl88/Serl90 取代為 Gly/Glu、或 Gly214-Se r215-Ser216-Gly217-Leu218 取代為 Pro-Ala-Gly-Ile-Gly、或 Gly220-Ala221-Trp222 取 代為Pro-Gly-Ser，優(yōu)選與（A)中描述的任何其它氨基酸取代相組合，或
[0134] (C)在Leu223后截?cái)啵ò被?24-238被刪除），優(yōu)選與（A)或（B)中描述的任 何其它氨基酸取代相組合。
[0135] 優(yōu)選的AGT同源序列是在Leu223后被截?cái)嗟哪切?br> [0136] 優(yōu)選的AGT同源序列是在其中存在修飾（B)中的2個(gè)的那些，以及任選在Leu223 后截?cái)唷?br> [0137] 優(yōu)選的AGT同源序列是在其中存在修飾（B)中的3個(gè)的那些，以及任選在Leu223 后截?cái)唷?br> [0138] 優(yōu)選的AGT同源序列是在其中出現(xiàn)修飾（B)中的4個(gè)的那些，以及任選在Leu223 后截?cái)唷?br> [0139] 優(yōu)選的AGT同源序列是在其中存在修飾（B)中的5個(gè)的那些，以及任選在Leu223 后截?cái)唷?br> [0140] 優(yōu)選的AGT同源序列是在其中存在修飾（B)中的6個(gè)的那些，以及任選在Leu223 后截?cái)唷?br> [0141] 其它優(yōu)選的 AGT 同源序列是含有 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19或20個(gè)選自（A)中公開的修飾的突變的組合的那些，以及任選在Leu223后截?cái)唷?br> [0142] 在一個(gè)非常更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的AGT多肽是SEQ ID N0 :2的SNAP突 變體，其與hAGT酶同源并且與SEQ ID N0:1相比含有突變Lys31Arg、Met32Ser、Cys93Ala、 Lysl56Ala> Alal58Thr> Argl59Ala> Glyl62Lys> Glyl63Thr> Metl65Leu> Argl66Ser> Cysl81Ser、Asnl88Gly、Serl90Glu、Gly214Pro、Ser215Ala、Ser216Gly、Gly217ne、 Leu218Gly、Gly220Pro、Ala221Gly、Trp222Ser、以及在Leu223 后截?cái)?。SEQIDN0:2的 SNAP突變體與人6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶（NP_002403. 2，SEQ ID NO :1)的氨基酸 序列共享77%的同源性，并且與小鼠6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶（NP_032624. 1，SEQ ID NO :18)的氨基酸序列共享70%的同源性。
[0143] 在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，AGT酶是SEQ ID N0 :2的具有06-烷基鳥嘌呤-DNA 烷基轉(zhuǎn)移酶活性的SNAP突變蛋白或其同源物。優(yōu)選地，所述SNAP突變蛋白的同源序列與序 列SEQ ID N0 :2的SNAP突變蛋白是至少高于80%、優(yōu)選81 %、更優(yōu)選82%、更優(yōu)選83%、 更優(yōu)選84 %、更優(yōu)選85 %、優(yōu)選86 %、更優(yōu)選87 %、更優(yōu)選88 %、更優(yōu)選89 %、更優(yōu)選90 %、 更優(yōu)選91 %、更優(yōu)選92 %、更優(yōu)選93 %、更優(yōu)選94 %、更優(yōu)選95 %、更優(yōu)選96 %到甚至更優(yōu) 選97%相同，并且具有如上定義的06-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶活性。
[0144] 可以使用技術(shù)人員已知的蛋白工程技術(shù)、和/或使用分子進(jìn)化來產(chǎn)生所述具有 06-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶活性的同源多肽，以產(chǎn)生和選擇新的0 6-烷基鳥嘌呤-DNA 烷基轉(zhuǎn)移酶。這種技術(shù)是，例如靶向誘變、噬菌體展示法、飽和誘變、易錯(cuò)PCR以在序列的任 何地方引入變化，在飽和誘變和/或易錯(cuò)PCR后使用的DNA改組（shuffling)、或者使用來 自幾個(gè)物種的基因進(jìn)行的家族改組。
[0145] 在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，在本發(fā)明方法中使用的AGT多肽是SEQ ID N0:2的SNAP 突變體。
[0146] AGT酶從其底物06-烷基鳥嘌呤-DNA上將烷基不可逆地轉(zhuǎn)移至其半胱氨酸殘基之 一上。然而，在芐基環(huán)C4上的0 6-芐基鳥嘌呤的取代并不顯著影響AGT對06-芐基鳥嘌呤 衍生物的反應(yīng)性。這種性質(zhì)已用來將附在芐基環(huán)C4上的標(biāo)記轉(zhuǎn)移至AGT的芐基環(huán)（參見 W0 2004/031404 和 W0 2005/085470)。
