Psa測定方法及其試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種通過一步反應簡便和高精度的PSA測定方法，其中不使用具有不同平均粒度的載體。還提供了用于其的試劑。所述PSA測定方法包括：用兩種類型的識別不同表位的抗PSA單克隆抗體固定化不溶性載體，所述載體具有大于0.20μm但等于或小于0.40μm的相同的平均粒度，所述兩種類型的抗PSA單克隆抗體是與游離PSA和PSA-ACT二者均反應的抗PSA單克隆抗體，所述PSA-ACT是PSA與α1-抗胰凝乳蛋白酶的復合物；和使該載體在存在凝集促進劑的條件下與樣品接觸。
【專利說明】PSA測定方法及其試劑【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及抗原測定方法以及試劑，其使得能夠通過免疫凝集測量游離抗原和樣品中游離抗原與共存物質的復合物，以獲得等摩爾反應。特別地，本發(fā)明涉及前列腺特異性抗原的測定方法，及其試劑。
【背景技術】
[0002]前列腺癌是見于男性的一種惡性疾病。在美國和歐洲，大量患者受到前列腺癌的折磨。近年來，在日本，患前列腺癌的患者的數量迅速增加。由于前列腺癌發(fā)展緩慢，可以有效地通過放射療法或抗雄性激素療法治療，因此重要的是在早期階段發(fā)現前列腺癌。
[0003]前列腺特異性抗原(以下可稱作“PSA” )是由前列腺上皮細胞分泌的糖蛋白(絲氨酸蛋白酶)，分子量為33，000-34, OOODa0由于患前列腺疾病的人與健康人相比表現出血液中PSA水平的增加，所以PSA對于前列腺疾病(特別是前列腺癌)的早期檢測是有用的。PSA分為與血液中蛋白酶抑制劑相結合的復合物類型的PSA和游離PSA(以下可稱為“fPSA”)。血液中的大部分PSA是復合物類型的PSA，以PSA與α 1-抗胰凝乳蛋白酶的復合物(以下可稱為“PSA-ACT”)、PSA與α 2-巨球蛋白的復合物等的形式存在。fPSA和PSA-ACT可以通過免疫測定法進行測量。
[0004]利用乳膠等的基于凝集反應的測定(免疫凝集測定)被用作免疫測定。然而，由于抗PSA單克隆抗體與fPSA和PSA-ACT具有不同的反應性，所以可能難以準確測量PSA總水平。
[0005]為了解決上述問題，PTLl提出了一種免疫凝集測定試劑及使用其進行的測定，其中免疫凝集測定試劑包括:(I)包括其上固定化了第一單克隆抗體的第一不溶載體顆粒的第一顆粒懸浮液，所述第一單克隆抗體能夠結合游離測量目標物質和游離測量目標物質與相應結合分子的復合物，(2)包括其上固`定化了第二單克隆抗體的第二不溶載體顆粒的第二顆粒懸浮液，所述第二單克隆抗體能夠結合游離測量目標物質和游離測量目標物質與相應結合分子的復合物，但不與第一單克隆抗體競爭，以及(3)包括其上固定化了第三單克隆抗體的第三不溶載體顆粒的第三顆粒懸浮液，所述第三單克隆抗體不識別游離測量目標物質，但識別游離測量目標物質與相應結合分子的復合物。
[0006]PTL2提出了一種測定試劑及使用其進行的測定，其中所述測定試劑如下調節(jié)與游離抗原和復合物類型的抗原的反應性:使用在兩種或更多種類型的粒度不同的載體中具有較小粒度并且其上固定化了至少一種單克隆抗體的載體，所述至少一種單克隆抗體是三種與游離抗原和復合物類型的抗原具有反應性但識別位點不同的單克隆抗體中的單克隆抗體；并且使用其上固定化了其余的單克隆抗體的所述兩種或更多種載體中具有較大粒度的載體。
[0007]PTL3提出了一種兩步反應的免疫測定法，包括⑴使包括游離測量目標物質和復合物類型的測量目標物質的樣品與其上固定有針對測量目標物質的單克隆抗體I的乳膠I接觸，獲得反應產物1，以及(2)使反應產物I與其上固定有與單克隆抗體I識別位點不同的單克隆抗體2的乳膠2接觸，獲得反應產物2。
[0008]PTL4提出了一種前列腺特異性抗原免疫測定試劑及使用其進行的測定，其中免疫測定試劑包括其上固定有與游離PSA和PSA復合物有反應性的單克隆抗體I的乳膠1，以及其上固定有與游離PSA和PSA復合物有反應性的單克隆抗體2的乳膠2，單克隆抗體2與單克隆抗體I的識別位點不同，并且乳膠2與乳膠I的平均粒度不同。
[0009]引證文件列表
[0010]專利文獻
[0011]PTL1:JP-A-2001-108681
[0012]PTL2:W02006/068206
[0013]PTL3:JP-A-2007-163319
[0014]PTL4:日本專利 N0.4241301
[0015]發(fā)明概述
[0016]技術問題
