方波熱循環(huán)的制作方法
【專利摘要】本文公開(kāi)的實(shí)施方式涉及用于分析解鏈溫度，并且特別涉及用于分析雙螺旋核酸的方法和系統(tǒng)。
【專利說(shuō)明】方波熱循環(huán)
[0001]發(fā)明背景【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本文公開(kāi)的實(shí)施方式涉及用于分析解鏈溫度，并且特別涉及用于分析雙螺旋核酸的方法和系統(tǒng)。
[0003]相關(guān)技術(shù)描述
[0004]解鏈曲線分析可用于推論關(guān)于雙螺旋核酸的長(zhǎng)度、序列、GC含量和互補(bǔ)性的信息。如此，解鏈曲線分析廣泛地用于各種各樣的應(yīng)用，比如檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)和通過(guò)產(chǎn)生的解離圖形區(qū)分純合的野生型、雜合的和純合的突變等位基因。另外，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)之后解鏈曲線分析可用于檢測(cè)假的擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0005]然而，當(dāng)前可用的解鏈曲線分析技術(shù)具有局限性，尤其是就維持樣品之間和重復(fù)分析之間的一致性而言。因此，需要改進(jìn)核酸的解鏈曲線分析的速度和準(zhǔn)確度的方法和系統(tǒng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本技術(shù)涉及用于分析核酸解鏈曲線，尤其是關(guān)于雙螺旋核酸分子的方法和系統(tǒng)。在本技術(shù)的一些實(shí)施方式中，這種方法和系統(tǒng)允許具有改進(jìn)的速度和準(zhǔn)確度的解鏈溫度的分析。
[0007]在本文呈現(xiàn)的技術(shù)的一些實(shí)施方式中，提供了一種確定雙螺旋核酸分子的解鏈溫度的方法，其允許核酸解鏈曲線分析的改進(jìn)的速度和準(zhǔn)確度。該方法可包括使包括雙鏈核酸分子的溶液經(jīng)歷方波溫度梯度，該梯度包括引起雙鏈核酸分子至單鏈核酸分子的至少一種轉(zhuǎn)換的溫度范圍；并且在方波溫度梯度的過(guò)程中檢測(cè)該至少一種轉(zhuǎn)換。
[0008]在一些實(shí)施方式中，方波溫度梯度可包括一系列溫度脈沖，每個(gè)脈沖包括:將溶液的溫度升高至第一高溫；將溶液的溫度下降至第二低溫；其中第一高溫高于第二低溫；并且其中，在隨后的脈沖中，將第一高溫和第二低溫每個(gè)調(diào)節(jié)至分別高于先前脈沖中的第一和第二溫度。
[0009]本文還呈現(xiàn)了一種確定雙螺旋核酸分子的解鏈溫度的方法，該方法包括使包括多個(gè)單鏈核酸分子的溶液經(jīng)歷方波溫度梯度，該梯度包括引起單鏈核酸分子至雙鏈核酸分子的至少一種轉(zhuǎn)換的溫度范圍；并且在方波溫度梯度的過(guò)程中檢測(cè)該至少一種轉(zhuǎn)換。
[0010]在一些實(shí)施方式中，方波溫度梯度可包括一系列溫度脈沖，每個(gè)脈沖包括:將溶液的溫度升高至第一高溫；將溶液的溫度下降至第二低溫；其中第一高溫高于第二低溫；并且其中，在隨后的脈沖中，將第一高溫和第二低溫每個(gè)調(diào)節(jié)至分別低于先前脈沖中的第一和第二溫度。
[0011]本文還呈現(xiàn)了一種用于確定雙螺旋核酸分子的解鏈溫度的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括可編程的熱循環(huán)裝置；檢測(cè)器；和一種用于方波熱循環(huán)的程序，該程序包括用于以下的指令:使包括雙鏈核酸分子的溶液經(jīng)歷方波溫度梯度，該梯度包括引起雙鏈核酸分子至單鏈核酸分子的至少一種轉(zhuǎn)換的溫度范圍；并且在方波溫度梯度的過(guò)程中檢測(cè)該至少一種轉(zhuǎn)換。
[0012]在以上系統(tǒng)的一些實(shí)施方式中，方波溫度梯度包括一系列溫度脈沖，每個(gè)脈沖包括:將溶液的溫度升高至第一高溫；將溶液的溫度下降至第二低溫；其中第一高溫高于第二低溫；并且其中，在隨后的脈沖中，將第一高溫和第二低溫每個(gè)調(diào)節(jié)至分別高于先前脈沖中的第一和第二溫度。
[0013]本文還呈現(xiàn)了一種確定雙鏈核酸分子的解鏈溫度的方法，該方法包括:提供包括雙鏈核酸分子并且在存在雙螺旋核酸的情況下具有特征可檢測(cè)的信號(hào)的報(bào)道部分的樣品；使該樣品經(jīng)歷一系列溫度脈沖，其中至少多個(gè)脈沖引起雙鏈核酸分子轉(zhuǎn)換成單鏈分子并且轉(zhuǎn)換回成雙鏈分子；以及使用報(bào)道部分產(chǎn)生的信號(hào)檢測(cè)雙鏈核酸分子的解鏈溫度。
[0014]在一些實(shí)施方式中，每個(gè)溫度脈沖包括:將溶液的溫度升高至第一高溫；將溶液的溫度下降至第二低溫；其中第一高溫高于第二低溫；并且其中，在隨后的脈沖中，將第一高溫和第二低溫每個(gè)調(diào)節(jié)至分別高于先前脈沖中的第一和第二溫度。
[0015]本文還提供了一種確定核酸的雙鏈至單鏈轉(zhuǎn)換的動(dòng)力學(xué)信息的方法，該方法包括:提供包括雙鏈核酸分子并且在存在雙螺旋核酸的情況下具有特征可檢測(cè)的信號(hào)的報(bào)道部分的樣品；使該樣品經(jīng)歷一系列溫度脈沖，其中脈沖引起雙鏈核酸分子轉(zhuǎn)換成單鏈分子并且轉(zhuǎn)換回成雙鏈分子；以及使用報(bào)道部分產(chǎn)生的信號(hào)檢測(cè)在單鏈和雙鏈狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換t匕，由此狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換比提供了關(guān)于轉(zhuǎn)換的動(dòng)力學(xué)信息。
[0016]本文還呈現(xiàn)了一種確定雙螺旋核酸分子的解鏈溫度的方法，該方法包括:使包括單鏈核酸分子的溶液經(jīng)歷方波溫度梯度，該梯度包括引起單鏈核酸分子至雙鏈核酸分子的至少一種轉(zhuǎn)換的溫度范圍；并且在方波溫度梯度的過(guò)程中檢測(cè)該至少一種轉(zhuǎn)換。
[0017]在一些實(shí)施方式中，方波溫度梯度可包括一系列溫度脈沖，每個(gè)脈沖包括:將溶液的溫度升高至第一高溫；將溶液的溫度下降至第二低溫；其中第一高溫高于第二低溫；并且其中，在隨后的脈沖中，將第一高溫和第二低溫每個(gè)調(diào)節(jié)至分別低于先前脈沖中的第一和第二溫度。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1是顯示方波溫度曲線的一個(gè)例子的圖。溫度顯示在Y-軸和時(shí)間顯示在X-軸。星號(hào)指示在曲線期間進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)的時(shí)間。
[0019]圖2是顯示方波溫度曲線的一個(gè)例子的圖，溫度顯示在Y-軸和時(shí)間顯示在X-軸。
[0020]圖3是顯示常規(guī)的解鏈曲線分析的圖。指示雙鏈核酸的熒光信號(hào)顯示在Y-軸。溫度顯不在X-軸。
[0021]優(yōu)選的實(shí)施方式詳述
[0022]本文提供了基于在單鏈和雙鏈形式之間的解離溫度一一也被稱為解鏈曲線一解析核酸結(jié)構(gòu)的方法和系統(tǒng)。該方法和系統(tǒng)利用具有階梯的方波熱曲線，并且涉及在每一階梯高點(diǎn)和低點(diǎn)處測(cè)量熒光。
[0023]常規(guī)的解鏈曲線分析涉及頻繁對(duì)包含報(bào)道試劑的溶液體積光學(xué)取樣，所述報(bào)道試劑隨著雙鏈DNA響應(yīng)溫度上升解離而改變其報(bào)道特性，例如強(qiáng)度。然而，由于若干問(wèn)題，高精密解離方法準(zhǔn)確地和可再生地報(bào)道解鏈溫度的能力受到限制。例如，在標(biāo)準(zhǔn)解離曲線分析中，難以獲得熱控制的均一性，并且從溶液至溶液的準(zhǔn)確度難以再現(xiàn)。另外，解離不是新現(xiàn)象，并且因?yàn)檗D(zhuǎn)換包括熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)方面的混合，所以在雙鏈和單鏈形式之間的轉(zhuǎn)換具有一定的幅度。常規(guī)的解離方法也通常取決于熒光對(duì)溫度跡線的導(dǎo)數(shù)以去卷積重疊的解離特征。然而，導(dǎo)數(shù)峰的解析通常被熒光讀取中的噪聲所限制。