[0147] 已證明一些06-芐基鳥嘌呤衍生物通過將其芐基轉(zhuǎn)移至AGT酶的活性位點(diǎn)半胱氨 酸上來與 AGT 酶反應(yīng)（參見 Damoiseaux 等人，ChemBiochem.，2001、W0 2004/031404 和 W0 2005/085470)。
[0148] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在本發(fā)明方法中使用的AGT底物是06芐基鳥嘌呤衍生物， 其具有式I :
[0149] R1-X-CH2-R3-R4-Y
[0150] 其中：
[0151] -R1是被所述AGT多肽作為底物識別的基團(tuán)，例如含有1至5個(gè)氮原子的雜芳基 團(tuán)，以及優(yōu)選如下式的嘌呤自由基：
[0152]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測存在于來自受試者的生物樣本中至少兩種不同靶抗體的體外分析方 法，所述方法包括以下步驟： (a) 提供第一融合蛋白，其包括： -含有由第一靶抗體識別的第一表位的多肽，以及 -具有06-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶活性的AGT多肽； (b) 使所述第一融合蛋白與第一固體支持物相接觸，所述支持物與所述AGT多肽的底 物共價(jià)偶聯(lián)； (c) 獲得與第一靶抗體識別的第一表位共價(jià)偶聯(lián)的第一固體支持物； (d) 提供第二融合蛋白，其包括： -含有第二表位的多肽，所述第二表位由第二靶抗體而不是由所述第一靶抗體所識別， 以及 -具有06-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶活性的AGT多肽； (e) 使所述第二融合蛋白與第二固體支持物相接觸，所述支持物與所述AGT多肽的底 物共價(jià)偶聯(lián)； (f) 獲得第二固體支持物，其與由第二靶抗體、而不是由所述第一靶抗體識別的第二表 位共價(jià)偶聯(lián)， 其中所述第一和第二固體支持物可彼此特異性地鑒定； (g) 使所述生物樣本與獲自步驟（c)和（f)的第一和第二固體支持物相接觸； (h) 檢測所述至少兩種靶抗體的存在。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其中所述的方法用于檢測來自受試者的生物樣本 中至少5種，更優(yōu)選至少15種以及甚至更優(yōu)選至少50種靶抗體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分析方法，其中所述第一和第二表位屬于相同的生物種 或?qū)儆诓幌嚓P(guān)的生物種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的分析方法，其中所述AGT多肽是SEQ ID N0:2 的SNAP突變體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的分析方法，其中所述AGT多肽的所述底物是06 芐基鳥嘌呤衍生物，其具有式I : R1-X-CH2-R3-R4-Y 其中： -R1是含有1至5個(gè)氮原子的雜芳基團(tuán)，優(yōu)選如下式的嘌呤自由基：
其中R5是氫、鹵素如氯或溴、三氟甲基、或羥基；R6是氫、羥基或者未取代的或取代的 氨基；以及R2是氫、1至10個(gè)碳原子的烷基、或糖部分； -X是氧或硫原子；優(yōu)選氧原子； -R3是芳香或雜芳基團(tuán)，或任選地被連接至CH2的雙鍵所取代的不飽和烷基、環(huán)烷基或 雜環(huán)基團(tuán)；優(yōu)選苯基，例如由在對位或間位的R4所取代的苯基； -R4是接頭部分，優(yōu)選-CH2-NH-C〇-NH-[C2H4-〇] n-，其中η在1至8,優(yōu)選2至6之間； -Υ是反應(yīng)性基團(tuán)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的分析方法，其中所述固體支持物可通過其特定 定位、尺寸、直徑、重量、粒度測定、和/或標(biāo)記來特異性鑒定。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的分析方法，其中所述固體支持物使用熒光染料、 生色團(tuán)、放射性同位素、和/或質(zhì)量標(biāo)簽來標(biāo)記。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的分析方法，其中所述固體支持物由聚苯乙烯、纖 維素、硝基纖維素、玻璃、陶瓷、樹脂、橡膠、塑料、二氧化硅、硅樹脂、金屬、和/或聚合物制 成。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的分析方法，其中所述固體支持物在接觸AGT底 物之前已使用與AGT底物的反應(yīng)性基團(tuán)互補(bǔ)的基團(tuán)進(jìn)行官能化。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的分析方法，其中所述固體支持物使用表面羧基 基團(tuán)進(jìn)行官能化。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的分析方法，其中所述AGT底物通過碳二亞胺 反應(yīng)共價(jià)偶聯(lián)至所述固體支持物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的分析方法，其中所述固體支持物是試管、微量 滴定孔、片、珠、芯片、和/或微粒。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的分析方法，其中所述固體支持物是微粒。