[0017]然而，當使用PTLl公開的方法時，當PSA-ACT的混合比增加的時候，觀察到相對測定值下降(參見將具有0.78 μ m的平均粒度且其上固定化了抗PSA的單克隆抗體的聚苯乙烯乳膠、fPSA和PSA-ACT以不同比例混合時的測定結果)。特別地，當僅使用PSA-ACT時，游離PSA的相對測定值為81.43%且沒有獲得等摩爾反應。PTL2公開的方法的問題是需要聯(lián)合使用不同粒度的乳膠，PTL3公開的方法的問題是需要實施兩步反應，其中在第一單克隆抗體反應后使第二單克隆抗體反應。PTL4公開的方法也有需要聯(lián)合使用不同粒度的乳膠的問題。PTL4公開了比較例，其中使用了具有相同平均粒度(0.22 μ m)的乳膠。但是，沒有使用凝集促進劑，且沒有獲得等摩爾反應。
[0018]鑒于上述情況，期望開發(fā)能夠更容易并更準確測定PSA總水平(即能通過免疫測定測量的fPSA和PSA-ACT的總和)的方法。
[0019]特別地，本發(fā)明的目的是提供通過一步反應且不使用具有不同平均粒度的載體來容易并準確地測量PSA的測定方法，以及使用的試劑。請注意本文中使用的表述“PSA的測量”或“PSA的測定”指PSA總水平的測量或測定，除非另有說明。
[0020]問題的解決方案
[0021 ] 實現上述目的的本發(fā)明的幾個方面包括下述方面。
[0022](I) 一種PSA測定方法，所述測定方法包括:使用其上固定化了兩種類型的抗PSA單克隆抗體的不溶載體，使該不溶載體在存在凝集促進劑的條件下與樣品接觸，其中所述兩種類型的抗PSA單克隆抗體能夠與游離PSA和游離PSA與α 1-抗胰凝乳蛋白酶的復合物(PSA-ACT) 二者均反應且識別不同的表位，而且所述不溶載體具有大于0.20 μ m且等于或小于0.40 μ m的相同的平均粒度。
[0023](2)根據⑴的PSA測定方法，其中所述凝集促進劑是選自聚乙二醇、多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚氯乙烯、聚-Y-谷氨酸和聚(2-甲基丙烯?；趸一姿崮憠A)的一種或多種凝集促進劑。
[0024](3)根據⑴的PSA測定方法，其中所述不溶載體是選自包含衍生于以下的物質的顆粒的一種或多種類型的不溶載體:合成聚合物的乳膠顆粒、二氧化硅、氧化鋁、炭黑、金屬化合物、金屬、陶瓷、和/或磁性體。[0025](4)根據(1)的PSA測定方法，其中調節(jié)所述凝集促進劑的濃度以獲得對于游離PSA和游離PSA與α 1-抗胰凝乳蛋白酶的復合物(PSA-ACT)的等摩爾反應。
[0026](5)根據⑵的PSA測定方法，其中所述多糖是選自右旋糖酐、普魯蘭、
[0027]和包括甲基纖維素和乙基纖維素的烷基化多糖的一種或多種多糖。
[0028](6)根據(3)的PSA測定方法，其中所述合成聚合物是選自聚苯乙烯、苯乙烯-磺酸共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、和乙酸乙烯酯-丙烯酸酯共聚物的一種或多種合成聚合物。
[0029](7)根據⑴至(6)任一項的PSA測定方法，其中所述兩種類型的抗PSA單克隆抗體對游離PSA的解離常數(fKd)與對游離PSA和α 1-抗胰凝乳蛋白酶的復合物(PSA-ACT)的解離常數(cKd)的比值(fKd/cKd)為大于0.1且等于或小于2.0，并且對游離PSA的解離常數(fKd)為IOnM或更小。
[0030](8)包含至少1)和2)的PSA測定試劑:
[0031]I)通過使用其上固定化了兩種類型的抗PSA單克隆抗體的不溶載體制備的抗體固定化(antibody-1mmobilized)載體,其中所述兩種類型的抗PSA單克隆抗體能夠與游離PSA和游離PSA與α 1-抗胰凝乳蛋白酶的復合物(PSA-ACT) 二者均反應且識別不同的表位，而且所述不溶載體具有大于0.20 μ m且等于或小于0.40 μ m的相同的平均粒度；
[0032]2)選自聚乙二醇、多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚氯乙烯、聚-y-谷氨酸、和聚(2-甲基丙烯?；趸一姿崮憠A)的一種或多種凝集促進劑。
[0033](9)根據⑴的PSA測定方法，其中所述兩種類型的抗PSA單克隆抗體對游離PSA的解離常數(fKd)與對游離PSA和α 1-抗胰凝乳蛋白酶的復合物(PSA-ACT)的解離常數(cKd)的比值(fKd/cKd)為大于0.1且等于或小于2.0,并且對游離PSA的解離常數(fKd)為IOnM或更小，所述凝集促進劑是選自聚乙二醇、多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚氯乙烯、聚-Y-谷氨酸、和聚(2-甲基丙烯?；趸一姿崮憠A)的一種或多種凝集促進劑，并且調節(jié)所述凝集促進劑的量以獲得對游離PSA和游離PSA與α 1-抗胰凝乳蛋白酶的復合物(PSA-ACT)的等摩爾反應。