[0024]為了實(shí)現(xiàn)具有相似的解鏈溫度的核酸結(jié)構(gòu)的良好解析，通常用熱循環(huán)裝置的非常緩慢和精確的控制收集常規(guī)的解鏈曲線。用于常規(guī)分析的熱曲線是線性的，與用在擴(kuò)增反應(yīng)中的斜率相比，具有極其緩的斜率。然而，在許多情況中，由于應(yīng)用的溫度的不確定性，斜率難以精確地控制并且這表現(xiàn)在解鏈溫度結(jié)果的變化。因此，測(cè)量時(shí)間長(zhǎng)，以允許溫度的緩慢過(guò)渡以及在該溫度范圍頻繁地進(jìn)行的光學(xué)測(cè)量，以克服光學(xué)系統(tǒng)的噪聲限制。
[0025]更進(jìn)一步，因?yàn)橐蟮淖x數(shù)頻率通常高于掃描器讀取所有樣品的能力，用于一些設(shè)備的光學(xué)掃描器不是很好的適合于常規(guī)的解鏈曲線分析。如此，常規(guī)的掃描設(shè)備的替代方案包括:1)減慢熱升溫速率以適應(yīng)光學(xué)掃描頭(然而，這增加了運(yùn)行時(shí)間，并且對(duì)熱控制系統(tǒng)增加了更多限制)；或2)每次對(duì)一個(gè)樣品進(jìn)行解鏈曲線(也增加了總的運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)度)。
[0026]鑒于以上常規(guī)的解鏈曲線分析的局限性，令人意外地發(fā)現(xiàn)解鏈曲線分析可以類似掃描伏安法的形式進(jìn)行。具體地，在使用掃描伏安法解析混合溶液的電化學(xué)中遇到的問(wèn)題在某些方面與在常規(guī)的解鏈曲線分析中遇到的問(wèn)題類似。熱曲線的類似是應(yīng)用至電極的電壓的掃描。電化學(xué)中混合物的解析是使用線性斜坡上重疊的方波曲線。
[0027]因此，本文呈現(xiàn)的是解鏈曲線分析新形式的令人意外發(fā)現(xiàn)，其允許快速確定雙螺旋核酸分子或不同的雙螺旋核酸分子的混合物的解鏈溫度。在某些實(shí)施方式中，該方法包括:使包括雙鏈核酸分子的溶液經(jīng)歷方波溫度梯度，該梯度包括引起雙鏈核酸分子至單鏈核酸分子的至少一種轉(zhuǎn)換的溫度范圍；并且在方波溫度梯度的過(guò)程中檢測(cè)該至少一種轉(zhuǎn)換。
[0028]如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)方波指通常通過(guò)階梯狀的曲線定義的振蕩圖形。在熱曲線的背景下，方波圖形在高溫和低溫之間交替，具有瞬時(shí)或準(zhǔn)瞬時(shí)的過(guò)渡。然而，由于產(chǎn)生波形的系統(tǒng)的物理限制，理想的方波實(shí)際上通常不能實(shí)現(xiàn)。信號(hào)從低水平升至高水平并且又降回所需的時(shí)間通常分別稱為上升時(shí)間和下降時(shí)間。取決于使用的熱循環(huán)系統(tǒng)，上升時(shí)間和下降時(shí)間將從準(zhǔn)瞬時(shí)至一些有限的時(shí)間變化。如此，將認(rèn)識(shí)到在高水平和低水平之間，以及在低水平和高水平之間的過(guò)渡，可不導(dǎo)致具有垂直過(guò)渡的熱曲線。因此，當(dāng)繪制溫度對(duì)時(shí)間的函數(shù)時(shí)，術(shù)語(yǔ)方波可包括其中溫度過(guò)渡的斜率具有一些正的或負(fù)的斜率的圖形。
[0029]另外，本文呈現(xiàn)的方波曲線可包括在每個(gè)高溫和低溫處的保持時(shí)間。保持時(shí)間的長(zhǎng)度可如需要的變化以允許檢測(cè)雙鏈和單鏈核酸之間的轉(zhuǎn)換。因此，在瞬時(shí)檢測(cè)的實(shí)施方式中，保持時(shí)間可以是零或接近零。在其它實(shí)施方式中，檢測(cè)可涉及一定有限的時(shí)間，并且因此可維持高溫或低溫如需要的長(zhǎng)度，以檢測(cè)核酸是否處于單鏈或雙鏈形式。在一些實(shí)施方式中，保持時(shí)間可如需要的調(diào)節(jié)以允許核酸分子達(dá)到平衡。在一些實(shí)施方式中，保持時(shí)間可以是約O秒，少于約I納秒，少于約10納秒，少于約100納秒，少于約I微秒，少于約10微秒，少于約100微秒，少于約I毫秒，少于約10毫秒，少于約100毫秒，少于約I秒，少于約2、3、4、5、6、7、8、9或10秒或10秒或更多。
[0030]本文呈現(xiàn)的方波溫度曲線典型地重疊在溫度梯度上。如本文所使用的，溫度梯度指隨著時(shí)間推移溫度的改變。在常規(guī)的解鏈曲線分析中，溫度梯度是線性的并且具有緩的斜率以便于嚴(yán)密地控制溫度。在本文呈現(xiàn)的溫度曲線中，溫度梯度可具有總體正或總體負(fù)斜率。因此，當(dāng)方波圖形重疊在正斜率溫度梯度或負(fù)斜率溫度梯度上時(shí)，所得的圖形類似上行的或下行的階梯，如圖1和圖2中所顯示。
[0031]因此，在某些實(shí)施方式中，方波溫度梯度包括一系列溫度脈沖，每個(gè)脈沖包括:將溶液的溫度升高至第一高溫；將溶液的溫度下降至第二低溫；其中第一高溫高于第二低溫。在其中溫度曲線具有總體正斜率的實(shí)施方式中，在隨后的脈沖中，每個(gè)第一高溫和第二低溫典型地被調(diào)節(jié)至分別高于先前脈沖中的第一和第二溫度。在其中溫度曲線具有總體負(fù)斜率的實(shí)施方式中，在隨后的脈沖中，每個(gè)第一高溫和第二低溫典型地被調(diào)節(jié)至分別低于先前脈沖中的第一和第二溫度。將認(rèn)識(shí)到在一些實(shí)施方式中，在一個(gè)或多個(gè)脈沖之間高溫和低溫可保持相同并且仍產(chǎn)生具有總體正或負(fù)斜率的溫度曲線。相似地，在一些實(shí)施方式中，在一個(gè)或多個(gè)脈沖中的高溫和低溫可低于先前脈沖并且仍產(chǎn)生具有總體正斜率的溫度曲線。同樣，在一些實(shí)施方式中，在一個(gè)或多個(gè)脈沖中的高溫和低溫可高于先前脈沖，并且仍產(chǎn)生具有總體負(fù)斜率的溫度曲線。
[0032]在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)溫度脈沖可包括其中在雙鏈核酸分子和單鏈核酸分子之間發(fā)生可檢測(cè)的轉(zhuǎn)換的溫度范圍。例如，具有正總體斜率的曲線典型地開(kāi)始于包括高溫和低溫的脈沖，其每個(gè)低于雙螺旋核酸的解鏈溫度。同樣，具有負(fù)總體斜率的曲線典型地開(kāi)始于包括高溫和低溫的脈沖，其每個(gè)高于雙螺旋核酸的解鏈溫度。在這種實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)隨后的脈沖經(jīng)過(guò)雙螺旋核酸的解鏈溫度，并且檢測(cè)雙鏈至單鏈核酸的轉(zhuǎn)換，或單鏈至雙鏈核酸的轉(zhuǎn)換。
[0033]如本文所使用的，可檢測(cè)的轉(zhuǎn)換指指示雙螺旋核酸的存在或缺失的信號(hào)的改變。為了識(shí)別可檢測(cè)的轉(zhuǎn)換，本方法采用在溫度脈沖中的一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)處檢測(cè)信號(hào)。在某些實(shí)施方式中，檢測(cè)發(fā)生在每個(gè)溫度脈沖期間。將認(rèn)識(shí)到在可選實(shí)施方式中，檢測(cè)不需要發(fā)生在每個(gè)溫度脈沖中。例如，在其中不配置用于多樣品的同時(shí)檢測(cè)的單檢測(cè)器的檢測(cè)系統(tǒng)中，檢測(cè)器可檢測(cè)第一個(gè)樣品在第一脈沖期間的信號(hào)，并且然后檢測(cè)第二個(gè)樣品在第二脈沖期間的信號(hào)。
[0034]為了識(shí)別一種或多種可檢測(cè)的轉(zhuǎn)換，在溫度曲線期間進(jìn)行多點(diǎn)檢測(cè)。在某些實(shí)施方式中，檢測(cè)設(shè)定為在脈沖中的離散點(diǎn)處進(jìn)行。例如，在一些實(shí)施方式中，檢測(cè)在每個(gè)溫度脈沖中的高溫和低溫處進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，檢測(cè)可在整個(gè)溫度曲線進(jìn)行，并且是持續(xù)的或接近持續(xù)的。