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的分析方法，其中所述固體支持物有磁性。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的分析方法，其中所述固體支持物是用熒光染 料進(jìn)行內(nèi)部標(biāo)記的微粒。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的分析方法，其中所述固體支持物是用熒光染 料進(jìn)行內(nèi)部標(biāo)記的具有磁性的微粒，其封裝入含有表面羧基基團(tuán)的官能聚合物外包被中以 便共價(jià)偶聯(lián)配體。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的分析方法，其中所述第一和/或第二表位 存在于病毒蛋白中，所述病毒蛋白選自：SEQ ID ΝΟ:3的登革病毒1的EDIII蛋白、SEQ ID N0:4的登革病毒2的EDIII蛋白、SEQ ID NO:5的登革病毒3的EDIII蛋白、SEQ ID NO:6 的登革病毒4的EDIII蛋白、SEQ ID NO:7的西尼羅病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO:8的黃 熱病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO:9的日本腦炎病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO: 10的寨卡病 毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO: 11的威塞爾布朗病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO: 12的羅西奧 病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO: 13的穆雷腦炎病毒的EDIII蛋白、以及SEQ ID NO: 14的圣 路易斯腦炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:54編碼的基因型1的日本腦炎病毒的EDIII 蛋白、由SEQ ID N0:55編碼的基因型2的日本腦炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:56編 碼的基因型4的日本腦炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:57編碼的基因型5的日本腦炎 病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:58編碼的拉本斯堡病毒的EDIII蛋白、以及HIVUHIV2、 乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、西尼羅病毒以及致癌HPV株例如HPV16U8、 31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66 和 68 的病毒蛋白。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的分析方法，其中與所述第一和第二固體支持 物偶聯(lián)的所述第一和第二融合蛋白選自：SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:42、SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:51、SEQ ID N0:53、SEQ ID N0:60、SEQ ID N0:62、SEQ ID N0:64、SEQ ID N0:66、SEQ ID N0:68、SEQ ID N0:70、SEQ ID N0:72、SEQ ID N0:74、SEQ ID N0:76、SEQ ID N0:78、SEQ ID N0:80、SEQ ID N0:82、SEQ ID N0:84、SEQ ID N0:86、SEQ ID N0:88、SEQ ID N0:90、SEQ ID N0:92、SEQ ID N0:94、SEQ ID N0:96、SEQ ID N0:98、SEQ ID N0:100、SEQ ID N0:102、 SEQ ID N0:104、SEQ ID N0:109、SEQ ID N0:111、SEQ ID N0:113、SEQ ID N0:115、SEQ ID N0:117、SEQ ID N0:119、SEQ ID N0:121、SEQ ID N0:123、SEQ ID N0:125、SEQ ID N0:127、 SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149 和 SEQ ID NO:151。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的分析方法，其中所述生物樣本選自全血、血 清、血漿、尿液、精液、腦脊髓液和唾液。
20. -種試劑盒，其用于檢測存在于來自受試者的生物樣本中的至少兩種不同的靶抗 體，其包括在權(quán)利要求1中所限定的至少兩種固體支持物： -在權(quán)利要求1的步驟（c)中所獲得的第一固體支持物，其共價(jià)偶聯(lián)至第一 靶抗體所識別的第一表位；以及 -在權(quán)利要求1的步驟（f)中所獲得的第二固體支持物，其共價(jià)偶聯(lián)至第二 靶抗體、而不是所述第一靶抗體所識別的第二表位； 其中所述至少兩種固體支持物可以特異性地彼此鑒定以便能夠檢測兩種不同靶抗體。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，其包括至少10種，優(yōu)選至少50種，更優(yōu)選至少100 種不同的偶聯(lián)固體支持物。