[0034]發(fā)明的有益效果
[0035]根據本發(fā)明的所述方面的測定方法可以通過一步反應且不使用具有不同平均粒度的載體而容易并準確地測量PSA。因此，能夠使用通用的自動分析儀進行高精度的測定，而無需特殊設備。
具體實施方案
[0036](測量目標物質)
[0037]本發(fā)明的實施方案的目標為前列腺特異性抗原(PSA)(即測量目標物質)?？梢酝ㄟ^免疫測定測量的血漿中的PSA包括游離PSA (fPSA)和游離PSA(fPSA)與α 1-抗胰凝乳蛋白酶的復合物(PSA-ACT)。
[0038]目標樣品沒有特別限制，只要該樣品包括PSA，但優(yōu)選為血液、血清、血漿等。
[0039](抗PSA單克隆抗體)
[0040]使用能與fPSA和PSA-ACT 二者均反應且識別不同表位的至少兩種類型的抗PSA單克隆抗體作為針對PSA的單克隆抗體。所述兩種類型的抗PSA單克隆抗體之間表位的不同可以通過證實是否能使用PSA(抗原)和這些抗體進行常規(guī)的夾心免疫測定來確定。
[0041](抗體的選擇)
[0042]抗體的選擇如下所述。
[0043]理想的是選擇在ELISA等中與PSA-ACT和fPSA有高反應性(即高效價)的抗體。理想地是選擇能確保足夠測量靈敏度的載體。在載體上固定化從所挑選的具有高效價的抗體中任意選擇的兩種抗體，選擇抗體的組合使得與PSA-ACT和fPSA的反應性顯示小的差異并獲得足夠的測量靈敏度。
[0044]優(yōu)選抗PSA單克隆抗體對游離PSA的解離常數(fKd)與對游離PSA和α 1-抗胰凝乳蛋白酶的復合物(PSA-ACT)的解離常數(cKd)的比值(fKd/cKd)為大于0.1，更優(yōu)選大于0.2。比值(fKd/cKd)的上限優(yōu)選為2.0或更小，更優(yōu)選為1.5或更小。對游離PSA的解離常數(fKd)優(yōu)選為IOnM或更小，更優(yōu)選為6nM或更小。
[0045]單克隆抗體可以包括，例如，由木瓜蛋白酶等部分水解獲得的Fab片段，由胃蛋白酶等部分水解獲得的F(ab’)2片段，和/或F(ab’)2片段經還原獲得的Fab’片段。
[0046](不溶載體)
[0047]其上固定化了抗體的不溶載體沒有特別限制，但優(yōu)選選自包含衍生于以下的物質的顆粒:合成聚合物的乳膠顆粒、二氧化硅、氧化鋁、炭黑、金屬化合物、金屬、陶瓷、和/或磁性體。合成聚合物優(yōu)選是選自聚苯乙烯、苯乙烯-磺酸共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、和乙酸乙烯酯-丙烯酸酯共聚物的一種或多種合成聚合物。
[0048]特別優(yōu)選使用通過無皂乳液聚合獲得的聚苯乙烯乳膠顆粒。聚苯乙烯乳膠可以例如用W02003/005031中公開的方法生產。特別地，在包含水作為溶劑的反應容器中裝入特定量的苯乙烯單體、引發(fā)劑(如過硫酸鉀)、和聚合穩(wěn)定劑(如苯乙烯磺酸鈉)。在任選地加入乳化劑(如，十二烷基硫酸鈉)后，將混合物在氮氣氣氛中加熱并攪拌，進行聚合。
[0049](不溶載體的粒度)
[0050]不溶載體的平均粒度為大于0.20 μ m且等于或小于0.40 μ m，優(yōu)選大于0.22μπι且等于或小于0.40 μ m,更優(yōu)選為等于或大于0.23 μ m且等于或小于0.40 μ m,更優(yōu)選為等于或大于0.23且等于或小于0.34 μ m。如果不溶載體的平均粒度為0.20 μ m或更小，或者超過0.40 μ m，則可能難以獲得等摩爾反應。應注意，本文中與不溶載體一起使用的術語“平均粒度(μ m)”指使用透射式電子顯微鏡(參見實施例)進行圖像分析并四舍五入至小數點后兩位數字獲得的值。應注意，通過圖像分析可以將平均粒度計算到小數點后四位數字。
[0051]在平均粒度大于0.20 μ m且等于或小于0.40 μ m的情況下，當顆粒A的平均粒度(土SD)為M±N，顆粒B的平均粒度(土SD)為P±Q，M>P，且N和Q為0.02μπι或更小時，如果這兩種類型的顆粒(例如在不同批次中制備的)滿足“Μ-Ν≤P+Q”的關系，則認為這兩種類型的顆粒具有相同的平均粒度。
[0052]例如，當顆粒A的平均粒度為0.22±0.02 μ m,且顆粒B的平均粒度為0.21 ±0.02 μ m時，M-N為0.20，P+Q為0.23 (即滿足上述關系)。因此，認為顆粒A和顆粒B具有相同的平均粒度。