[0035]本文提供的方法和系統(tǒng)可進(jìn)一步包括識(shí)別具有從雙鏈核酸至單鏈核酸分子的最大可檢測(cè)轉(zhuǎn)換的溫度脈沖。通過(guò)與常規(guī)的解鏈曲線類似，解鏈溫度典型地通過(guò)信號(hào)對(duì)溫度曲線的取導(dǎo)數(shù)識(shí)別。導(dǎo)數(shù)用于識(shí)別一個(gè)或多個(gè)指示樣品中具體的核酸種類的解鏈溫度的拐點(diǎn)。核酸種類的解鏈溫度通常稱為解離溫度，其中50%的種類為雙螺旋形式和50%為單鏈形式。破壞兩條核酸之間的堿基-堿基氫鍵需要的能量，并且因此解鏈溫度取決于其長(zhǎng)度、GC含量和其互補(bǔ)性?？捎绊懡怄湝囟鹊钠渌蛩匕ㄈ芤旱柠}濃度(例如見(jiàn)Sambrook 等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual 第二版(Cold Spring HarborLaboratory, (1989);通過(guò)引用并入本文)、溶液的pH,以及去污劑、抗衡離子、溶劑的存在，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素。在本文呈現(xiàn)的方法中，具有最大可檢測(cè)的轉(zhuǎn)換的溫度脈沖的識(shí)別用于確認(rèn)解鏈溫度，而不必進(jìn)行常規(guī)解鏈曲線典型地需要的另外的導(dǎo)數(shù)分析。因此，在某些實(shí)施方式中，識(shí)別最大可檢測(cè)的轉(zhuǎn)換包括計(jì)算在單個(gè)溫度脈沖內(nèi)的高溫處和低溫處測(cè)量的可檢測(cè)信號(hào)的差別。然后對(duì)比每個(gè)脈沖的可檢測(cè)信號(hào)的差別，以識(shí)別在高溫和低溫之間具有最大信號(hào)差別的脈沖。
[0036]在具體的溶液中的核酸分子可以是完全均質(zhì)的，其中每個(gè)雙鏈核酸種類具有相同的一級(jí)序列和互補(bǔ)序列，并且因此具有相同的解鏈溫度。在其它實(shí)施方式中，溶液可以是非均質(zhì)的，包括多個(gè)核酸種類，其中與其它雙鏈種類的一級(jí)序列和互補(bǔ)序列相比，溶液中的兩個(gè)或多個(gè)雙鏈種類每個(gè)具有不同的一級(jí)序列和互補(bǔ)序列。因此，基于每個(gè)種類特有的解鏈溫度，可以區(qū)分甚至具有僅 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或僅 20或更多堿基對(duì)差別的核酸種類。
[0037]本文呈現(xiàn)的方法和系統(tǒng)中的核酸種類可以是具有可檢測(cè)的解鏈溫度的任何核酸種類。術(shù)語(yǔ)核酸或寡核苷酸或本文語(yǔ)法上的等同物意味著共價(jià)地鍵合在一起的至少兩個(gè)核苷酸。本發(fā)明的核酸通常包含磷酸二酯鍵，雖然在一些情況中，如以下概述，包括可具有替代主鏈的核酸類似物，包括，例如，磷酰胺(Beaucage等，Tetrahedron49 (10):1925(1993)和其中的參考文獻(xiàn)；Letsinger, J.0rg.Chem.35:3800 (1970) ；Sprinzl 等，Eur.J.Biochem.81:579 (1977) ；Letsinger 等，Nucl.Acids Res.14: 3487 (1986) ；Sawai 等，Chem.Lett.805 (1984), Letsinger 等，J.Am.Chem.Soc.110:4470 (1988);和 Pauwels 等,Chemica Scripta26:14191986)),硫代憐酸酯(Mag 等，Nucleic Acids Res.19:1437 (1991);和美國(guó)專利號(hào) 5，644，048)，二硫代磷酸酯(Briu 等，J.Am.Chem.Soc.111:2321 (1989)，O-甲基亞憐酸胺鍵(見(jiàn) Eckstein,Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approach, Oxford UniversityPress)，和妝核酸主鏈和鍵(見(jiàn) Egholm, J.Am.Chem.Soc.114:1895(1992) ；Meier 等，Chem.1nt.Ed.Engl.31:1008 (1992) ；Nielsen, Nature, 365: 566 (1993) ；Carlsson 等，Nature380:207(1996)，通過(guò)引用將其所有并入)。其它類似物核酸包括具有正電荷主鏈(Denpcy 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA92:6097 (1995);非離子主鏈(美國(guó)專利號(hào) 5，386，023、5，637，684、5，602，240、5，216，141 和 4, 469, 863 ；Kiedrowshi 等，Angew.Chem.1ntl.Ed.English30:423 (1991) ；Letsinger 等，J.Am.Chem.Soc.110:4470 (1988)；Letsinger 等，Nucleoside&Nucleotidel3:1597 (1994)；第 2 和 3 章，ASC SymposiumSeries580, ^CarbohydrateModification in Antisense Research", Ed.Y.S.Sanghui和 P.Dan Cook ；Mesmaeker 等，Bioorganic&Medicinal Chem.Lett.4:395(1994) ；Jeffs等，J.Biomolecular NMR34:17 (1994) ；Tetrahedron Lett.37:743 (1996))和非核糖主鏈的那些，包括在美國(guó)專利號(hào)5，235，033和5，034，506以及ASC Symposium Series580,^CarbohydrateModification in Antisense Research",Ed.Y.S.Sanghui和P.Dan Cook第6和7章中描述的那些。包含一個(gè)或多個(gè)碳環(huán)糖的核酸也包括在核酸的定義中(見(jiàn)Jenkins等，Chem.Soc.Rev.(1995) pp.69-176)。在 Rawls, C&E News Jun.2，1997ρ.35 中描述了若干核酸類似物。所有這些參考文獻(xiàn)通過(guò)引用明確并入此處。例如，可進(jìn)行磷酸核糖主鏈的修飾以便于標(biāo)記的添加，或增加這種分子在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性和半衰期。術(shù)語(yǔ)核苷包括核苷酸以及核苷和核苷酸類似物，以及修飾的核苷，比如氨基修飾的核苷。另外，核苷包括非天然存在的類似物結(jié)構(gòu)。因此例如每個(gè)包含堿基的肽核酸的各個(gè)單元在本文稱為核苷。
[0038]因此，核酸種類可以是DNA、RNA的任何形式或類似物，以及其人工的和合成的變體。核酸種類可包括天然存在的和非天然的核苷酸類似物的任何結(jié)合。核酸種類可包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸，其中核苷酸的戊糖或核苷酸堿基或一個(gè)或多個(gè)磷酸酯已被其各自的類似物取代。在某些實(shí)施方式中，示例性磷酸酯類似物包括，但不限于烷基膦酸酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代憐酸酯(phosphorodithioate)、硒代憐酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代憐酸酯(phosphorodiselenoate)、苯胺硫代憐酸酯(phosphoroani1thioate)、苯胺憐酸酯(phosphoroaniIidate)、氨基磷酸酯、硼磷酸酯(boronophosphate)等，并且可包括相關(guān)的抗衡離子。將認(rèn)識(shí)到以上列出的或核酸種類的任何其它修飾型與其未修飾的對(duì)應(yīng)物相比可影響種類的Tm。
[0039]核酸分子可包括，但不限于,基因組DNA、cDNA、hnRNA、mRNA、rRNA、tRNA, RNA小分子，包括不限于miRNA和miRNA前體、siRNA、stRNA、snoRNA、其它非編碼RNA(ncRNA)，斷裂的核酸，從細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、亞細(xì)胞器比如線粒體或葉綠體獲得的核酸，以及從可在生物學(xué)樣品上或其中出現(xiàn)的微生物或DNA或RNA病毒獲得的核酸。例如，核酸分子可以是線性的、環(huán)狀的、發(fā)夾型的或任何其它結(jié)構(gòu)，其允許至少一部分核酸分子與另一種分子或其本身形成雙鏈相互作用。
