專利名稱：丁胺卡那霉素elisa檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種檢測(cè)丁胺卡那霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
氨基糖苷類抗生素(AGs)是由氨基糖與氨基環(huán)醇形成的苷，AGs的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)相似。由于結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)氨基和羥基，故呈堿性，極性和水溶性較高。AGs的抗菌作用強(qiáng)，屬常用的抗生素。常用的氨基糖苷類藥物含有I個(gè)1，3或1，4 二氨基環(huán)多醇和I或2個(gè)氨基糖。根據(jù)氨基環(huán)多醇的結(jié)構(gòu)，可將AGs劃分為兩大類鏈霉胺類和2-脫氧鏈霉胺類。按其來源，AGs又可分為由鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素，包括鏈霉素族、卡那霉素族和新霉素族；有小單孢菌產(chǎn)生的抗生素，主要包括慶大霉素族。丁胺卡那霉素(Amikin)又名阿米卡星，是卡那青霉素a的半合成衍生物的硫酸鹽。臨床主要用于對(duì)慶大霉素、卡那霉素耐藥的革蘭陰性桿菌如大腸桿菌、變形桿菌和綠膿桿菌引起的各種感染。長期或反復(fù)大量攝入丁胺卡那霉素可導(dǎo)致前庭神經(jīng)和聽神經(jīng)損害，腎臟出現(xiàn)輕度損害，嚴(yán)重者可出現(xiàn)腎功能衰竭?？敲顾貙儆诎被擒疹惪股?，被廣泛用于治療豬、牛、雞等由金黃色葡萄球菌及結(jié)核桿菌所致的各種感染。為保證我國出口禽肉的衛(wèi)生質(zhì)量和食用安全，促進(jìn)禽肉出口，國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫局2002年第37號(hào)文件中規(guī)定了禁用藥物和允許使用藥物。其中，丁胺卡那霉素最大殘留限量為肌肉100μ g/kg ;肝300yg/kg。日本肯定列表制度將其列為使用一律標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，即最大殘留為10 μ g/kg。目前對(duì)氨基糖苷類抗生素殘留的檢測(cè)方法主要有高效液相法、微生物法、免疫分析法，此外還有一些其他方法用于氨基糖苷類藥物的分析，例如電化學(xué)法、薄層色譜法、質(zhì)譜法等。采用微生物法，不適于快速檢測(cè)。色譜法需要復(fù)雜昂貴的儀器，且樣品前處理過程繁瑣，不適應(yīng)現(xiàn)場(chǎng)大量樣本的篩查。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型所要解決的問題是提供一種小巧輕便的丁胺卡那霉素殘留檢測(cè)試劑盒，其操作簡便，檢測(cè)快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，成本低，穩(wěn)定性好，需要的技術(shù)含量不高，可進(jìn)行一次連續(xù)多個(gè)樣品中丁胺卡那霉素殘留量的測(cè)定，減少了檢測(cè)樣本所需要的時(shí)間。本實(shí)用新型的技術(shù)方案是一種丁胺卡那霉素ELISA檢測(cè)試劑盒，包括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔的酶標(biāo)板、一張蓋板膜、14瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個(gè)自封袋、一份說明書和一份質(zhì)檢報(bào)告，其特征在于酶標(biāo)板是采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預(yù)包被丁胺卡那霉素偶聯(lián)抗原制成的檢測(cè)板，14瓶試劑分別6瓶標(biāo)準(zhǔn)品溶液、I瓶高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)二抗、抗體工作液、底物液A液、底物液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液，下凹瓶位共15個(gè)。盒體是硬紙盒；96孔的聚苯乙烯酶標(biāo)板，放于真空鋁箔袋內(nèi)；蓋板膜是塑料硬膜；標(biāo)準(zhǔn)品溶液和高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液均用黑色帽的棕色玻璃瓶，酶標(biāo)二抗用紅色帽的白色PE塑料瓶，抗體工作液用綠色帽的白色PE塑料瓶，底物液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，底物液B液用紅色帽的黑色PE塑料瓶，終止液用黃色帽的白色PE塑料瓶，濃縮洗滌液用透明帽的半透明PE塑料瓶，濃縮復(fù)溶液用藍(lán)色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。酶標(biāo)板是由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，每個(gè)可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個(gè)反應(yīng)孔，每個(gè)反應(yīng)孔預(yù)包被丁胺卡那霉素偶聯(lián)抗原；蓋板膜大小與酶標(biāo)板橫切面大小一致；標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，Iml/瓶，濃度分別為O μ g/L, I μ g/L, 3 μ g/L, 9 μ g/L, 27 μ g/L ,81 μ g/L ;高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液I瓶，Iml ;酶標(biāo)二抗I瓶，7ml ;抗體工作液I瓶，7ml ;底物液A液I瓶，7ml ;底物液B液I瓶，7ml ;終止液I瓶，7ml ;濃縮洗滌液I瓶，40ml ;濃縮復(fù)溶液I瓶，50ml。每一個(gè)試劑盒中的試劑足夠進(jìn)行96次測(cè)定(包括標(biāo)準(zhǔn)分析孔)，既可進(jìn)行一次連續(xù)多個(gè)樣品的檢測(cè)，也可以將板孔拆開多次檢測(cè)。將剩下的放回鋁箔袋中用自封袋密封，這樣可以保證試劑盒檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。檢測(cè)時(shí)，樣本中的丁胺卡那霉素將和酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被的丁胺卡那霉素偶聯(lián)抗原競(jìng)爭抗丁胺卡那霉素抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物 顯色，樣本吸光度值與樣本中所含丁胺卡那霉素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中丁胺卡那霉素含量，其操作簡便易行。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明本試劑盒檢測(cè)雞蛋中丁胺卡那霉素殘留，具有很高的靈敏度，樣本的最低檢測(cè)限為5μ g/kg，回收率為90%±15%。相對(duì)于采用儀器方法檢測(cè)丁胺卡那霉素，本試劑盒所需儀器較少，只需要酶標(biāo)儀、渦旋儀、離心機(jī)、勻漿機(jī)和微量加樣器等，同類實(shí)驗(yàn)室一般均有配備，所需成本較低。本實(shí)用新型的有益效果是能快速、簡便、靈敏、準(zhǔn)確地用于丁胺卡那霉素殘留量的檢測(cè)。