22. 根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的試劑盒，其中所述固體支持物是微粒。
23. 根據(jù)權(quán)利要求20至22中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述固體支持物在至少一個(gè)單 區(qū)室中混合在一起。
24. 根據(jù)權(quán)利要求20至23中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述固體支持物是混合在微滴 定板的至少一個(gè)孔或在至少一個(gè)管中的微粒。
25. 根據(jù)權(quán)利要求20至24中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括用于檢測結(jié)合至固體 支持物的至少兩種靶抗體的工具。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的試劑盒，其中所述工具是識別靶抗體恒定部分的第二抗 體，所述第二抗體優(yōu)選被標(biāo)記。
27. 根據(jù)權(quán)利要求20至26中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述第一和/或第二表位存在 于病毒蛋白中，所述病毒蛋白選自：SEQ ID N0:3的登革病毒1的EDIII蛋白、SEQ ID N0:4 的登革病毒2的EDIII蛋白、SEQ ID N0:5的登革病毒3的EDIII蛋白、SEQ ID N0:6的登 革病毒4的EDIII蛋白、SEQ ID N0:7的西尼羅病毒的EDIII蛋白、SEQ ID N0:8的黃熱病 毒的EDIII蛋白、SEQ ID N0:9的日本腦炎病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO: 10的寨卡病毒的 EDIII蛋白、SEQ ID NO: 11的威塞爾布朗病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO: 12的羅西奧病毒 的EDIII蛋白、SEQ ID NO: 13的穆雷腦炎病毒的EDIII蛋白、以及SEQ ID NO: 14的圣路易 斯腦炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:54編碼的基因型1的日本腦炎病毒的EDIII蛋白、 由SEQ ID N0:55編碼的基因型2的日本腦炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:56編碼的 基因型4的日本腦炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:57編碼的基因型5的日本腦炎病毒 的EDIII蛋白、由SEQ ID N0:58編碼的拉本斯堡病毒的EDIII蛋白、以及HIV1、HIV2、乙型 肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、西尼羅病毒的病毒蛋白以及致癌HPV株如HPV16、 18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66 和 68 的病毒蛋白。
28. 根據(jù)權(quán)利要求20至26中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其包含由至少兩種融合蛋白所包 被的至少兩種固體支持物，所述至少兩種融合蛋白選自：SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:42、SEQ ID N0:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID N0:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID N0:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO: 100、 SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO: 115,SEQ ID NO: 117,SEQ ID NO: 119,SEQ ID N0:12USEQ ID NO: 123,SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO: 137,SEQ ID NO: 139,SEQ ID N0:14USEQ ID NO: 143,SEQ ID NO: 145,SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149 以及 SEQ ID NO: 151。
29. 權(quán)利要求20至28中任一項(xiàng)所限定的試劑盒用于檢測來自受試者的生物樣本中至 少兩種靶抗體的用途。