[0053]當顆粒A的平均粒度為0.40±0.02μπι，且顆粒B的平均粒度為0.37±0.02μπι時，M-N為0.38，P+Q為0.39 (即滿足上述關系)。因此，認為顆粒A和顆粒B具有相同的平均粒度。
[0054]如上所述被認為具有相同的平均粒度并以任意比例混合的顆粒的混合物在本發(fā)明的范圍內。
[0055]根據本發(fā)明的實施方案，兩種或更多種載體具有相同的平均尺寸，但不排除由不同材料制成的載體的組合。也不排除具有不同平均粒度的載體的組合，只要其中的載體具有在上述范圍內的平均粒度并用于主要反應中以獲得等摩爾反應。
[0056](抗體的固定化)
[0057]不溶載體可以通過常用的物理吸附法，和化學結合法，免疫結合法等在其上固定化抗體。其上分別固定化了識別不同表位的兩種類型的單克隆抗體的載體通常以適當的比例混合(參見實施例)，但是可以將所述兩種類型的單克隆抗體事先以適當的比例混合以固定化在載體上。
[0058](凝集促進劑)
[0059]凝集促進劑沒有特別限制，只要所述凝集促進劑促進其上固定化了抗體的不溶載體經由抗原抗體反應發(fā)生的凝集。凝集促進劑的實例包括聚乙二醇、多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚氯乙烯、聚-Y -谷氨酸、聚(2-甲基丙烯?；趸一姿崮憠A)(以下可稱為“MPC聚合物”)等。多糖優(yōu)選是選自右旋糖酐、普魯蘭、和烷基化多糖(包括甲基纖維素和乙基纖維素)的一種或多種多糖。聚-Y-谷氨酸可以是堿金屬鹽(如鈉鹽、鉀鹽、或鋰鹽)，堿土金屬鹽(如鎂鹽、鈣鹽、或鋇鹽)，或銨鹽。
[0060]其中，優(yōu)選聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮，更優(yōu)選聚乙二醇。應注意可以組合使用多個凝集促進劑。
[0061]市場上可以買到不同分子量的產品作為凝集促進劑，可以在考慮水溶性等的情況下進行適當的選擇。例如，聚乙二醇的數均分子量優(yōu)選為3，000-1，000，000，更優(yōu)選為5，000-100, 000，特別優(yōu)選為5，000-50, 000。當聚乙二醇的數均分子量為3，000-1, 000, 000時，可以獲得極好的測量靈敏度。聚乙烯吡咯烷酮可以具有例如25，000-1, 200, 000的重均分子量，優(yōu)選40，000-360, 000。聚-Y -谷氨酸可以具有例如200，000-6, 000, 000的重均分子量。MPC聚合物可以具有例如5，000-5, 000, 000的分子量，優(yōu)選500，000-2, 000, 000。
[0062]在考慮載體的平均粒度和凝集促進劑的類型的情況下，優(yōu)選適當地設定凝集促進劑的濃度以獲得等摩爾反應。例如，當凝集促進劑與樣品相接觸時，優(yōu)選調節(jié)凝集促進劑的濃度以使凝集促進劑的終濃度為0.l_5wt%，更優(yōu)選為0.2-2wt%，特別優(yōu)選為0.2-0.6wt%。當凝集促進劑的終濃度為0.l-5wt%時，可以獲得極好的測量靈敏度。
[0063](添加劑)
[0064]可以向試劑中加入多糖(如葡萄糖和蔗糖)、無機鹽(如氯化鈉)、表面活性劑(如聚氧乙烯山梨糖醇酐單硬脂酸酯)、防腐劑(如疊氮化鈉)、和/或非特異性反應抑制劑(如來自于正常動物的IgG抗體)，只要其不妨礙抗PSA單克隆抗體和PSA之間的反應。
[0065]試劑中多糖的含量優(yōu)選為大約0.1至大約10wt%，試劑中無機鹽的含量優(yōu)選為大約0.01至大約5wt%，試劑中表面活性劑的含量優(yōu)選為大約0.02至大約5wt%，試劑中防腐劑的含量優(yōu)選為大約0.001至大約0.lwt%，試劑中非特異性反應抑制劑的含量優(yōu)選為大約0.001至大約5wt%。(緩沖液)
[0066]根據本發(fā)明實施方案的抗原-抗體反應在緩沖液中進行。緩沖液的類型、濃度和pH沒有特別限制，只要能發(fā)生抗原-抗體反應。緩沖液的實例包括磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液、碳酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液、Good’ s緩沖液等。緩沖液的濃度為大約3至大約500mM，優(yōu)選為5-100mM，更優(yōu)選為5_50mM。優(yōu)選緩沖液具有中性至堿性的pH(通常為
6.5-9.5)。
[0067](凝集信號測定方法)