[0040]核酸分子可包括一個(gè)或多個(gè)通用堿基。術(shù)語(yǔ)通用堿基旨在指與天然存在的核苷酸，即阿糖腺苷、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶，比天然存在的核苷酸之間形成較少氫鍵的核苷酸類似物。通用堿基可以是缺少氫鍵基團(tuán)但是仍可有效地包裝在雙螺旋DNA中的疏水堿基類似物，與天然堿基配對(duì)可顯示幾乎無(wú)選擇性。Mi I lican, T.A.等(1984)Nuc.Acids Res.12:7435-7453 ；Schweitzer, B.A.等(1995) J.Am.Chem.Soc.117:1863-1872 ；Matray, T.J.等(I999)Nature399 = 7CM-7O85Ogawa1A-K.等(2OOO)J.Am.Chem.Soc.122:3274-3287，通過(guò)引用將其公開(kāi)內(nèi)容全部明確并入本文。已描述了可非選擇性地雜交每個(gè)天然堿基的核堿基類似物。Van Aerschot, A.等(1995)Nucl.Acids Res.23:4363-4370 ;Zhang, P.等(1998)Nucl.Acids Res.26:2208-2215 ；Seela, F.等(1999), Nucleosides Nucletodiesl8:425-441 ；Bergstrom, D.E.等(1997)Nucl.AcidsRes.25:1935-1942 ；Asomova, 0.等(1997)Nucl.Acids Res.25:1930-1934 ；Bergstrom, D.E.,等(1995) J.Am.Chem.Soc.117: 120卜1209 ;Loakes, D.等(1995) Nucl.AcidsRes.23:2361-2366 ；Loakes, D.等(1995) Nucl.Acids Res.22:4039-4043 ;Nichols, R.等(1994)Nature369:492-493。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識(shí)，在本發(fā)明中可使用所有已知的核酸類似物?？捎迷诒疚拿枋龅姆椒ê徒M合物中的通用堿基的非限制性例子包括:脫氧肌苷、3-硝基吡咯(1，2)、或4_，5-,或6-硝基吲哚的脫氧核苷酸、1-(2’ -脫氧-β -D呋喃核糖基)-4_硝基吡唑，以及1-(2’ -脫氧-β -D呋喃核糖基)-4-硝基咪唑。
[0041]在一些實(shí)施方式中，核酸是肽核酸(PNA)，其包括肽核酸類似物。這些主鏈在中性條件下基本上是非離子的，與天然存在的核酸的高電荷磷酸二酯主鏈形成對(duì)比。這產(chǎn)生了兩個(gè)優(yōu)勢(shì)。第一，PNA主鏈展現(xiàn)改進(jìn)的雜交動(dòng)力學(xué)。相對(duì)于完美匹配的堿基對(duì)，由于錯(cuò)配，PNA的解鏈溫度(Tm)較大改變。由于內(nèi)部錯(cuò)配，DNA和RNA的Tm典型地展現(xiàn)2_4°C的下降。利用非離子PNA主鏈，下降更接近7-9°C，因此允許更好檢測(cè)錯(cuò)配。相似地，由于其非離子特性，附連在這些主鏈的堿基的雜交對(duì)于鹽濃度相對(duì)不敏感。
[0042]脫氧肌苷(〃dl〃)是通用堿基的優(yōu)選例子。肌苷能夠與A、C、T或G形成兩個(gè)氫鍵(見(jiàn) Barker, R., Organic Chemistry of Biological Molecules, Prentice-Hall, N.J.(1971);也見(jiàn) Martin 等(1985), Nucl.Acids Res.13(24):8927-8938)。通用堿基的其它優(yōu)選例子包括1-(2’_脫氧-β -D呋喃核糖基)-3-硝基吡咯、1-(2’_脫氧-β -D呋喃核糖基)-4-硝基吡唑、1- (2’ -脫氧-β -D呋喃核糖基)-4-硝基咪唑和1- (2’ -脫氧-β -D呋喃核糖基)-4_硝基吲哚。
[0043]術(shù)語(yǔ)雙鏈核酸分子、雙螺旋核酸和類似術(shù)語(yǔ)指以氫鍵結(jié)合的、典型地與DNA相關(guān)的螺旋陣列存在的一對(duì)核酸分子或相同分子的部分。術(shù)語(yǔ)雙鏈核酸分子、雙螺旋核酸和類似術(shù)語(yǔ)也指基本上雙鏈的那些配對(duì)分子，意味著包含由第一條核酸上的寡核苷酸引發(fā)位點(diǎn)的化學(xué)合成或第二條核酸的酶促合成中的設(shè)計(jì)或錯(cuò)誤引起的短錯(cuò)配區(qū)比如單、二或三核苷酸的那些。雙鏈核酸分子可作為雙鏈DNA或RNA、RNA/DNA異源雙鏈或RNA/DNA共聚物存在，其中術(shù)語(yǔ)“共聚物”指包括核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸二者的單鏈核酸。在典型的實(shí)施方式中，雙鏈核酸是使用任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于檢測(cè)雙鏈核酸分子的許多方法，比如檢測(cè)來(lái)自嵌入染料的熒光，能夠檢測(cè)的那些。術(shù)語(yǔ)單鏈核酸分子，指不以雙鏈形式存在的核酸分子或其部分。
[0044]雙鏈核酸種類將典型地包括在一個(gè)或多個(gè)區(qū)中互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)的兩條鏈。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)互補(bǔ)和基本上互補(bǔ)指在核苷酸或核酸之間，比如，例如在兩條雙鏈DNA分子之間或在寡核苷酸引物和待測(cè)序或擴(kuò)增的單鏈核酸上的引物結(jié)合位點(diǎn)之間的雜交或堿基對(duì)。因此，基本上互補(bǔ)序列可指與參考序列相比，同一性百分?jǐn)?shù)范圍是從100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、85、80、75或更少，或之間的任何數(shù)值的序列。
[0045]互補(bǔ)核苷酸通常是A和T (或A和U)或C和G。當(dāng)一條核苷酸——最佳地對(duì)齊和對(duì)比并且具有適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牖蛉笔б慌c另一條核苷酸至少約80%、通常至少約90%至95%以及更典型地從約98至100%配對(duì)時(shí)，兩個(gè)單鏈RNA或DNA分子被稱為基本上互補(bǔ)的。
[0046]優(yōu)勢(shì)
[0047]本技術(shù)提供比常規(guī)的解鏈曲線分析許多令人意外的優(yōu)勢(shì)。第一，方波熱循環(huán)使用熱循環(huán)裝置的設(shè)計(jì)意圖，即快速改變溫度的能力，而不是以一種違背設(shè)計(jì)意圖的方式試圖控制熱循環(huán)裝置。使用快速熱坡度而不是緩慢的熱梯度快速地完成掃描。
[0048]第二，方波方法固有地是導(dǎo)數(shù)方法，從而不需要另外的數(shù)據(jù)處理來(lái)確定解鏈溫度。假定識(shí)別出最佳波形，波形允許用少量的總體測(cè)量更多解析重疊轉(zhuǎn)換。
[0049]第三，階梯函數(shù)熱曲線更靈敏，因?yàn)樵趻呙柽^(guò)程期間報(bào)道分子具有機(jī)會(huì)在狀態(tài)之間(即解鏈的相對(duì)于退火的)翻轉(zhuǎn)許多次。
[0050]第四，該方法是減法技術(shù)，從而背景水平對(duì)分析信號(hào)產(chǎn)生顯著更少的干擾。
[0051]方波熱曲線提供動(dòng)力學(xué)信息，因?yàn)閳?bào)道分子在狀態(tài)之間重復(fù)地翻轉(zhuǎn)。如果動(dòng)力學(xué)在一個(gè)方向受限制，那么反應(yīng)的形狀將會(huì)改變。
[0052]本文呈現(xiàn)的方法具有易于以合適程序在任何熱循環(huán)裝置上進(jìn)行的另外優(yōu)勢(shì)。
[0053]將認(rèn)識(shí)到方波可從低溫遞升至高溫，或反之亦然。可調(diào)節(jié)每個(gè)方波脈沖的脈沖高度，以覆蓋不同的溫度跨度。一些典型的實(shí)施方式可使用等于使用常規(guī)的解鏈曲線測(cè)量的轉(zhuǎn)換的寬度的一半的方波高度。以總體測(cè)量時(shí)間為代價(jià)，可改變?cè)诮o定的平均溫度下測(cè)量的脈沖數(shù)目，以降低噪聲并且提高精確度。[0054]本文呈現(xiàn)的方法與應(yīng)用至電化學(xué)系統(tǒng)的方波伏安法具有一些類似。在電化學(xué)中，成階梯狀的是電壓而不是溫度。
[0055]圖1闡述了方波熱曲線的一個(gè)實(shí)施方式。如圖1中所顯示，方波階梯曲線包括在線性斜坡上重疊的方波?？傮w坡度是溫度相對(duì)于時(shí)間向下的梯度。在坡度過(guò)程期間曲線包括多個(gè)脈沖。在每個(gè)脈沖處，使溶液經(jīng)歷寬的溫度范圍，并且在兩點(diǎn)檢測(cè)信號(hào)。
[0056]圖2代表了另一個(gè)熱曲線坡度，溫度隨著時(shí)間總體增加。如圖2中所指示，溫度曲線經(jīng)過(guò)一系列脈沖。每個(gè)脈沖包括過(guò)渡跳躍。如本文所使用的，過(guò)渡跳躍是溫度從低溫(!Y)增加至高溫(Th)。在圖2顯示的實(shí)施方式中，對(duì)于每個(gè)隨后的脈沖，IY增加使得每個(gè)隨后的脈沖中的?Υ高于先前脈沖中的?Υ。相似地，增加TH，使得每個(gè)隨后的脈沖中的Th高于先前脈沖中的TH。在每個(gè)脈沖內(nèi)，平均溫度Ti定義為IY和Th的和的一半。
