專利名稱：氟甲喹檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
氟甲喹檢測(cè)試劑盒技術(shù)領(lǐng)域：
:本實(shí)用新型涉及一種氟甲喹檢測(cè)試劑盒，特別是檢測(cè)動(dòng)物源性食品中氟甲喹殘留量的試劑盒。背景技術(shù)：
:氟甲喹屬于喹諾酮類抗菌藥，能抑制細(xì)菌DNA螺旋酶，抗菌譜廣、高效、低毒、組織穿透力強(qiáng)，已成為獸醫(yī)臨診和水產(chǎn)養(yǎng)殖中最重要的抗感染藥物之一，被大量用于治療、預(yù)防和促生長(zhǎng)。由于其耐藥性和潛在的致癌性，歐盟、日本及我國(guó)均制定了其組織中的最高殘留限量。目前，常用于氟甲喹殘留檢測(cè)的方法主要有熒光分光光度法和儀器分析法。熒光分光光度法需要專業(yè)的技術(shù)人員來(lái)操作，不適宜推廣使用。儀器分析法主要有高效液相色譜分析法(HPLC)、液質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等，這些方法的前處理過(guò)程繁瑣、檢測(cè)費(fèi)用較高，不宜用于大量樣本篩查。推廣使用均受到限制。(三)實(shí)用新型內(nèi)容:本實(shí)用新型提供一種小巧輕便的氟甲喹檢測(cè)試劑盒，其操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)靈敏度高，成本低，可進(jìn)行一次連續(xù)進(jìn)行多個(gè)樣品中氟甲喹殘留量的測(cè)定，減少了檢測(cè)樣本所需要的時(shí)間。氟甲喹檢測(cè)試劑盒，包括固相載體、放試劑瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的試劑瓶，固相載體上設(shè)有微孔條，微孔條包括微孔、包被層；試劑瓶包括裝有氟甲喹單克隆抗體溶液的試劑瓶、裝有辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體的試劑瓶。所述包被層由氟甲喹偶聯(lián)抗原組成。所述試劑盒還包括6瓶裝有氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)液的試劑瓶，2瓶裝有底物顯色液的試劑瓶，I瓶裝有終止液的試劑瓶，I瓶裝有洗滌液的試劑瓶，I瓶裝有緩沖液的試劑瓶。所述固相載體由96孔聚苯乙烯試劑板組成。每一個(gè)試劑盒中的試劑足夠進(jìn)行96次測(cè)定，既可進(jìn)行一次連續(xù)多個(gè)樣品的檢測(cè)，也可以將板孔拆開(kāi)多次檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，樣本中的氟甲喹將和微孔條包被層的氟甲喹偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)氟甲喹單克隆抗體，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體后，用底物顯色液顯色，樣本吸光度值與樣本中氟甲喹的殘留量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中氟甲喹殘留量。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明本試劑盒具有很高的靈敏度:檢測(cè)靈敏度為:0.3 μ g/L。相對(duì)于其他氟甲喹檢測(cè)方法，本試劑盒所需儀器較少，同類實(shí)驗(yàn)室一般均有配備，所需成本較低。本實(shí)用新型的有益效果是:能快速、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確地用于動(dòng)物源性食品中氟甲喹殘留量的檢測(cè)。


:圖1本實(shí)用新型試劑盒的固相載體一列微孔條圖。圖2本實(shí)用新型固相載體圖。圖3本實(shí)用新型盒體、下凹瓶位結(jié)構(gòu)示意具體實(shí)施方式
:[0015]如圖1至圖3所示，氟甲喹檢測(cè)試劑盒，盒體I內(nèi)具有固定模具形成的下凹瓶位2，下凹瓶位用于放置裝有溶液的試劑瓶，96孔聚苯乙烯試劑板組成的固相載體3，固相載體的的微孔條4包括微孔5和包被層6，包被層由氟甲喹偶聯(lián)抗原組成，試劑瓶包括裝有氟甲喹單克隆抗體溶液的試劑瓶、裝有辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體的試劑瓶。為了更有利于檢測(cè)氟甲喹殘留的檢測(cè)，試劑盒還可以包括有6瓶裝有氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)液的試劑瓶，2瓶裝有底物顯色液的試劑瓶，I瓶裝有終止液的試劑瓶，I瓶裝有洗滌液的試劑瓶，I瓶裝有緩沖液的試劑瓶。試劑盒的試劑瓶?jī)?nèi)的具體成分如下:(I)氟甲喹單克隆抗體工作液7ml /瓶；(2)氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)品溶液Iml/瓶,濃度分別為O μ g/L、0.3 μ g/L、l.2 μ g/L、4.8μ g/L、19.2 μ g/L、76.8 μ g/L ；(3)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液12ml/瓶；(4)底物顯色液，分別為底物顯色A液，底物顯色B液，底物顯色液A液為過(guò)氧化脲7ml/瓶，底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺7ml/瓶；(5)終止液 7ml/瓶；(6)緩沖液50ml/瓶，為含有2%卵清蛋白、pH值為7.1,0.2-0.5mol/L磷酸鹽緩沖液。使用時(shí)2倍稀釋。(7)洗滌液40ml/瓶，為含有0.8%-1.2%吐溫_80、0.5%硫柳汞防腐劑、0.2mol/L磷酸鹽緩沖液。使用時(shí)20倍稀釋。試劑盒中用到的主要材料的制備方法:氟甲喹偶聯(lián)抗原的制備(I)氟甲喹半抗原的制備氟甲喹與6-氨基己酸通過(guò)?；椒ǖ玫健?2)氟甲喹偶聯(lián)抗原的制備將氟甲喹半抗原與卵清蛋白通過(guò)碳化二亞胺法偶聯(lián)得到氟甲喹偶聯(lián)抗原。