[0068]可以使用用于測定凝集反應的任何方法測定凝集信號。例如，可以通過測量吸光度、顆粒計數、顆粒大小、散射光等測定凝集信號。
[0069]例如，如下所述測定PSA。
[0070]特別地，當用能與fPSA和PSA-ACT 二者反應的至少兩種類型的抗體固定化在載體(如乳膠)上并隨后與包括fPSA和/或PSA-ACT的樣品反應時，發(fā)生凝集反應。樣品中的PSA總水平可以通過測定凝集程度，并將所測定的凝集程度與使用具有已知PSA水平的標準溶液時的凝集程度相比較來確定。例如，優(yōu)選使用通用的生物化學自動分析儀，通過吸光度的變化來測定凝集程度。在這種情況下，優(yōu)選使用500-900nm波長的吸光度的變化來測定凝集程度。
[0071](等摩爾反應)
[0072]由于可以使用根據本發(fā)明實施方案的測定獲得對fPSA和PSA-ACT的等摩爾反應，所以可以高精度地定量測定PSA。
[0073]本文使用的表述“對fPSA和PSA-ACT的等摩爾反應”指測定僅包括fPSA的樣品獲得的信號與測定僅包括PSA-ACT (與fPSA等摩爾)的樣品獲得的信號的比值為大約1:1。
[0074]例如，計算每等摩爾的fPSA和PSA-ACT的凝集信號的比值(PSA-ACT/fPSA)(以下可稱為“c/f比值”)，當c/f比值為85-115%(更優(yōu)選90-110%)時則視為獲得等摩爾反應。
[0075](生產試劑的方法)
[0076]如下所述生產根據本發(fā)明實施方案的PSA測定試劑。
[0077]特別地，可以如下生產PSA測定試劑:提供其上已經固定化了能與PSA-ACT和fPSA 二者反應且識別位點不同的兩種類型的抗體的載體，將其上已經固定化了兩種類型的抗體且具有相同平均粒度(大于0.20 μ m且等于或小于0.40 μ m)的載體的混合比設定在特定范圍內，并調節(jié)凝集促進劑的濃度使得獲得對PSA-ACT和fPSA的等摩爾反應。混合比為1:10至10:1，優(yōu)選為1:5至5:1，更優(yōu)選為1:2至2:1。
[0078]下面進一步通過實施例描述本發(fā)明。應當注意本發(fā)明不限于下述實施例。
[0079]實施例
[0080](單克隆抗體的制備)
[0081]1.免疫
[0082](I)免疫原
[0083]使用來源于人精液的純化的PSA(SCIPAC Ltd.,編號P117-7，純度:96%)作為免疫原。純化的PSA用20mM PBS (pH: 7.2)滲析后使用。
[0084](2)免疫方法
[0085]將上述PSA溶液和完全弗氏佐劑(CFA) (GIBCO)以1:1的比例混合并乳化，對6周齡的雌性Balb/C小鼠的背部以25yg PSA/小鼠的量進行皮下施用。以2周的間隔進行另外的三次免疫，在細胞融合前3天將PSA溶液(25 μ g PSA/小鼠)進行腹膜內施用。[0086]2.細胞融合
[0087]從用PSA免疫的每只小鼠中摘除脾臟，收集脾細胞。將脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0-Agl4以6:1的比例混合，在存在50%聚乙二醇1540 (Wako Pure ChemicalIndustries, Ltd.)的條件下融合。將融合細胞懸浮于HAT培養(yǎng)基中，使得脾細胞的數量為
2.5X106,并使其以0.2ml/孔的量分散于96孔培養(yǎng)板(CORNING Inc.)上。在5%C02培養(yǎng)箱中在37°C培養(yǎng)融合細胞2周。
[0088]3.篩選
[0089]將分散有融合細胞的培養(yǎng)板的每個孔中的培養(yǎng)上清液進行ELISA(見下文)以選擇與fPSA和PSA-ACT 二者均反應的孔。
[0090](I)材料:抗原
[0091]1)PSA:SCIPAC,編號 P117-7
[0092]2)PSA-ACT:SCIPAC,編號 P192-3
[0093](2)方法
[0094]I)將 ELISA 板(Nunc)用山羊抗鼠 IgG(Fc)抗體(Jackson Inc.) (5 μ g/ml)包被(50μ I/孔)，于4°C放置過夜。
[0095]2)在將ELISA板用洗滌液(0.05%Tween20-PBS)洗滌三次(400 μ I/孔)后，將封閉試劑(0.05%Tween20-PBS)以200 μ I/孔的量分散于每孔中，將ELISA在室溫放置I小時。
[0096]3)除去封閉試劑后，將分散有融合細胞的培養(yǎng)板的每個孔中的培養(yǎng)上清液以50 μ I/孔的量分散于ELISA板的每個孔中，將ELISA板在室溫放置I小時。