[0057]在一些實(shí)施方式中，雙螺旋核酸經(jīng)由在存在雙螺旋核酸的情況下具有特征可檢測(cè)的信號(hào)的報(bào)道部分檢測(cè)。在圖2示例的熱曲線中，雙螺旋核酸經(jīng)由在存在雙螺旋核酸的情況下具有熒光信號(hào)的報(bào)道部分檢測(cè)。在每個(gè)脈沖內(nèi)的?Υ和Th處獲取熒光讀數(shù)，產(chǎn)生每個(gè)脈沖的低溫讀數(shù)(FLh)和高溫讀數(shù)(FLh)。每個(gè)脈沖的熒光變化(AFL)是該脈沖的FL1^P FLh之間的差。
[0058]脈沖之間的溫度階梯
[0059]如本文所使用的，每個(gè)脈沖中低溫的溫度階梯(Λ TstqJ可描述為一個(gè)脈沖中的IY和先前脈沖中的 ?Υ的差。相似地，每個(gè)脈沖中高溫的溫度階梯(ATstepll)可描述為一個(gè)脈沖中的Th和先前脈沖中的Th的差。將認(rèn)識(shí)到Λ TstepL或Λ Tstepa可以是任何的溫度改變，其導(dǎo)致溫度隨時(shí)間的總體正斜率或總體負(fù)斜率。因此，具有正Λ TstepL和/或Λ Tstepa的一系列脈沖將產(chǎn)生總體正斜率。同樣，具有負(fù)Λ TstepL和/或Λ Tstepa的一系列脈沖將產(chǎn)生總體負(fù)斜率。
[0060]如本文所使用的，正總體斜率指其中平均Λ TstepL和/或Λ Tstepa是正的曲線。典型地，具有正總體斜率的曲線開(kāi)始于低于雙螺旋DNA的解鏈溫度的IY和Th溫度。典型地，具有正總體斜率的曲線結(jié)束于高于雙螺旋DNA的解鏈溫度的IY和Th溫度。
[0061]因此，在一些實(shí)施方式中，總體斜率是正的。在一些這樣的實(shí)施方式中，整個(gè)曲線的每個(gè)ATstep是正的。例如，在典型的實(shí)施方式中，每個(gè)隨后的I；大于每個(gè)之前的IY值。然而，將認(rèn)識(shí)到，在某些其中熱曲線具有正斜率的實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)?Υ值可低于之前的?Υ值，并且隨著時(shí)間仍導(dǎo)致具有正總體溫度斜率的曲線。相似地，在一些具有正總體斜率的實(shí)施方式中，每個(gè)隨后的Th值將大于每個(gè)之前的Th值。然而，將認(rèn)識(shí)到，在某些其中熱曲線具有正斜率的實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)Th值可低于之前的Th值，并且隨著時(shí)間仍導(dǎo)致具有正總體溫度斜率的曲線。
[0062]如本文所使用的，負(fù)總體斜率指其中平均Λ TstepL和/或Λ Tstepa是負(fù)的曲線。典型地，具有負(fù)總體斜率的曲線開(kāi)始于高于雙螺旋DNA的解鏈溫度的IY和Th溫度。典型地，具有負(fù)總體斜率的曲線結(jié)束于低于雙螺旋DNA的解鏈溫度的IY和Th溫度。
[0063]因此，在某些實(shí)施方式中，總體斜率是負(fù)的。在一些這樣的實(shí)施方式中，整個(gè)曲線的每個(gè)ATstep是負(fù)的。例如，在典型的實(shí)施方式中，每個(gè)隨后的I；低于每個(gè)之前的IY值。然而，將認(rèn)識(shí)到，在某些其中熱曲線具有負(fù)斜率的實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)?Υ值可大于之前的?Υ值，并且隨著時(shí)間仍導(dǎo)致具有負(fù)總體溫度斜率的曲線。相似地，在具有負(fù)總體斜率的典型的熱曲線中，每個(gè)隨后的Th值將低于每個(gè)之前的Th值。然而，將認(rèn)識(shí)到，在某些其中熱曲線具有負(fù)斜率的實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)Th值可大于之前的Th值，并且隨著時(shí)間仍導(dǎo)致具有正總體溫度斜率的曲線。
[0064]因此，在一些實(shí)施方式中，ATstepL的絕對(duì)值可以是，例如，低于約0.001°C、或約
0.0010C>0.01°C、0.1°C、0.2°C、0.3°C、0.4°C、0.5°C、0.6°C、0.7°C、0.8°C、0.9°C、1.(TC、
1.1 °C > 1.2 °C > 1.3 °C > 1.4 °C > 1.5 °C > 1.6 °C > 1.7 °C > 1.8 °C > 1.9 °C >2.0 °C >2.1 °C >2.2 °C >
2.3 °C >2.4 °C >2.5 °C >2.6 °C >2.7 °C >2.8 °C >2.9 °C >3.0 °C >3.1 °C >3.2 °C >3.3 °C >3.4 °C >
3.5 °C >3.6 °C >3.7 °C >3.8 °C >3.9 °C >4.0 °C >4.1 °C >4.2 °C >4.3 °C >4.4 °C >4.5 °C >4.6 V、
4.7 °C >4.8 °C >4.9 °C >5.0 °C >5.1 °C >5.2 °C >5.3 °C >5.4 °C >5.5 °C >5.6 °C >5.7 °C >5.8 V、
5.9 °C >6 °C >7 °C >8 °C >9 °C > 10 °C > 11 °C > 12 °C > 13 V、14 °C、15 V、16 °C、17 V、18 °C、19 V、約20°C或更多，以及其之間的任何溫度值。在典型的實(shí)施方式中，ATst_范圍的絕對(duì)值在從約1.(TC至約5.(TC之間。在一些實(shí)施方式中，ΛTst_對(duì)于曲線中的每個(gè)脈沖是相同的。例如，如圖2中所顯示，Λ Tst_對(duì)于每個(gè)脈沖是相同的。將認(rèn)識(shí)到在其它實(shí)施方式中，曲線的一個(gè)或多個(gè)脈沖中的ATst_可以不同。
[0065]相似地，在一些實(shí)施方式中，ATstepll的絕對(duì)值可以是，例如，低于約0.001°C、或約 0.001°C>0.01°C>0.1°C>0.2°C>0.3°C>0.4°C>0.5°C>0.6°C>0.7V、0.8°C>0.9°C>1.(TC、
1.1 °C > 1.2 °C > 1.3 °C > 1.4 °C > 1.5 °C > 1.6 °C > 1.7 °C > 1.8 °C > 1.9 °C >2.0 °C >2.1 °C >2.2 °C >
2.3 °C >2.4 °C >2.5 °C >2.6 °C >2.7 °C >2.8 °C >2.9 °C >3.0 °C >3.1 °C >3.2 °C >3.3 °C >3.4 °C >
3.5 °C >3.6 °C >3.7 °C、3.8 °C、3.9 °C、4.0 °C、4.1 °C、4.2 °C、4.3 °C、4.4 °C、4.5 °C、4.6 V、
4.7 °C >4.8 °C >4.9 °C >5.0 °C >5.1 °C >5.2 °C >5.3 °C >5.4 °C >5.5 °C >5.6 °C >5.7 °C >5.8 V、
5.9 °C >6 °C >7 °C >8 °C >9 °C > 10 °C > 11 °C > 12 °C > 13 V、14 °C、15 V、16 °C、17 V、18 °C、19 V、約20°C或更多，以及在其之間的任何溫度值。在典型的實(shí)施方式中，ATst_范圍的絕對(duì)值在從約1.(TC至約5.(TC之間。在一些實(shí)施方式中，Λ Tst_對(duì)于曲線中的每個(gè)脈沖是相同的。例如，如圖2中所顯示，Λ Tst_對(duì)于每個(gè)脈沖是相同的。將認(rèn)識(shí)到在其它實(shí)施方式中，在曲線的一個(gè)或多個(gè)脈沖中的ATst_可以不同。
[0066]脈沖內(nèi)的溫度過(guò)渡
[0067]如本文所使用的，溫度過(guò)渡跳躍高度(Λ Ttrans)指脈沖內(nèi)的高溫Th和低溫IY之間的差。將認(rèn)識(shí)到ATtrans可以是任何適合的溫度范圍。例如，在一些實(shí)施方式中，脈沖的ATtans 可以是，例如，低于約 0.001。。、或約 0.0Ol0C>0.0rc、0.rc、0.2°C>0.3°C>0.4°C、
0.5 °C、0.6 °C、0.7 °C、0.8 °C、0.9 °C、1.0 °C、1.1 °C、1.2 °C、1.3 °C、1.4 °C、1.5 °C、1.6 °C、
1.7 °C > 1.8 °C > 1.9 °C >2.0 °C >2.1 °C >2.2 °C >2.3 °C >2.4 °C >2.5 °C >2.6 °C >2.7 °C >2.8 °C >
2.9 °C >3.0 °C >3.1 °C >3.2 °C >3.3 °C >3.4 °C >3.5 °C >3.6 °C >3.7 °C >3.8 °C >3.9 °C >4.0 °C >