30. 權(quán)利要求20至28中任一項(xiàng)所限定的試劑盒用于診斷受試者中至少兩種靶疾病 的用途，其中所述靶疾病是由乳頭瘤病毒或來自黃病毒科（Flaviviridae)(登革、黃熱病、 西尼羅、日本腦炎、蜱傳腦炎、丙型肝炎病毒）、披膜病毒科（Togaviridae)(基孔肯雅、羅斯 河、馬雅羅、西部馬腦炎、東部馬腦炎、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒）、本雅病毒科（Bunyaviridae) (克里米亞-剛果出血熱、裂谷熱、施馬倫貝格病毒）、杯狀病毒科（Caliciviridae)(戊型 肝炎病毒）、沙粒病毒科（Arenaviridae)(拉沙）或絲狀病毒科（Filoviridae)(埃博拉、馬 爾堡）的RNA病毒所引起的病毒感染，由問號鉤端螺旋體（Leptospirosa Interrogans)引 起的細(xì)菌感染，或者由惡性痕原蟲（Plasmodium falciparum)引起的感染。
31. -種用于診斷受試者中至少一種靶疾病的體外方法，所述靶疾病已知在所述受試 者中誘導(dǎo)至少一種靶抗體的合成，所述體外方法包括進(jìn)行權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所限定 的分析方法，其中如果所述至少一種靶抗體的量高于對照值，則所述受試者被診斷為患有 所述至少一種靶疾病。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的體外診斷方法，其中所述至少一種靶疾病是由乳頭瘤病毒 或來自黃病毒科（登革、黃熱病、西尼羅、日本腦炎、蝶傳腦炎、丙型肝炎病毒）、披膜病毒科 (基孔肯雅、羅斯河、馬雅羅、西部馬腦炎、東部馬腦炎、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒）、本雅病毒科 (克里米亞-剛果出血熱、裂谷熱、施馬倫貝格病毒）、杯狀病毒科（戊型肝炎病毒）、沙粒病 毒科（拉沙）或絲狀病毒科（埃博拉病毒、馬爾堡）的RNA病毒所引起的病毒感染，由問號 鉤端螺旋體引起的細(xì)菌感染，或者由惡性瘧原蟲引起的感染。
33. 根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的體外診斷方法，其中所述方法用于診斷所述受試者中 至少5種，更優(yōu)選至少15種以及甚至更優(yōu)選至少50種病毒感染。
34. 根據(jù)權(quán)利要求31至33中任一項(xiàng)所述的體外診斷方法，其中所述對照值表示在來自 未患所述靶疾病的受試者樣本中所述靶抗體的量。
35. -種用于在官能化的固體支持物上共價(jià)偶聯(lián)具有06-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶 活性的AGT多肽的方法，所述方法包括以下步驟： a) 活化所述官能化的固體支持物； b) 加入所述AGT多肽的底物，所述底物懸浮于含有在0和20%之間的DMSO的緩沖液 中，在適當(dāng)條件下使得底物共價(jià)附著于所述支持物； c) 在PBS/DTT緩沖液中使所述AGT多肽接觸步驟b)的底物包被的支持物； 其中未結(jié)合的分子在步驟b)和c)后被洗脫。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中DTT在PBS/DTT緩沖液中濃度是ImM。
37. 根據(jù)權(quán)利要求35至36中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述固體支持物是使用熒光染料 進(jìn)行內(nèi)部標(biāo)記的具有磁性的微球，所述微球封裝入含有表面羧基基團(tuán)的官能聚合物外包被 中。
38. -種通過權(quán)利要求35至37中任一項(xiàng)所述的方法獲得的固體支持物。
39. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的固體支持物，其中所述固體支持物是微球。
40. 根據(jù)權(quán)利要求38或39所述的固體支持物在根據(jù)權(quán)利要求1至19所述的分析方法 中的用途。
41. 一種載體，其用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)施馬倫貝格病毒的N核蛋白，所述載體包含編 碼以下的核苷酸序列：a)在所述宿主細(xì)胞中具有功能的分泌信號肽；b)6-烷基鳥嘌呤-DNA 烷基轉(zhuǎn)移酶（AGT)、其突變體、片段或催化結(jié)構(gòu)域；以及c)SEQ ID NO: 16的施馬倫貝格病毒 的N核蛋白。
42. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的載體，其包含核苷酸序列SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 36 的核苷酸序列。
43. -種重組細(xì)胞，其被根據(jù)權(quán)利要求41或42所述的載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染。
44. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的重組細(xì)胞，其中所述重組細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞，優(yōu)選S2細(xì)胞。
45. 根據(jù)權(quán)利要求43或44所述的重組細(xì)胞，其中所述重組細(xì)胞是S2細(xì)胞，其已在2012 年4月24日以編號CNCM 1-4616保藏在法國國家微生物保藏中心（CNCM)，巴斯德研究所 (法國，巴黎15區(qū)郵編75724, Docteur Roux大街25號）。