[0097]4)將 ELISA 板用洗滌液(0.05%Tween20_PBS)洗滌 3 次后，將用 0.05%Tween20_PBS稀釋至5ng/ml的fPSA或PSA-ACT以50 μ I/孔的量分散于每個孔中，將ELISA板在室溫放置I小時。
[0098]5)將ELISA板用洗滌液洗滌3次后，將HRP-兔抗人PSA抗體(Χ500)以50μ I/孔的量分散于每個孔中，將ELISA板在室溫放置I小時。應注意使用兔抗人PSA抗體(DAKO)和過氧化物酶(Toyobo C0.，Ltd.)通過過碘酸法制備HRP-兔抗人PSA抗體。
[0099]6)將ELISA板洗滌3次后，將OPD顯色劑以50 μ I/孔的量分散于每個孔中，將ELISA板在室溫放置10分鐘。
[0100]7)將終止液(1.5Ν硫酸)以50 μ I/孔的量分散于每個孔中以終止反應，用平板讀數器(plate leader)測定492nm波長下的吸光度。
[0101]4.克隆
[0102]將上述篩選過程中與fPSA和PSA-ACT 二者均反應的孔中的細胞系通過有限稀釋法進行克隆以建立雜交瘤。由此獲得28種建立的雜交瘤。
[0103]5.單克隆抗體的制備
[0104]將通過克隆獲得的雜交瘤(0.5X106細胞)對2周前已進行0.5ml降植烷腹膜內施用的8周齡的雌性Balb/C小鼠進行腹膜內施用。2周后收集腹膜液，用蛋白A柱(Amersham pic)純化IgG級分。由此獲得28種單克隆抗體的純化級分。
[0105](對單克隆抗體組合的初步考慮)
[0106]將28種類型的單克隆抗體中的每一種固定化在乳膠上，如下所述觀察乳膠的凝集。兩種抗體(#91抗體和#51抗體)表現出大信號，選擇其與乳膠的組合。[0107]1.抗體的選擇
[0108](I)將用20mM Tris-HCl (pH: 8.5)稀釋的1%乳膠(0.3 μ m)溶液與每種單克隆抗體溶液(0.5Abs)按1:1 (v/v)的比例混合，在4°C攪拌混合物2小時。
[0109](2)加入包括 0.4%BSA(2vol)的 20mM Tris-HCl (pH: 8.5)后，在 4°C攪拌混合物 I小時。
[0110](3)離心去除上清液，懸于5mM MOPS (pH: 7.0)中，使得600nm的吸光度為2Abs。
[0111](4)選擇兩種MoAb-Lx(抗體固定化的乳膠)，按1:1 (v/v)的比例混合以獲得試劑
2(用所有的組合制備試劑2)。
[0112](5)利用試劑 I (包括 0.1%BSA、0.5M NaCl、0.3% 聚乙烯吡咯烷酮 K-90 (PVP K-90)的30mM HEPES緩沖液(pH:7.0))和試劑2，使用Hitachi7170自動分析儀測定26ng/ml的fPSA 和 PSA-ACT。
[0113](6)從表現出凝集反應的單克隆的抗體組合中獲得被認為識別不同表位的兩組抗體。
[0114]i) #63217、#63251、和 #63279
[0115]ii) #63214 和 #63291
[0116]使用i)和ii)組的抗體組合觀察到凝集反應。
[0117]產生抗體#63251、#63279、和#63291的雜交瘤保藏于國際專利生物保藏機構(IPOD)，獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所，保藏號為FERMBP-11453、FERM BP-11454、和FERM BP-11455。從這些雜交瘤獲得的單克隆抗體可稱為“#51抗體”、“#79抗體”、和“#91抗體”，分別對應于識別號碼的最后兩位數字。
[0118](不同粒度的乳膠的產生)
[0119]1)0.2μπι或更小
[0120]在配備有攪拌器、回流冷凝器、溫度計、氮入口管、加熱油浴等的玻璃反應容器
(21)中加入1200g水、200g苯乙烯單體、1.2g過硫酸鉀、和0.2g苯乙烯磺酸鈉，在攪拌下(大約200rpm)將反應容器中的氣氛充分置換為氮氣。將單體在70°C聚合約18小時后，通過濾紙(ADVANTEC N0.2)過濾反應溶液，獲得乳膠顆粒。用透射式電子顯微鏡對乳膠顆粒進行照相，任意選擇3個視野，對每個視野內的100個或更多個乳膠顆粒進行圖像分析以確定每個視野的乳膠顆粒的平均粒度(土SD)，并取每個視野的乳膠顆粒平均粒度(土SD)的平均值，從而確定乳膠顆粒的平均粒度(土SD)。由此確定的平均粒度為0.19 μ m(±0.01 μ m)。
[0121]2-1)0.23 μ m
[0122]用與第I)節(jié)相同的方式獲得乳膠顆粒，不同之處在于使用1200g水、200g苯乙烯單體、2.4g過硫酸鉀、和0.1g苯乙烯磺酸鈉。由此獲得的乳膠顆粒的平均粒度為0.23 μ m(±0.01 μ m)。