4.1 °C、4.2 °C、4.3 °C、4.4 °C、4.5 °C、4.6 °C、4.7 °C、4.8 °C、4.9 °C、5.0 °C、5.1 °C、5.2 V、
5.3 °C >5.4 °C >5.5 °C >5.6 °C >5.7 °C >5.8 °C >5.9 °C >6 °C >7 °C >8 °C >9 °C > 10 °C > 11 °C > 12 °C >13°C、14°C、15°C、16°C、17°C、18°C、19°C、約20°C或更多，以及在其之間的任何溫度值。在典型的實(shí)施方式中，ATtrans范圍在從約5°C至約10°C之間。在一些實(shí)施方式中，ATtrans對(duì)于曲線中的每個(gè)脈沖是相同的。例如，如圖2中所顯示，ATtans對(duì)于每個(gè)脈沖是相同的。將認(rèn)識(shí)到在其它實(shí)施方式中，曲線的一個(gè)或多個(gè)脈沖中八1\^可以是不同的。
[0068]雖然ATtans可以是任何適合的溫度范圍，但一種確定方波熱曲線的有用AIteans的方法是測(cè)量相應(yīng)于在常規(guī)解鏈曲線中的脈沖寬度的一半的溫度范圍。具體地，如圖3中所顯示，常規(guī)的解鏈曲線在從低至高的溫度范圍內(nèi)測(cè)量嵌入染料的熒光。常規(guī)的解鏈曲線可典型地被分割成三個(gè)溫度范圍:1)低溫區(qū)，其中熒光相對(duì)高并且不變；2)過(guò)渡區(qū)，其中熒光水平隨著溫度上升而下降；和3)高溫區(qū)，其中熒光相對(duì)低并且不變。解鏈溫度通常落在其中熒光的下降達(dá)到拐點(diǎn)的點(diǎn)處。因此，例如，常規(guī)解鏈曲線中的過(guò)渡區(qū)可能跨越范圍從50°C至70°C的20°C區(qū)域。在這樣的實(shí)例中，過(guò)渡寬度的一半將是10°C跨度。因此，使用本文呈現(xiàn)的熱曲線分析相同的雙螺旋核酸，有用的過(guò)渡跳躍高度ATtrans將是10°C，或常規(guī)解鏈曲線上過(guò)渡寬度的一半。
[0069]系統(tǒng)和設(shè)各
[0070]本文還提供了一種用于確定雙螺旋核酸分子的解鏈溫度的系統(tǒng)。該系統(tǒng)可包括可編程的熱循環(huán)裝置；檢測(cè)器；和用于方波熱循環(huán)的程序，其中該程序包括用于以下的指令:使包括雙鏈核酸分子的溶液經(jīng)歷方波溫度梯度，該梯度包括引起雙鏈核酸分子至單鏈核酸分子的至少一種轉(zhuǎn)換的溫度范圍；并且在方波溫度梯度過(guò)程中檢測(cè)該至少一種轉(zhuǎn)換。
[0071]可編程的熱循環(huán)裝置可以是任何適合的允許進(jìn)入檢測(cè)器以檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)核酸樣品中的轉(zhuǎn)換的這種裝置?？删幊痰臒嵫h(huán)設(shè)備是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的設(shè)備能夠在溫度之間快速循環(huán)。
[0072]檢測(cè)器可以是能夠檢測(cè)單鏈和雙鏈核酸之間的轉(zhuǎn)換的任何適合的檢測(cè)器。用于檢測(cè)報(bào)道部分比如嵌入染料的熒光的檢測(cè)器是本領(lǐng)域熟知的。同樣，用于檢測(cè)UV吸光度的檢測(cè)器是本領(lǐng)域熟知的。在一些實(shí)施方式中，該系統(tǒng)進(jìn)一步包括光源。在存在雙螺旋核酸的情況下將吸光度或熒光用作特征可檢測(cè)信號(hào)的地方可使用光源。用于UV吸收的光源以及提供用于熒光的激發(fā)光的光源是本領(lǐng)域熟知的。
[0073]如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)程序指執(zhí)行任務(wù)或過(guò)程的指令或命令。術(shù)語(yǔ)程序可與術(shù)語(yǔ)模塊互換地使用。在某些實(shí)施方式中，程序可以是在同一套命令下執(zhí)行的各種各樣的指令的編譯。在其它實(shí)施方式中，程序可指離散的程序組或文檔。
[0074]通過(guò)檢測(cè)器獲得的程序以及信號(hào)數(shù)據(jù)可存儲(chǔ)于任何適合的存儲(chǔ)容量。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)存儲(chǔ)器、存儲(chǔ)設(shè)備、存儲(chǔ)容量等可指存儲(chǔ)信息的任何介質(zhì)、設(shè)備或方式。存儲(chǔ)器可包括，但不限于，磁盤(pán)驅(qū)動(dòng)設(shè)備比如硬盤(pán)、軟盤(pán)、光盤(pán)或磁光盤(pán)，內(nèi)存比如RAM或ROM芯片，以及用于記錄或存儲(chǔ)數(shù)據(jù)的任何其它介質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，將存儲(chǔ)容量連接至處理器，其獲得之后，將記錄的信息發(fā)送至存儲(chǔ)容量。在具體的實(shí)施方式中，通過(guò)系統(tǒng)獲得信號(hào)數(shù)據(jù)并且記錄在存儲(chǔ)容量上。在其它實(shí)施方式中，通過(guò)系統(tǒng)獲得信號(hào)數(shù)據(jù)并且信息首先被處理，并且將處理的信息記錄在存儲(chǔ)容量上。
[0075]雙螺旋核酸的檢測(cè)
[0076]在本文提供的方法中，通過(guò)檢測(cè)指示雙螺旋核酸水平的信號(hào)，監(jiān)測(cè)單鏈和雙鏈核酸之間的轉(zhuǎn)換。通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何適合的方法進(jìn)行雙螺旋核酸水平的檢測(cè)。例如，在存在雙螺旋核酸的情況下使用具有特征可檢測(cè)的信號(hào)的報(bào)道部分可檢測(cè)雙螺旋核酸水平。在存在雙螺旋核酸的情況下具有特征可檢測(cè)的信號(hào)的報(bào)道部分是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且可產(chǎn)生任何可檢測(cè)的信號(hào)。典型地，信號(hào)是光學(xué)信號(hào)，比如熒光、比色、發(fā)光或混濁(turbidic)。在一些實(shí)施方式中，信號(hào)可以是電學(xué)的，比如電壓、電阻或電流的改變。
[0077]在典型的實(shí)施方式中，報(bào)道部分是嵌入染料。嵌入染料顯示不同的熒光發(fā)射，取決于它們與雙鏈或單鏈DNA的關(guān)聯(lián)。具體地，它們與雙鏈DNA特定地結(jié)合，并且當(dāng)它們結(jié)合時(shí)，它們發(fā)明亮的熒光。在缺失雙鏈DNA的情況中，它們不結(jié)合任何東西，它們僅以低水平發(fā)熒光。適合的商業(yè)可得的熒光染料的例子包括SYBR Green、LC Green、LC Green Plus、ResoLight、EvaGreen、Chromofy、SYT09、溴化乙淀、Y0-PR0_l、Hoechst33258和Pico Green。將認(rèn)識(shí)到可使用在存在雙螺旋核酸的情況下展現(xiàn)特征可檢測(cè)的信號(hào)的任何適合的嵌入染料。
[0078]在典型的實(shí)施方式中，特征可檢測(cè)的信號(hào)是可逆的。如此，隨著溫度曲線重復(fù)地經(jīng)過(guò)多脈沖中的雙螺旋核酸的解鏈溫度，特征可檢測(cè)的信號(hào)可被有效地“開(kāi)”和“關(guān)”。因此，嵌入染料非常適于作為報(bào)道部分，因?yàn)樗鼈儍?yōu)先結(jié)合雙螺旋核酸，并且當(dāng)溫度升高造成雙螺旋解鏈時(shí)，信號(hào)則減少，直到溫度再次達(dá)到可進(jìn)行退火的水平。將認(rèn)識(shí)到在本文呈現(xiàn)的方法中可利用產(chǎn)生可逆信號(hào)的任何適合的報(bào)道部分。
[0079]在一些實(shí)施方式中，檢測(cè)不涉及報(bào)道部分，但是可涉及監(jiān)測(cè)雙鏈或單鏈核酸的固有特性。固有特性可以是允許監(jiān)測(cè)單鏈和雙鏈核酸之間的轉(zhuǎn)換的雙鏈或單鏈核酸的任何適合的特性。在一些實(shí)施方式中，固有特性是UV吸光度。例如，單鏈DNA比雙鏈DNA更強(qiáng)吸收260nm的紫外光。因此，在260nm或任何其它適合的波長(zhǎng)下吸光度的改變可用作與單鏈核酸相比雙鏈核酸水平的工具。
[0080]動(dòng)力學(xué)信肩、