46. -種融合多肽，其包含：a) 6-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶（AGT) (EC 2. 1. 1. 63)、 其突變體或催化結(jié)構(gòu)域；和b) SEQ ID NO: 16的施馬倫貝格病毒的N核蛋白。
47. 根據(jù)權(quán)利要求46所述的融合多肽，其具有SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42或SEQ ID N0:46。
48. -種用于制造權(quán)利要求20至28中任一項(xiàng)所限定的試劑盒的方法，所述方法包括以 下步驟： (a) 提供至少第一融合蛋白，其包含： -含有由第一靶抗體識別的第一表位的多肽，以及 -具有06-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶活性的AGT多肽； (b) 使所述第一融合蛋白與第一固體支持物相接觸，所述支持物與所述AGT多肽的底 物共價(jià)偶聯(lián)； (c) 獲得與第一靶抗體識別的第一表位共價(jià)偶聯(lián)的第一固體支持物； (d) 提供至少第二融合蛋白，其包括： -含有第二表位的多肽，所述第二表位由第二靶抗體而不是由所述第一靶抗體所識別， 以及 -具有06-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶活性的AGT多肽； (e) 使所述第二融合蛋白與第二固體支持物相接觸，所述支持物與所述AGT多肽的底 物共價(jià)偶聯(lián)； (f) 獲得與第二表位共價(jià)偶聯(lián)的第二固體支持物，所述第二表位由第二靶抗體而不是 由所述第一靶抗體所識別； 其中所述至少第一和至少第二固體支持物可彼此特異性地鑒定出。
49. 一種多重免疫篩選分析，其包含至少2、25、50、96種權(quán)利要求1或48所限定的固體 支持物，并且其中每種所述固體支持物在激發(fā)后發(fā)射不同的和可區(qū)分的波長。
50. -種多重免疫篩選分析方法，其包括： a) 使一種或幾種生物樣本接觸至少2、25、50、96種權(quán)利要求1或48所限定的固體支持 物，并且其中每種固體支持物在激發(fā)后發(fā)射不同的和可區(qū)分的波長；以及 b) 檢測靶抗體的存在或不存在。
51. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述靶抗體選自對來自病毒的抗原特異的抗 體，所述病毒根據(jù)WHO或FDA的指南為在血液庫中待檢測的，如例如選自HBV、HCV、HIV1、 HIV2和WNV的病毒。
52. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述靶抗體選自對致癌HPV株，例如HPV16、18、 31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66 和 68 特異的抗體。
53. 根據(jù)權(quán)利要求50至52中任一項(xiàng)所述的方法，其中每種所述靶抗體使用可檢測的標(biāo) 記進(jìn)行標(biāo)記。
54. -種用于進(jìn)行根據(jù)權(quán)利要求49所述的分析或根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法的設(shè)備， 所述設(shè)備包括： -技術(shù)裝置，其用于檢測從固體支持物中發(fā)射的光源和從靶抗體或結(jié)合到靶抗體的標(biāo) 記抗體中所發(fā)射的光源；以及 -計(jì)算或計(jì)算機(jī)裝置，其用于鑒定哪種固體支持物與靶抗體結(jié)合，從而說明在分析樣本 中存在或不存在抗原、細(xì)菌、病毒或寄生蟲。
55. -種用于在生物樣本中檢測至少兩種靶抗體的試劑盒，所述試劑盒包括： (a) 第一固體支持物，其包含與第一融合蛋白共價(jià)偶聯(lián)的AGT底物，所述第一融合蛋白 包含具有06-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶活性的AGT多肽和由第一靶抗體識別的第一表 位；以及 (b) 第二固體支持物，其包含與第二融合蛋白共價(jià)偶聯(lián)的AGT底物，所述第二融合蛋白 包含具有06-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶活性的AGT多肽和由第二靶抗體、而不是由所述 第一靶抗體識別的第二表位。
56. -種用于在生物樣本中檢測至少兩種靶抗體的方法，所述方法包括： (a) 使第一固體支持物與生物樣本相接觸，所述第一固體支持物包含共價(jià)偶聯(lián)至第一 融合蛋白的AGT底物，所述第一融合蛋白包含具有06-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶活性的 AGT多肽和由第一靶抗體識別的第一表位； (b) 使第二固體支持物與生物樣本相接觸，所述第二固體支持物包含共價(jià)偶聯(lián)至第二 融合蛋白的AGT底物，所述第二融合蛋白包含具有06-烷基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶活性的 AGT多肽和由第二靶抗體、而不是由所述第一靶抗體識別的第二表位；以及 (c)檢測兩種靶抗體的存在或不存在。
【文檔編號】G01N33/564GK104114697SQ201280069229
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月9日
【發(fā)明者】J-C·馬努圭拉, J·瓦努韋根, P·德普雷斯, S·保盧斯 申請人:巴斯德研究所