[0123]2-2)0.25 μ m
[0124]用與第I)節(jié)相同的方式獲得乳膠顆粒，不同之處在于使用1200g水、200g苯乙烯單體、0.9g過硫酸鉀、和0.2g苯乙烯磺酸鈉。由此獲得的乳膠顆粒的平均粒度為0.25 μ m(±0.01 μ m)。
[0125]2-3)0.29 μ m[0126]用與第I)節(jié)相同的方式獲得乳膠顆粒，不同之處在于使用1200g水、200g苯乙烯單體、1.3g過硫酸鉀、和0.1g苯乙烯磺酸鈉。由此獲得的乳膠顆粒的平均粒度為0.29 μ m(±0.01 μ m)。
[0127]2-4)0.34 μ m
[0128]用與第I)節(jié)相同的方式獲得乳膠顆粒，不同之處在于使用1200g水、200g苯乙烯單體、1.3g過硫酸鉀、和0.08g苯乙烯磺酸鈉。由此獲得的乳膠顆粒的平均粒度為0.34 μ m(±0.01 μ m)。
[0129]2-5)0.40 μ m
[0130]用與第I)節(jié)相同的方式獲得乳膠顆粒，不同之處在于使用1200g水、200g苯乙烯單體、1.3g過硫酸鉀、和0.03g苯乙烯磺酸鈉。由此獲得的乳膠顆粒的平均粒度為0.40 μ m(±0.01 μ m)。
[0131]3)大于 0.4μπι
[0132]用與第I)節(jié)相同的方式獲得乳膠顆粒，不同之處在于使用1200g水、200g苯乙烯單體、1.2g過硫酸鉀、和0.0lg苯乙烯磺酸鈉。由此獲得的乳膠顆粒的平均粒度為0.42 μ m(±0.01 μ m)。
[0133](抗體固定化乳膠的制備)
[0134]將如前所述獲得的兩種單克隆抗體(#91和#51)，利用下述材料和方法固定化在載體上。
[0135]1.材料
[0136](I)抗PSA單克隆抗體
[0137]#63291 (#91)
[0138]#63251 (#51)
[0139](將這些單克隆抗體溶解于PBS中。)
[0140](2)乳膠
[0141]如前所述獲得的聚苯乙烯乳膠(平均粒度:0.19-42 μ m)
[0142]2.抗體固定化乳膠液的制備
[0143](I)含#91抗體-乳膠復合物(#91Lx)液體的制備
[0144]I)將乳膠和#91抗體分別用20mM甘氨酸緩沖液(pH: 9)稀釋，制備1%乳膠液和#91抗體液(0.4mg/ml)?；旌先槟z液和#91抗體液(1:1, v/v),并將混合物攪拌約I小時。
[0145]2)向混合物中加入封閉試劑(10%BSA) (0.1: 2，v/v)，并將混合物攪拌約I小時。
[0146]3)離心除去上清液，懸于5mM MOPS緩沖液(pH: 7.0)中并稀釋，以使600nm波長下的吸光度為3Abs/ml，獲得#91抗體固定化的乳膠(#91Lx)液。
[0147](2)含#51抗體-乳膠復合物(#51Lx)液體的制備
[0148]I)將乳膠和#51抗體分別用20mM甘氨酸緩沖液(pH: 8)稀釋，制備1%乳膠液和#51抗體液(0.4mg/ml)。混合乳膠液和#51抗體液(1:1, v/v),并將混合物攪拌約I小時。
[0149]2)向混合物中加入封閉試劑(10%BSA) (0.1: 2，v/v)，并將混合物攪拌約I小時。
[0150]3)離心除去上清液，懸于5mM MOPS緩沖液(pH: 7.0)中并稀釋，以使600nm波長下的吸光度為3Abs/ml，獲得#51抗體固定化的乳膠(#51Lx)液。
[0151][測試例I][0152](由于乳膠平均粒度改變導致的c/f比值改變的測定)
[0153]使用fPSA和PSA-ACT (濃度:5ng/ml)作為測量樣品，使用下述PSA測定試劑和測量條件確定與fPSA和PSA-ACT的反應性。確定與PSA-ACT的反應性和與fPSA的反應性的比值“PSA-ACT/fPSA” (c/f比值)。結果顯示于表I中。
[0154](I) PSA測定試劑
[0155]第一試劑(緩沖液)
[0156]包括0.5M KC1、0.1%BSA(Proliant)、和 0.3%PVP K-90 的 30mMHEPES 緩沖液(pH: 7.0)
[0157]第二試劑(抗體固定化乳膠液)
[0158]包括小鼠抗PSA單克隆抗體固定化(兩種抗體固定化顆粒的混合比，含#91Lx液體:含#5ILx液體=1:1)的乳膠顆粒的5mM MOPS緩沖液(pH: 7.0)。
[0159]本實施例中使用的含抗體液體的每種組合分別用具有相同平均粒度(0.19-0.42 μ m)并且其上固定化了 #91抗體或#51抗體的乳膠顆粒制備。
[0160](2)測量條件
