專利名稱：一種檢測乳品中氟喹諾酮類藥物的免疫膠體金試劑板的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種檢測乳品中氟喹諾酮類藥物的免疫膠體金試劑板，具體涉及一種檢測乳品中氟喹諾酮類藥物的免疫膠體金快速檢測試劑板。
背景技術(shù)：
牛奶及其制品是人尤其是嬰幼兒的主要營養(yǎng)食品，但殘留抗生素的牛奶會嚴(yán)重危害飲用者的身體健康。近年來，由于經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動，不合理地使用和濫用飼料添加劑的情況經(jīng)常發(fā)生，造成抗生素在動物組織中的殘留，并通過食物鏈進(jìn)入人體，已經(jīng)對人類的健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。牛奶中的抗生素殘留會導(dǎo)致人體內(nèi)產(chǎn)生耐藥性菌株，造成人體內(nèi)的菌群失調(diào)，使人的免疫力降低，嚴(yán)重時(shí)可危及病人生命。另外，殘留抗生素會影響奶制品品質(zhì)，降低產(chǎn)量和質(zhì)量，給生產(chǎn)者造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。氟喹諾酮類(FQNs)又稱吡啶酮酸類藥物，是一類人工合成的廣譜抗菌藥，是近20·年來迅速發(fā)展起來的一類十分重要的廣譜抗生素。FQNs藥物具有抗菌譜廣、抗菌作用強(qiáng)、體內(nèi)分布廣泛、組織藥物濃度高、蛋白結(jié)合率低、使用方便、不良反應(yīng)小及價(jià)格低廉等特點(diǎn)，已成為獸醫(yī)臨診中最重要的抗感染藥物之一，被大量用于治療、預(yù)防和促生長。由于潛在耐藥性和致癌性，其殘留問題已引起世界各國的廣泛關(guān)注。美國禁止在食用動物養(yǎng)殖中使用氟喹諾酮類藥物；我國以及世界衛(wèi)生組織、歐盟、日本等國家和組織都將氟喹諾酮類藥物列入限制使用的獸藥名單中，并制訂出相應(yīng)的最高殘留限量，牛奶中氟喹諾酮類藥物的最高殘留限量在20 100μ g/L之間。因此，開展對牛奶中氟喹諾酮類藥物殘留的檢測方法研究，實(shí)施對氟喹諾酮類藥物殘留的監(jiān)控，已是當(dāng)務(wù)之急。目前國內(nèi)外有關(guān)氟喹諾酮類藥物的檢測方法，主要有微生物法、色譜法、免疫分析法等。但色譜法，如高效液相色譜法(HPLC)，需要昂貴、復(fù)雜的儀器設(shè)備，且操作過程繁瑣，不符合市場監(jiān)控、快速、簡便、價(jià)廉的要求。免疫分析法是將抗原抗體反應(yīng)與靈敏的檢測系統(tǒng)結(jié)合而成的一種簡便、快速、敏感的分析方法，一般不需要昂貴的儀器、前處理簡化、靈敏、特異性強(qiáng)、快速，越來越多地被用于食品中藥物等殘留的檢測。目前，應(yīng)用廣泛的免疫分析方法主要是酶聯(lián)免疫吸附法和膠體金免疫層析法。酶聯(lián)免疫吸附法是應(yīng)用抗原抗體特異性反應(yīng)和酶的高效催化作用來測定藥物含量的免疫分析方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、簡便等優(yōu)點(diǎn)。但是ELISA法中酶的活性易受反應(yīng)條件影響，由此易造成測定結(jié)果重復(fù)性較差。而且需要用到昂貴的特殊儀器設(shè)備，具有一定的局限性。膠體金免疫層析法是在免疫滲濾技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的一種簡易快速的免疫學(xué)檢測技術(shù)。該方法將反應(yīng)所需要的原料的全部或大部分均已整合到試劑中，反應(yīng)通常只需數(shù)分鐘，測試結(jié)果以肉眼可見的顯色條帶來判斷。具有簡便快速、操作簡單、特異性強(qiáng)、不需要額外設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型針對檢測需求，研制開發(fā)一種檢測限符合要求，重現(xiàn)性好，檢測時(shí)間短，適合現(xiàn)場快速檢測，技術(shù)產(chǎn)品或儀器設(shè)備成本較低，運(yùn)行費(fèi)用低的快速檢測試劑。本實(shí)用新型試劑板應(yīng)用層析式抗體免疫競爭原理，通過抗原和金標(biāo)抗體反應(yīng)顯色，特異性檢測牛奶中的氟喹諾酮類藥物殘留水平。如果樣品溶液中含有氟喹諾酮類藥物殘留，氟喹諾酮類藥物先和膠體金顆粒上的抗體反應(yīng)，因此當(dāng)膠體金顆粒隨樣品溶液擴(kuò)散至檢測線時(shí)，膠體金顆粒上抗體的活性位點(diǎn)因被樣品溶液中的氟喹諾酮類藥物藥物占據(jù)而無法與檢測線上氟喹諾酮類藥物特異性抗原結(jié)合；當(dāng)樣品中的氟喹諾酮類藥物含量超過試劑板檢出限時(shí)，試劑板上的檢測線顯色比控制線淺或無顯色，判定為陽性。