[0081 ] 雙螺旋核酸的解鏈?zhǔn)前崃W(xué)和動(dòng)力學(xué)方面的混合的現(xiàn)象。在常規(guī)的解鏈曲線分析中，動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)——通常在解鏈曲線中視為不對(duì)稱——可被噪聲混淆。有利地，本方法可提供轉(zhuǎn)換的動(dòng)力學(xué)的深刻理解，因?yàn)楹怂岱肿釉跔顟B(tài)之間重復(fù)地翻轉(zhuǎn)。如果有在一個(gè)方向相比另一方向發(fā)生更快的轉(zhuǎn)換的傾向，它可以認(rèn)定為重復(fù)地經(jīng)過(guò)過(guò)渡溫度的曲線。
[0082]因此，本文呈現(xiàn)的是一種確定關(guān)于核酸的雙鏈至單鏈轉(zhuǎn)換的動(dòng)力學(xué)信息的方法，該方法包括:提供包括雙鏈核酸分子的樣品和在存在雙螺旋核酸的情況下具有特征可檢測(cè)的信號(hào)的報(bào)道部分；使該樣品經(jīng)歷一系列溫度脈沖，其中脈沖引起雙鏈核酸分子轉(zhuǎn)換成單鏈分子并且轉(zhuǎn)換回成雙鏈分子；以及使用報(bào)道部分產(chǎn)生的信號(hào)檢測(cè)在單鏈和雙鏈狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換比，從而在狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換比提供了關(guān)于轉(zhuǎn)換的動(dòng)力學(xué)信息。
[0083]已一般地描述了本發(fā)明，通過(guò)參考某些具體實(shí)施例可獲得進(jìn)一步理解，本文提供某些具體實(shí)施例僅為了說(shuō)明目的，并不旨在限制。
實(shí)施例
_4] 實(shí)施例1 -使用方波熱曲線檢測(cè)患者群體中多態(tài)性的雜合性
[0085]以下預(yù)期性實(shí)施例闡釋了本文上述方波熱曲線的一個(gè)應(yīng)用。為了檢測(cè)患者群體中多態(tài)性的存在，從人群中的一組患者收集基因組DNA樣品。使用在潛在多態(tài)性側(cè)翼的引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增感興趣的區(qū)域。具體地，設(shè)計(jì)將擴(kuò)增包含多態(tài)性區(qū)域的引物。作為引物設(shè)計(jì)的結(jié)果，取決于擴(kuò)增哪個(gè)具體的等位基因，產(chǎn)生了在多態(tài)性的區(qū)域中具有不同序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，取決于擴(kuò)增哪個(gè)等位基因，產(chǎn)物也將具有相差至少1.5°C的解鏈溫度。
[0086]使每個(gè)PCR產(chǎn)物經(jīng)歷解鏈曲線分析。將SYBR Green添加至樣品，然后將其置于熱循環(huán)/檢測(cè)裝置中。解鏈曲線溫度曲線在45°C開(kāi)始并遵循方波圖形，對(duì)于每個(gè)脈沖的低溫和高溫具有5°C過(guò)渡和2°C階梯。該曲線遵循該脈沖圖形直到達(dá)到76°C的最終溫度。
[0087]數(shù)據(jù)分析識(shí)別熒光值的脈沖最大過(guò)渡。在一些樣品中，在相差1.5至2.(TC的溫度下識(shí)別兩個(gè)Tm點(diǎn)。在其它樣品中，在兩個(gè)溫度任何一個(gè)識(shí)別僅單個(gè)Tm點(diǎn)?；谶@些發(fā)現(xiàn)，將患者樣品分類為多態(tài)性的雜合，或陽(yáng)性或陰性的純合。
[0088]以上描述公開(kāi)了本發(fā)明的數(shù)個(gè)方法和系統(tǒng)。本發(fā)明的方法和材料容易被修改，并且裝配方法和裝置容易被改變?？紤]本公開(kāi)或本文公開(kāi)的發(fā)明的實(shí)踐，這種修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。因此，本發(fā)明不意欲限于本文公開(kāi)的【具體實(shí)施方式】，而是覆蓋落在本發(fā)明的真實(shí)范圍和精神內(nèi)的所有修改和替代方案。
[0089]本文弓I用的所有參考——包括但不限于公布的和未公布的申請(qǐng)、專利和文獻(xiàn)參考——通過(guò)引用將其全部并入本文，并且由此組成本說(shuō)明書(shū)的一部分。如果通過(guò)引用并入的公開(kāi)和專利或?qū)＠暾?qǐng)與包含在該說(shuō)明書(shū)中的公開(kāi)相矛盾，則本說(shuō)明書(shū)旨在代替和/或優(yōu)先于任何這種矛盾的材料。
[0090]如本文所使用的術(shù)語(yǔ)“包括(comprising) ”與“包括(including) ”、“包含(containing) ”或“特征在于”是同義的，并且是囊括性的或開(kāi)放式的并且不排除另外的未敘述的元素或方法步驟。
【權(quán)利要求】
1.一種確定雙螺旋核酸分子的解鏈溫度的方法，所述方法包括 使包括雙鏈核酸分子的溶液經(jīng)歷方波溫度梯度，所述梯度包括引起所述雙鏈核酸分子至單鏈核酸分子的至少一種轉(zhuǎn)換的溫度范圍；和 在所述方波溫度梯度的過(guò)程中檢測(cè)所述至少一種轉(zhuǎn)換。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方波溫度梯度包括一系列溫度脈沖，每個(gè)脈沖包括: a)使所述溶液的溫度升高至第一高溫； b)使所述溶液的溫度下降至第二低溫； 其中所述第一高溫高于所述第二低溫；并且 其中，在隨后的脈沖中，將每個(gè)所述第一高溫和所述第二低溫調(diào)節(jié)至分別高于先前脈沖中的所述第一和第二溫度。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中至少一個(gè)所述溫度脈沖包括在所述雙鏈核酸分子和所述單鏈核酸分子之間發(fā)生可檢測(cè)的轉(zhuǎn)換的溫度范圍。
4.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述檢測(cè)發(fā)生在每個(gè)所述溫度脈沖中的所述第一高溫和所述第二低溫處 。
5.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括: 識(shí)別具有從雙鏈核酸至單鏈核酸分子的最大可檢測(cè)的轉(zhuǎn)換的溫度脈沖。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述識(shí)別包括計(jì)算可檢測(cè)的信號(hào)的差異，所述可檢測(cè)的信號(hào)在單個(gè)溫度脈沖內(nèi)的所述第一高溫和所述第二低溫處測(cè)量。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述溶液包括多個(gè)雙鏈核酸種類，每個(gè)所述種類包括不同的序列。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中每個(gè)所述多個(gè)雙鏈核酸種類包括不同的解鏈溫度。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測(cè)包括在存在雙螺旋核酸的情況下檢測(cè)具有特征可檢測(cè)信號(hào)的報(bào)道部分。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述特征可檢測(cè)信號(hào)是可逆的。
11.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述報(bào)道部分包括熒光染料。
12.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述報(bào)道部分選自:溴化乙錠、YO-PRO-1、Hoechst33258、Pico Green 和 SYBR Green。
13.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測(cè)包括監(jiān)測(cè)紫外線(UV)吸收。
14.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方波溫度梯度使用可編程的熱循環(huán)儀產(chǎn)生。
15.一種用于確定雙螺旋核酸分子的解鏈溫度的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括 可編程的熱循環(huán)裝置； 檢測(cè)器；和 用于方波熱循環(huán)的程序，所述程序包括用于以下的指令: 使包括雙鏈核酸分子的溶液經(jīng)歷方波溫度梯度，所述梯度包括引起所述雙鏈核酸分子至單鏈核酸分子的至少一種轉(zhuǎn)換的溫度范圍；和 在所述方波溫度梯度的過(guò)程中檢測(cè)所述至少一種轉(zhuǎn)換。