[0161]測量系統(tǒng):Hitachi7170自動分析儀(H-7170)
[0162]測量參數:
[0163]分析方法:2_ 終點法(測量點:19至34)
[0164]液量(μI): 14.4/90/90
[0165]測量波長(nm):570 (主)/800 (副)
[0166]校準:樣條
[0167]用Nanopia(注冊商標)PSA 校準器(PSA 濃度:0、4.2，10、和 29ng/ml, SekisuiMedical C0., Ltd.)進行校準。
[0168](3)測量樣品
[0169]將fPSA 和 PSA-ACT (Fitzgerald)溶解于包括 1%BSA 和 0.l%NaN3 的 PBS (pH: 7.4)中來制備測量樣品。
[0170][表I]
[0171]
【權利要求】
1.一種PSA測定方法，所述測定方法包括:使用其上固定化了兩種類型的抗PSA單克隆抗體的不溶載體，使該不溶載體在存在凝集促進劑的條件下與樣品接觸，其中所述兩種類型的抗PSA單克隆抗體能夠與游離PSA和游離PSA與α 1-抗胰凝乳蛋白酶的復合物(PSA-ACT) 二者反應且識別不同的表位，而且所述不溶載體具有大于0.20 μ m且等于或小于0.40 μ m的相同的平均粒度。
2.根據權利要求1的PSA測定方法，其中所述凝集促進劑是選自聚乙二醇、多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚氯乙烯、聚-Y-谷氨酸和聚(2-甲基丙烯?；趸一姿崮憠A)的一種或多種凝集促進劑。
3.根據權利要求1的PSA測定方法，其中所述不溶載體是選自包含衍生于以下的物質的顆粒的一種或多種類型的不溶載體:合成聚合物的乳膠顆粒、二氧化硅、氧化鋁、炭黑、金屬化合物、金屬、陶瓷、和/或磁性體。
4.根據權利要求1的PSA測定方法，其中調節(jié)所述凝集促進劑的濃度以獲得對于游離PSA和游離PSA與α 1-抗胰凝乳蛋白酶的復合物(PSA-ACT)的等摩爾反應。
5.根據權利要求2的PSA測定方法，其中所述多糖是選自右旋糖酐、普魯蘭、和包括甲基纖維素和乙基纖維素的烷基化多糖的一種或多種多糖。
6.根據權利要求3的PSA測定方法，其中所述合成聚合物是選自聚苯乙烯、苯乙烯-磺酸共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、和乙酸乙烯酯-丙烯酸酯共聚物的一種或多種合成聚合物。
7.根據權利要求1-6任一項的PSA測定方法，其中所述兩種類型的抗PSA單克隆抗體對游離PSA的解離常數(fKd)與對游離PSA和α 1-抗胰凝乳蛋白酶的復合物(PSA-ACT)的解離常數(cKd)的比值(fKd/cKd)為大于0.1且等于或小于2.0，并且對游離PSA的解離常數(fKd)為IOnM或更小。
8.包含至少I)和2)的PSA測定試劑: 1)通過使用其上固定化了兩種類型的抗PSA單克隆抗體的不溶載體制備的抗體固定化載體，其中所述兩種類型的抗PSA單克隆抗體能夠與游離PSA和游離PSA與α 1-抗胰凝乳蛋白酶的復合物(PSA-ACT) 二者反應且識別不同的表位，而且所述不溶載體具有大于0.20 μ m且等于或小于0.40 μ m的相同的平均粒度； 2)選自聚乙二醇、多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚氯乙烯、聚-Y-谷氨酸、和聚(2-甲基丙烯?；趸一姿崮憠A)的一種或多種凝集促進劑。
9.根據權利要求1的PSA測定方法，其中所述兩種類型的抗PSA單克隆抗體對游離PSA的解離常數(fKd)與對游離PSA和α 1-抗胰凝乳蛋白酶的復合物(PSA-ACT)的解離常數(cKd)的比值(fKd/cKd)為大于0.1且等于或小于2.0,并且對游離PSA的解離常數(fKd)為IOnM或更小，所述凝集促進劑是選自聚乙二醇、多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚氯乙烯、聚-Y-谷氨酸、和聚(2-甲基丙烯?；趸一姿崮憠A)的一種或多種凝集促進劑，并且調節(jié)所述凝集促進劑的量以獲得對游離PSA和游離PSA與α 1-抗胰凝乳蛋白酶的復合物(PSA-ACT)的等摩爾反應。
【文檔編號】G01N33/545GK103443628SQ201280014696
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2012年3月28日 優(yōu)先權日:2011年3月28日
【發(fā)明者】高橋由紀, 清水知, 中村靖, 中山真也, 北原慎一郎 申請人:積水醫(yī)療株式會社