反之，當(dāng)樣品中氟喹諾酮類藥物含量在試劑板檢出限以下或無殘留時(shí)，試劑板上的檢測線顯色比控制線深或一樣深，判定為陰性。本實(shí)用新型試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品 墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。相鄰各部分間有1-2_的重疊以保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位的順利進(jìn)行。膠體金結(jié)合墊上包被有抗氟喹諾酮類藥物單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物；硝酸纖維素膜上從樣品墊到吸水墊方向依次包被有氟喹諾酮類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG，分別作為檢測線和控制線。偶聯(lián)氟喹諾酮類藥物的載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血監(jiān)蛋白等。本實(shí)用新型試劑板的各部分組成成分和功能如下塑料模板，起固定背襯和標(biāo)示各功能區(qū)(加樣孔、檢測區(qū)、控制區(qū))的作用。背襯，由一面涂有不干膠的不吸水韌性材料制成，起固定支撐試劑板其他組成部分的作用。樣品墊，由玻璃纖維制成，起吸收樣品溶液和緩沖樣品溶液pH值的作用。膠體金結(jié)合墊，由聚酯膜制成，其上有抗氟喹諾酮類藥物單克隆抗體與膠體金顆粒的結(jié)合物，為樣品溶液中有效成分和金標(biāo)抗體反應(yīng)提供場所。硝酸纖維素膜，從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和控制線，將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色表征出來。吸水墊，由濾紙制成，將反應(yīng)過程中多余的溶液吸收。本實(shí)用新型試劑板具有如下有益效果(I)特異性好。本實(shí)用新型試劑板對氟喹諾酮類藥物的交叉反應(yīng)率為100%，對氯霉素、鏈霉素、四環(huán)素、磺胺類抗生素藥物的交叉反應(yīng)率均低于I %?？梢?，本實(shí)用新型試劑板對氟喹諾酮類藥物反應(yīng)具有高度專一性。(2)靈敏度高。本實(shí)用新型試劑板對牛奶中單種氟喹諾酮類藥物的最低檢出限為30μ g/L，在實(shí)際檢測中，可以檢測出多種氟喹諾酮類藥物，其檢測藥物及檢測限見表I。完全可以滿足市場的檢測需求，試劑板適用于各類企業(yè)及檢測機(jī)構(gòu)。表I牛奶中部分氟喹諾酮類藥物檢測限(μ g/L)藥物名稱I環(huán)丙沙星諾氟沙星歡氟沙星麻保沙星洛美沙星沙拉沙星~
檢狽!!限303040306060
藥物名稱左氧氟沙星氟羅沙星氧氟沙星單諾沙星伊諾沙星
檢狽!!限60100100303050
藥物名稱恩諾沙星培氟沙星氨氟沙星加替沙星萘啶酮酸~
檢狽!!限5060100100100100(3)操作簡單快捷。本實(shí)用新型試劑板將反應(yīng)所需的大部分原料整合到PVC背襯中，滴樣后，抗原抗體反應(yīng)在固相膜上快速進(jìn)行，大大縮短檢樣時(shí)間，且樣品無需特殊處理，滴樣后5-10分鐘即可用肉眼通過判斷硝酸纖維素膜上的檢測線和控制線的顏色深淺讀取結(jié)果。檢測實(shí)施過程不依賴任何實(shí)驗(yàn)設(shè)備，普通人員均可操作，不需專業(yè)培訓(xùn)。 (4)成本低，易推廣。本實(shí)用新型試劑板生產(chǎn)工藝簡單,流程成熟。生產(chǎn)成本低廉，投資少，收效快。

圖I為氟喹諾酮類藥物免疫膠體金快速檢測試劑板背襯結(jié)構(gòu)示意圖，其中I為樣品墊，2為膠體金結(jié)合墊，3為硝酸纖維素膜，4為檢測線，5為控制線，6為吸水墊，7為不干膠，8為PVC底板。圖2為氟喹諾酮類藥物免疫膠體金快速檢測試劑板操作示意圖，其中S為加樣孔，C為控制區(qū)，T為檢測區(qū)。圖3為氟喹諾酮類藥物免疫膠體金快速檢測試劑板結(jié)果判定示意圖，其中C為控制區(qū)，T為檢測區(qū)。具體實(shí)施方法本實(shí)用新型試劑板的制備包括載體蛋白偶聯(lián)物的制備，抗氟喹諾酮類藥物單克隆抗體的制備，膠體金溶液的制備，膠體金標(biāo)記抗氟喹諾酮類藥物單克隆抗體的制備和氟喹諾酮類藥物免疫膠體金快速檢測試劑板的組裝。I.半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)采用改進(jìn)的碳二亞胺法將8mg的牛血清蛋白(BSA)溶解在4mLPBS(0. 