氟甲喹單克隆抗體的制備( I)動(dòng)物免疫將免疫原(氟甲喹半抗原與牛血清白蛋白通過(guò)碳化二亞胺法偶聯(lián)得到)注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為100 μ g/只，使其產(chǎn)生多克隆抗體血清。(2)細(xì)胞融合和克隆化小鼠血清測(cè)定結(jié)果較高后，取其脾細(xì)胞，按9:1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽(yáng)性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化，直到得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。(3)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇將氟甲喹單克隆雜交瘤細(xì)胞株用凍存液制成I X IO9個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。(4)單克隆抗體的生產(chǎn)與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7天后腹腔注射氟甲喹單克隆雜交瘤細(xì)胞株5X107個(gè)/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，_20°C保存。(5)羊抗鼠抗抗體的制備以羊作為免疫動(dòng)物，以鼠源抗體為免疫原對(duì)無(wú)病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。(6)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體的制備將羊抗鼠抗抗體與辣根過(guò)氧化物酶采用改良后的過(guò)碘酸鈉法進(jìn)行偶聯(lián)得到。(一)使用氟甲喹檢測(cè)試劑盒檢測(cè)氟甲喹的操作步驟:1、取出需要數(shù)量的微孔板。2、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本:加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50 μ I到對(duì)應(yīng)的微孔中，在加入氟甲喹單克隆抗體工作液50 μ I/孔，輕輕振蕩混勻，置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30min。3、洗板:將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250 μ I/孔，充分洗滌4 — 5次，每次間隔IOs,用吸水紙拍干。4、酶標(biāo)二抗:加酶標(biāo)二抗工作液100 μ I到對(duì)應(yīng)的微孔中，輕輕振蕩混勻，置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30min。5、顯色:加入底物液顯色液各50 μ I/孔，混勻，置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)15min。
6、測(cè)定: 加入終止液50 μ I/孔,混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔OD值。(二)結(jié)果判定(I)百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(O標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值，再乘以100%，即
權(quán)利要求1.一種氟甲喹檢測(cè)試劑盒，包括固相載體、放試劑瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的試劑瓶，其特征在于:固相載體上設(shè)有微孔條，微孔條包括微孔、包被層；試劑瓶包括裝有氟甲喹單克隆抗體溶液的試劑瓶、裝有辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體的試劑瓶。
2.如權(quán)利要求1所述的氟甲喹檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述包被層由氟甲喹偶聯(lián)抗原組成。
3.如權(quán)利要求1所述的氟甲喹檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括6瓶裝有氟甲喹標(biāo)準(zhǔn)液的試劑瓶，2瓶裝有顯色液的試劑瓶，I瓶裝有終止液的試劑瓶，I瓶裝有洗滌液的試劑瓶，I瓶裝有緩沖液的試劑瓶。
4.如權(quán)利要求1所述的氟甲喹檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述固相載體由96孔聚苯乙烯試劑板組成。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種氟甲喹檢測(cè)試劑盒。該試劑盒包括固相載體、放試劑的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的試劑瓶，固相載體上設(shè)有微孔條，微孔條包括微孔、包被層，包被層由氟甲喹偶聯(lián)抗原組成；試劑瓶包括裝有氟甲喹單克隆抗體溶液的試劑瓶、裝有辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體的試劑瓶。本實(shí)用新型試劑盒可用于氟甲喹的殘留量檢測(cè)，與儀器分析技術(shù)相比具有使用方便、高靈敏度、檢測(cè)樣本量大等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK203069596SQ20122055833
公開(kāi)日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2012年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月29日
發(fā)明者何方洋, 趙正苗, 羅貴昆, 馮月君, 段盈盈, 王建霞, 何麗霞 申請(qǐng)人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司