圖I為本實(shí)用新型酶標(biāo)板的側(cè)面縱剖面圖(長為8. 55cm)；圖2為本實(shí)用新型酶標(biāo)板的側(cè)面橫剖面圖(長為12. 8cm)；圖3為本實(shí)用新型酶標(biāo)板的俯視圖；圖4為本實(shí)用新型蓋板膜平面圖；圖5 5a、5b、5c、5d為本實(shí)用新型試劑瓶縱剖面平面圖；圖6為本實(shí)用新型固定泡沫模具俯視圖；圖7為本實(shí)用新型盒體與固定泡沫模具側(cè)視圖。參見附圖酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)預(yù)包被丁胺卡那霉素偶聯(lián)抗原(3)固定于酶標(biāo)板的外框支撐架(I)上，酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)可隨要求拆卸；蓋板膜(4)用于酶標(biāo)板置水浴或恒溫箱內(nèi)反應(yīng)時(shí)封蓋酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)，蓋板膜大小與酶標(biāo)板橫切面大小一致；透明帽的半透明塑料試劑瓶(5)用于封裝40ml濃縮洗滌液；藍(lán)色帽的半透明塑料試劑瓶(5)用于封裝50ml濃縮復(fù)溶液；白色帽的白色塑料試劑瓶(6)用于封裝7ml底物液A液，紅色帽的黑色塑料試劑瓶(6)用于封裝7ml底物液B液，黃色帽的白色塑料試劑瓶(6)用于封裝7ml終止液，紅色帽的白色塑料試劑瓶(7 )用于封裝7ml酶標(biāo)二抗，綠色帽的白色塑料試劑瓶(7 )用于封裝7ml 丁胺卡那霉素抗體工作液，黑色帽的棕色玻璃瓶(8)用于封裝Iml/瓶的標(biāo)準(zhǔn)品溶液及Iml高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液；盒體為(9)是硬紙盒；泡沫塑料模具(10)有15個(gè)瓶位，放置位置依次為40ml濃縮洗滌液瓶位(18)，50ml濃縮復(fù)溶液瓶位(11 )，7ml底物液A液瓶位(14)，7ml底物液B液瓶位(13)，7ml終止液瓶位(12)，7ml 丁胺卡那霉素抗體工作液瓶位
(16)，7ml酶標(biāo)二抗瓶位(15)，6種Iml/瓶各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液及I瓶Iml高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液瓶位(17)。
具體實(shí)施方式
一、樣本的前處理I.配液配液I :3%三氯乙酸溶液稱取3. OOg三氯乙酸加入去離子水IOOml使其完全溶解。配液2:復(fù)溶工作液用去離子水將2 X濃縮復(fù)溶液按I: I體積比進(jìn)行稀釋(I份2 X濃縮復(fù)溶液+1份去離子水)用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶工作液在4°C環(huán)境可保存一個(gè)月。配液3 :洗滌工作液用去離子水將20 X濃縮洗滌液按1:19體積比進(jìn)行稀釋(I份20X濃縮洗滌液+19份去離子水)用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌工作液在4°C環(huán)境可保存一個(gè)月。2.雞蛋樣本前處理方法先將蛋清和蛋黃充分震蕩或渦動(dòng)，使其混合均勻；稱取I. 0g±0. 05g均質(zhì)物至IOml聚苯乙烯離心管中，分別加入Iml 3%三氯乙酸溶液，Iml三氯甲烷和2 ml乙酸乙酯，用渦旋儀渦動(dòng)3min ；3000g以上，室溫(20_25°C /68-77 °F)離心5min ;移取400 μ I上清液至2ml聚苯乙烯離心管中，再加入600 μ I復(fù)溶工作液渦動(dòng)混勻，取50 μ I用于分析。二、使用試劑盒的操作步驟I、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20_25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C。3、洗滌工作液在使用前也需回溫。4、編號(hào)將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本、酶標(biāo)二抗和抗體工作液加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50 μ I到對(duì)應(yīng)的微孔中，再加酶標(biāo)二抗50 μ I/孔，最后加抗體工作液50 μ I/孔輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30min。6、洗板小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250 μ I/孔，充分洗滌4 一 5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)。7、顯色加入底物液A液50μ I/孔，再加入底物液B液50μ I/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)15min。8、測(cè)定加入終止液50μ I/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測(cè)，請(qǐng)?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))，測(cè)定每孔OD值。三、結(jié)果判定結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第I種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與丁胺卡那霉素含量成負(fù)相關(guān)。I、用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(μ g/L)。例如樣本I的吸光度值為O. 351，樣本2的吸光度值為O. 801，標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值分別是0μ g/L為
2.014 ; I μ g/L 為 I. 518 ;3 μ g/L 為 I. 182 ；9 μ g/L 為 O. 648 ；27 μ g/L 為 O. 287 ；81 μ g/L 為