01mol/L,pH5. O)中，分別加入240mg乙基碳二亞胺(EDC)和20mg環(huán)丙沙星(CIP)，在室溫中反應(yīng)2h靜置，裝入透析袋中，在PBS(0. 01mol/L，pH5. O)中透析2天，期間每天換液一次。偶聯(lián)物冷凍干燥后，_20°C下凍存?zhèn)溆茫藶镃IP-BSA偶聯(lián)物。用卵清蛋白(OVA)替代BSA，采用同樣方法制備CIP半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物。2.抗氟喹諾酮類藥物單克隆抗體的制備(I)FNQs半抗原的制備取吡哌酸(8-乙基-5-氧代-5，8- 二氫_2_ (I-哌嗪基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸)500mg溶于30mL水中，加入EDC 200mg室溫反應(yīng)lh，再加入對氨基苯乙酸150mg反應(yīng)過夜。然后經(jīng)酸洗提取出FNQs半抗原。⑵FNQs半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物的合成先稱取70mg BSA 溶解于 25mLPBS(0. 05mol/L,pH7. 4)中，再加入 25mL 的二甲基甲酰胺(DMF);然后，稱取7. 8mgFNQs半抗原，溶于2mLDMF中，向FNQs半抗原溶液中加入三丁胺6. O μ L，混勻后加入氯甲酸異丁酯3. 8 μ L，于4°C下磁力攪拌25min。磁力攪拌下，將BSA溶液加入到FNQs半抗原溶液中反應(yīng)，用lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH值至9. O。于4°C磁力攪拌下反應(yīng)4h，將最終反應(yīng)液用裝入透析袋中，在PBS(0.01mol/L，pH7.4)中透析。偶聯(lián)物冷凍干燥后，_20°C下凍存?zhèn)溆茫藶镕NQs半抗原-BSA偶聯(lián)物。(3) FNQs單克隆抗體的制備取6 8周齡雌性Balb/c小鼠，將作為免疫原的FNQs半抗原-BSA偶聯(lián)物與等體積的弗氏完全佐劑乳化，按100 μ g/只劑量皮下注射，之后每隔3周加強(qiáng)免疫I次，用不完全佐劑腹腔注射。融合前3d強(qiáng)化免疫I次，不用佐劑，劑量加倍。細(xì)胞融合按常規(guī)方法進(jìn) 行將Sp2/0多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按I : 10的比例混合，在50%聚乙二醇作用下融合，HAT培養(yǎng)基懸浮，分種于96孔培養(yǎng)板中，37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后，待細(xì)胞生長到培養(yǎng)孔面積的1/4時(shí)，采用分步篩選法篩選雜交瘤細(xì)胞。初篩選擇lOmg/LFNQs半抗原-BSA包被酶聯(lián)板，被測孔加培養(yǎng)上清，孵育、清洗后，加入羊抗鼠IgG-HRPd 1000)，oro顯色。篩選出的陽性孔再用卵清蛋白偶聯(lián)物包被的酶聯(lián)板進(jìn)行阻斷間接ELISA。將細(xì)胞培養(yǎng)上清與2X 10_3mol/L氟喹諾酮類藥物溶液等量混合，37°C感作lh，加入已包被的酶標(biāo)板中。另外用PBS (O. 01mol/L、pH7. 4)替代氟喹諾酮類藥物溶液作對照，其余步驟同上。若氟喹諾酮類藥物阻斷后的OD值降至對照孔的50%以下，則判為陽性孔。經(jīng)2 3次檢測都呈陽性的孔，立即用有限稀釋法進(jìn)行克隆化。體外培養(yǎng)將克隆化的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞濃度達(dá)5 X 105/mL時(shí)停止換液，細(xì)胞全部死亡后收集培養(yǎng)液。體內(nèi)誘生腹水給腹腔注射液體石蠟10天后的小鼠腹腔注射克隆化細(xì)胞株IO7個細(xì)胞，7天后抽取腹水。3.膠體金溶液的制備膠體金顆粒的平均大小為30nm，其制備方法為在IOOmL去離子水中加入ImL 1%檸檬酸三鈉，煮沸后迅速加入ImL 1%氯金酸，繼續(xù)煮沸l(wèi)Omin，冷卻后，4°C下保存?zhèn)溆谩?.膠體金標(biāo)記抗氟喹諾酮類藥物單克隆抗體的制備取已制備好的IOOmL膠體金溶液，用O. lmol/L碳酸鉀溶液調(diào)pH到8.0。邊攪拌邊加入I. 5mg抗氟喹諾酮類藥物單抗,攪拌20min,再逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇20000 (PEG20000)，攪拌 15min。