16.權(quán)利要求15所述的系統(tǒng)，其中所述方波溫度梯度包括一系列溫度脈沖，每個(gè)脈沖包括:a)使所述溶液的溫度升高至第一高溫； b)使所述溶液的溫度下降至第二低溫； 其中所述第一高溫高于所述第二低溫；和 其中，在隨后的脈沖中，將每個(gè)所述第一高溫和所述第二低溫調(diào)節(jié)至分別高于先前脈沖中的所述第一和第二溫度。
17.權(quán)利要求16所述的系統(tǒng)，其中至少一個(gè)所述溫度脈沖包括在所述雙鏈核酸分子和所述單鏈核酸分子之間發(fā)生可檢測(cè)的轉(zhuǎn)換的溫度范圍。
18.權(quán)利要求16所述的系統(tǒng)，其中所述檢測(cè)發(fā)生在每個(gè)所述溫度脈沖中的所述第一高溫和所述第二低溫處。
19.權(quán)利要求16所述的系統(tǒng)，其中所述程序進(jìn)一步包括用于以下的指令: 識(shí)別具有從雙鏈核酸至單鏈核酸分子的最大可檢測(cè)的轉(zhuǎn)換的溫度脈沖。
20.權(quán)利要求19所述的系統(tǒng)，其中所述識(shí)別包括計(jì)算可檢測(cè)的信號(hào)的差異，所述可檢測(cè)的信號(hào)在單個(gè)溫度脈沖內(nèi)的所述第一高溫和所述第二低溫處測(cè)量。
21.權(quán)利要求15所述的系統(tǒng)，其中所述檢測(cè)包括監(jiān)測(cè)紫外線(UV)吸收。
22.權(quán)利要求15所述的系統(tǒng)，其中所述方波溫度梯度使用可編程的熱循環(huán)儀產(chǎn)生。
23.一種確定雙鏈核酸分子的解鏈溫度的方法，所述方法包括: 提供包括雙鏈核酸分子和在存在雙螺旋核酸的情況下具有特征可檢測(cè)信號(hào)的報(bào)道部分的樣品； 使所述樣品經(jīng)歷一系列溫度脈沖，其中至少多個(gè)所述脈沖引起所述雙鏈核酸分子轉(zhuǎn)換成單鏈分子并且轉(zhuǎn)換回成雙鏈分子；和 使用所述報(bào)道部分產(chǎn)生的信號(hào)檢測(cè)所述雙鏈核酸分子的解鏈溫度。
24.權(quán)利要求23所述的方法，其中每個(gè)所述溫度脈沖包括: a)使所述溶液的溫度升高至第一高溫； b)使所述溶液的溫度下降至第二低溫； 其中所述第一高溫高于所述第二低溫；和 其中，在隨后的脈沖中，將每個(gè)所述第一高溫和所述第二低溫調(diào)節(jié)至分別高于先前脈沖中的所述第一和第二溫度。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中至少一個(gè)所述溫度脈沖包括在所述雙鏈核酸分子和所述單鏈核酸分子之間發(fā)生可檢測(cè)的轉(zhuǎn)換的溫度范圍。
26.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述檢測(cè)發(fā)生在每個(gè)所述溫度脈沖中的所述第一高溫和所述第二低溫處。
27.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括: 識(shí)別具有從雙鏈核酸至單鏈核酸分子的最大可檢測(cè)的轉(zhuǎn)換的溫度脈沖。
28.權(quán)利要求27所述的方法，其中所述識(shí)別包括計(jì)算可檢測(cè)的信號(hào)的差異，所述可檢測(cè)的信號(hào)在單個(gè)溫度脈沖內(nèi)的所述第一高溫和所述第二低溫處測(cè)量。
29.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述溶液包括多個(gè)雙鏈核酸種類，每個(gè)所述種類包括不同的序列。
30.權(quán)利要求29所述的方法，其中每個(gè)所述多個(gè)雙鏈核酸種類包括不同的解鏈溫度。
31.權(quán)利要求23所述的方法，其中與單鏈核酸相比在存在雙鏈核酸的情況下所述報(bào)道部分產(chǎn)生差別信號(hào)。
32.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述差別信號(hào)是可逆的。
33.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述報(bào)道部分包括熒光染料。
34.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述報(bào)道部分選自:溴化乙錠、YO-PRO-1、Hoechst33258、Pico Green 和 SYBR Green。
35.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述檢測(cè)包括監(jiān)測(cè)紫外線(UV)吸收。
36.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述溫度脈沖使用可編程的熱循環(huán)儀產(chǎn)生。
37.一種確定關(guān)于核酸的雙鏈至單鏈轉(zhuǎn)換的動(dòng)力學(xué)信息的方法，所述方法包括: 提供包括雙鏈核酸分子和在存在雙螺旋核酸的情況下具有特征可檢測(cè)信號(hào)的報(bào)道部分的樣品； 使所述樣品經(jīng)歷一系列溫度脈沖，其中所述脈沖引起所述雙鏈核酸分子轉(zhuǎn)換成單鏈分子并且轉(zhuǎn)換回成雙鏈分子；和 使用所述報(bào)道部分產(chǎn)生的信號(hào)檢測(cè)在單鏈和雙鏈狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換比，從而在所述狀態(tài)之間的所述轉(zhuǎn)換比提供關(guān)于所述轉(zhuǎn)換的動(dòng)力學(xué)信息。
38.一種確定雙 螺旋核酸分子的解鏈溫度的方法，所述方法包括 使包括多個(gè)單鏈核酸分子的溶液經(jīng)歷方波溫度梯度，所述梯度包括引起所述單鏈核酸分子至雙鏈核酸分子的至少一種轉(zhuǎn)換的溫度范圍；和 在所述方波溫度梯度的過(guò)程中檢測(cè)所述至少一種轉(zhuǎn)換。
39.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述方波溫度梯度包括一系列溫度脈沖，每個(gè)脈沖包括: a)使所述溶液的溫度升高至第一高溫； b)使所述溶液的溫度下降至第二低溫； 其中所述第一高溫高于所述第二低溫；和 其中，在隨后的脈沖中，將每個(gè)所述第一高溫和所述第二低溫調(diào)節(jié)至分別低于先前脈沖中的所述第一和第二溫度。
40.權(quán)利要求39所述的方法，其中至少一個(gè)所述溫度脈沖包括在所述雙鏈核酸分子和所述單鏈核酸分子之間發(fā)生可檢測(cè)的轉(zhuǎn)換的溫度范圍。
41.一種確定雙螺旋核酸分子的解鏈溫度的方法，所述方法包括 使包括單鏈核酸分子的溶液經(jīng)歷方波溫度梯度，所述梯度包括引起所述單鏈核酸分子至雙鏈核酸分子的至少一種轉(zhuǎn)換的溫度范圍；和 在所述方波溫度梯度的過(guò)程中檢測(cè)所述至少一種轉(zhuǎn)換。
42.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述方波溫度梯度包括一系列溫度脈沖，每個(gè)脈沖包括: a)使所述溶液的溫度升高至第一高溫； b)使所述溶液的溫度下降至第二低溫； 其中所述第一高溫高于所述第二低溫；和 其中，在隨后的脈沖中，將每個(gè)所述第一高溫和所述第二低溫調(diào)節(jié)至分別低于先前脈沖中的所述第一和第二溫度。
43.權(quán)利要求42所述的方法，其中至少一個(gè)所述溫度脈沖包括在所述單鏈核酸分子和所述雙鏈核酸分子之間發(fā)生可檢測(cè)的轉(zhuǎn)換的溫度范圍。
44.權(quán)利要求42所述的方法，其中所述檢測(cè)發(fā)生在每個(gè)所述溫度脈沖中的所述第一高溫和所述第二低溫處。
45.權(quán)利要求42所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括: 識(shí)別具有從單鏈核酸至雙鏈核酸分子的最大可檢測(cè)的轉(zhuǎn)換的溫度脈沖。
46.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述識(shí)別包括計(jì)算可檢測(cè)的信號(hào)的差異，所述可檢測(cè)的信號(hào)在單個(gè)溫度脈沖內(nèi)所述第一高溫和所述第二低溫處測(cè)量。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103998921SQ201280061086
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2012年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月14日
【發(fā)明者】A·斯蒂爾 申請(qǐng)人:貝克頓·迪金森公司