O.105。則樣本I的濃度范圍是9 μ g/L -27 μ g/L再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中殘留的丁胺卡那霉素濃度范圍；樣本2的濃度范圍是3 μ g/L -9 μ g/L，再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中殘留的丁胺卡那霉素濃度范圍。2、定量分析(I)百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(O標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值，再乘以100%，即
B
百分吸光度值(％) = - X100%
B0B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值B0-0μδ/ 標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以丁胺卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中丁胺卡那霉素實(shí)際含量。四、注意事項(xiàng)I、室溫低于20°C或試劑及樣本沒有回到室溫(20-25°C )會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。3、每加一種試劑前需將其搖勻。4、反應(yīng)終止液為2mol/L硫酸,避免接觸皮膚。5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試齊U，摻雜使用過了有效期的試劑盒會(huì)引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。6、儲(chǔ)存條件保存試劑盒于2_8°C，不要冷凍，將不用的酶標(biāo)板微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。7、試劑變質(zhì)的跡象發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。O標(biāo)準(zhǔn)的吸光度(450/630nm)值小于O. 5 (A450nm<0. 5 )時(shí),表不試劑可能變質(zhì)。8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色10_15min即可。若顏色較淺,可延長反應(yīng)時(shí)間到20min (或更長),但不得超過25min。反之,則減短反應(yīng)時(shí)間。
權(quán)利要求1.一種丁胺卡那霉素ELISA檢測(cè)試劑盒，包括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔的酶標(biāo)板、一張蓋板膜、14瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個(gè)自封袋、一份說明書和一份質(zhì)檢報(bào)告，其特征在于酶標(biāo)板是采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預(yù)包被丁胺卡那霉素偶聯(lián)抗原制成的檢測(cè)板，14瓶試劑分別6瓶標(biāo)準(zhǔn)品溶液、I瓶高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)二抗、抗體工作液、底物液A液、底物液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液，下凹瓶位共15個(gè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于盒體是硬紙盒；96孔的聚苯乙烯酶標(biāo)板，放于真空鋁箔袋內(nèi)；蓋板膜是塑料硬膜；標(biāo)準(zhǔn)品溶液和高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液均用黑色帽的棕色玻璃瓶，酶標(biāo)二抗用紅色帽的白色PE塑料瓶，抗體工作液用綠色帽的白色PE塑料瓶，底物液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，底物液B液用紅色帽的黑色PE塑料瓶，終止液用黃色帽的白色PE塑料瓶，濃縮洗滌液用透明帽的半透明PE塑料瓶，濃縮復(fù)溶液用藍(lán)色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于酶標(biāo)板是由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，每個(gè)可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個(gè)反應(yīng)孔，每個(gè)反應(yīng)孔預(yù)包被丁胺卡那霉素偶聯(lián)抗原；蓋板膜大小與酶標(biāo)板橫切面大小一致；標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶， Iml/瓶，濃度分別為 O μ g/L, I μ g/L, 3 μ g/L,9y g/L,27 μ g/L ,81 μ g/L ;高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液I瓶，Iml ;酶標(biāo)二抗I瓶，7ml ;抗體工作液I瓶，7ml ;底物液A液I瓶，7ml ;底物液B液I瓶，7ml ;終止液I瓶，7ml ;濃縮洗滌液I瓶，40ml ;濃縮復(fù)溶液I瓶，50ml。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種檢測(cè)丁胺卡那霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒。該試劑盒組成包括96孔酶標(biāo)板、酶標(biāo)二抗、丁胺卡那霉素抗體工作液、6個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品、底物液A液、底物液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液。采用間接競(jìng)爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中殘留的丁胺卡那霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭抗丁胺卡那霉素抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中丁胺卡那霉素的含量。與儀器分析技術(shù)相比具有使用方便、高靈敏度等特點(diǎn)，可在丁胺卡那霉素的殘留檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)G01N33/545GK202794176SQ201220298550
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月19日
發(fā)明者萬宇平, 何方洋, 羅曉琴, 羅貴昆, 楊秀賢, 扶勝, 郝士元, 菅艷紅 申請(qǐng)人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司