20，OOOrpm 離心 15min,棄上清液，加入 IOmL pH 7. 4PBS 緩沖液(含O. 4mol/L PEG)清洗2次。將沉淀用5mL含2% BSA的PBS緩沖液(pH 7. 4)溶解,用O. 22 μ m無菌過濾器過濾后，4°C保存?zhèn)溆谩?.氟喹諾酮類藥物免疫膠體金快速檢測試劑板的組裝參照圖1，用點(diǎn)膜機(jī)把適當(dāng)濃度的CIP-BSA偶聯(lián)物及羊抗鼠IgG噴在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測線和控制線，37°C烘箱干燥8h。以同樣方法，將制備好的金標(biāo)記氟喹諾酮類藥物單克隆抗體包被在膠體金結(jié)合墊上。檢測試劑組成為PVC背襯，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。用切割機(jī)將貼好的大卡切割成4mm寬的條，裝入塑料模板中制成檢測試劑板，再放入帶干燥劑的鋁箔袋中密閉儲存。6.氟喹諾酮類藥物免疫膠體金快速檢測試劑板檢測實(shí)施操作方法6. I樣品制備取400 μ L FQNs專用PBST緩沖液加入潔凈的I. 5mL刻度冷凍管中；用滴管吸取3滴(約ΙΟΟμ 原奶加入到刻度冷凍管中，混合均勻；吸取混合溶液待檢。6. 2檢測步驟從包裝袋中取出試劑板，吸取待檢樣品溶液100 μ L滴加到加樣孔中，加樣后開始計(jì)時(shí)；結(jié)果應(yīng)在3 5min讀取，其他時(shí)間判讀無效。觀察時(shí)，試劑板水平放置于觀察者正面。6. 3結(jié)果判讀讀取結(jié)果時(shí)，將試劑板水平置于觀察者正面，如圖2右側(cè)所示。陰性(-):T線顯色比C線深或一樣深，表示樣品中氟喹諾酮類藥物殘留含量低于檢測限或不含氟喹諾酮類藥物殘留。如圖3. a所示。陽性⑴T線線顯色比C線淺，或T線無顯色，表示樣品中氟喹諾酮類藥物殘留含量等于或高于檢測限。如圖3. b所示。無效未出現(xiàn)C線，可能是操作不當(dāng)或試劑板已失效。應(yīng)再次閱讀說明書，并用新的試劑板重新測試。如圖3. c所示。
權(quán)利要求1.一種檢測乳品中氟喹諾酮類藥物的免疫膠體金試劑板，其特征在于試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，試劑板背襯上依次緊密粘貼的樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，相鄰各部分間有l(wèi)-2mm的重疊以保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位的順利進(jìn)行。
2.如權(quán)利要求I所說的試劑板，其特征在于試劑板的 硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和控制線，將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色表征出來。
3.如權(quán)利要求I所說的試劑板，其特征在于膠體金顆粒的平均大小為30nm。
4.如權(quán)利要求I所說的試劑板，其特征在于，樣品墊由玻璃纖維制成，膠體金結(jié)合墊由聚酯膜制成，吸水墊為濾紙。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種檢測乳品中氟喹諾酮類藥物的免疫膠體金試劑板，試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和控制線，可將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色表征出來。本實(shí)用新型提供的試劑板可用于檢測牛奶中氟喹諾酮類藥物殘留。本實(shí)用新型提供了一種應(yīng)用試劑板檢測牛奶中氟喹諾酮類藥物的快速檢測方法，整個操作過程只需5min左右，且無需任何昂貴實(shí)驗(yàn)設(shè)備輔助，利于大規(guī)模樣本篩選，適合工商部門、檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)、奶站以及乳制品生產(chǎn)加工企業(yè)對原料及產(chǎn)品進(jìn)行大規(guī)?？焖俸Y選。
文檔編號G01N33/577GK202710557SQ20122034049
公開日2013年1月30日 申請日期2012年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月10日
發(fā)明者李云, 王新, 王振國, 邵偉 申請人:杭州南開日新生物技術(shù)有限公司, 石家莊市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心