專利名稱：一種檢測畜肉中鹽酸克倫特羅的免疫膠體金試劑板的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種檢測畜肉中鹽酸克倫特羅的免疫膠體金試劑板，具體涉及一種檢測畜肉中鹽酸克倫特羅的免疫膠體金快速檢測試劑板。
背景技術(shù)：
鹽酸克倫特羅(Clenbuterol，CLB)，又名瘦肉精，為白色或類白色的結(jié)晶粉末，無臭、味苦，易溶于水、甲醇、乙醇，微溶于丙酮、氯仿，不溶于乙醚和苯，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；它是一種人工合成的￠-興奮劑類藥物，具有擴張支氣管的作用，常用來防治哮喘、肺氣腫等肺部疾病。當(dāng)其應(yīng)用劑量達到治療量的5 10倍時，又具有能量重分配作用，可使肌肉合成增力口，脂肪沉積減少，在養(yǎng)豬業(yè)中一些非法使用者將其作為一種生長促進劑添加到飼料中，用以改善胴體的品質(zhì)，但同時也造成了豬肉中鹽酸克倫特羅的殘留。當(dāng)人們食用含有鹽酸克倫特羅殘留的肉品后，常常造成心動過速，低血鉀，低磷酸鹽血癥，肌肉震顫，頭暈，口千，失 眠甚至于癱瘓等中毒癥狀，對心臟病患者更有生命危險。歐盟在1988年就立法禁止使用鹽酸克倫特羅。為保障畜牧業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展和人民的身體健康，我國農(nóng)業(yè)部也已在176號公告《禁止在飼料和動物飲用水中使用的藥物品種目錄》中將鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、西馬特羅、特布他林列入了禁用清單，明令禁止鹽酸克倫特羅使用。然而，受經(jīng)濟利益驅(qū)動以及缺乏有效的監(jiān)測手段，目前仍有不少養(yǎng)殖戶違令使用￠-興奮劑。因此，建立科學(xué)、規(guī)范的藥物殘留監(jiān)控方法十分必要。目前已有多種方法用于對CLB的殘留分析，主要包括酶聯(lián)免疫檢測法(ELISA)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法(GC2MS)、液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法(LC2MS)等，但均需依靠特殊儀器進行分析，不能適應(yīng)市場監(jiān)督需要快速、簡便、價廉的要求。免疫分析法是將抗原抗體反應(yīng)與靈敏的檢測系統(tǒng)結(jié)合而成的一種簡便、快速、敏感的分析方法，一般不需要昂貴的儀器、前處理簡化、靈敏、特異性強、快速，越來越多地被用于食品中藥物等殘留的檢測。目前，應(yīng)用廣泛的免疫分析方法主要是酶聯(lián)免疫吸附法和膠體金免疫層析法。酶聯(lián)免疫吸附法是應(yīng)用抗原抗體特異性反應(yīng)和酶的高效催化作用來測定P -興奮劑類藥物含量的免疫分析方法，具有特異性強、靈敏度高、快速、簡便等優(yōu)點。但是ELISA法中酶的活性易受反應(yīng)條件影響，由此易造成測定結(jié)果重復(fù)性較差。而且需要用到昂貴的特殊儀器設(shè)備，具有一定的局限性。膠體金免疫層析法是在免疫滲濾技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的一種簡易快速的免疫學(xué)檢測技術(shù)。該方法將反應(yīng)所需要的原料的全部或大部分均已整合到試劑中，反應(yīng)通常只需數(shù)分鐘，測試結(jié)果以肉眼可見的顯色條帶來判斷。具有簡便快速、操作簡單、特異性強、不需要額外設(shè)備等優(yōu)點。

實用新型內(nèi)容本實用新型針對檢測需求，研制開發(fā)一種檢測限符合要求，重現(xiàn)性好，檢測時間短，適合現(xiàn)場快速檢測，技術(shù)產(chǎn)品或儀器設(shè)備成本較低，運行費用低的快速檢測試劑。本實用新型試劑板應(yīng)用層析式抗體免疫競爭原理，通過抗原和金標(biāo)抗體反應(yīng)顯色，特異性檢測畜肉中的鹽酸克倫特羅殘留水平。如果樣品溶液中含有鹽酸克倫特羅殘留，鹽酸克倫特羅先和膠體金顆粒上的抗體反應(yīng)，因此當(dāng)膠體金顆粒隨樣品溶液擴散至檢測線時，膠體金顆粒上抗體的活性位點因被樣品溶液中的鹽酸克倫特羅藥物占據(jù)而無法與檢測線上鹽酸克倫特羅特異性抗原結(jié)合；當(dāng)樣品中的鹽酸克倫特羅含量超過試劑板檢出限時，試劑板上的檢測線顯色比控制線淺或無顯色，判定為陽性。反之，當(dāng)樣品中鹽酸克倫特羅含量在試劑板檢出限以下或無殘留時，試劑板上的檢測線顯色比控制線深或一樣深，判定為陰性。本實用新型試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。相鄰各部分間有1-2_的重疊以保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位的順利進行。膠體金結(jié)合墊上包被有抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物；硝酸纖維 素膜上從樣品墊到吸水墊方向依次包被有鹽酸克倫特羅-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG， 分別作為檢測線和控制線。偶聯(lián)鹽酸克倫特羅的載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血監(jiān)蛋白等。本實用新型試劑板的各部分組成成分和功能如下塑料模板，起固定背襯和標(biāo)示各功能區(qū)(加樣孔、檢測區(qū)、控制區(qū))的作用。背襯，由一面涂有不干膠的不吸水韌性材料制成，起固定支撐試劑板其他組成部分的作用。樣品墊，由玻璃纖維制成，起吸收樣品溶液和緩沖樣品溶液pH值的作用。膠體金結(jié)合墊，由聚酯膜制成，其上有抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體與膠體金顆粒的結(jié)合物，為樣品溶液中有效成分和金標(biāo)抗體反應(yīng)提供場所。硝酸纖維素膜，從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和控制線，將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色表征出來。吸水墊，由濾紙制成，將反應(yīng)過程中多余的溶液吸收。本實用新型試劑板具有如下有益效果(I)特異性好。本實用新型試劑板對鹽酸克倫特羅的交叉反應(yīng)率為100%，對如沙丁胺醇、萊克多巴胺等￠-興奮劑類藥物的交叉反應(yīng)率均低于I %。可見，本實用新型試劑板對鹽酸克倫特羅反應(yīng)具有高度專一性。(2)靈敏度高。本實用新型試劑板對樣品中鹽酸克倫特羅的檢出限為5ppb(樣品制備方法簡單)、lppb (樣品制備方法復(fù)雜)，試劑板適用于各類企業(yè)及檢測機構(gòu)。(3)操作簡單快捷。本實用新型試劑板將反應(yīng)所需的大部分原料整合到PVC背襯中，滴樣后，抗原抗體反應(yīng)在固相膜上快速進行，大大縮短檢樣時間，且樣品無需特殊處理，滴樣后5-10分鐘即可用肉眼通過判斷硝酸纖維素膜上的檢測線和控制線的顏色深淺讀取結(jié)果。檢測實施過程不依賴任何實驗設(shè)備，普通人員均可操作，不需專業(yè)培訓(xùn)。(4)成本低，易推廣。本實用新型試劑板生產(chǎn)工藝簡單,流程成熟。生產(chǎn)成本低廉，投資少，收效快。
圖I為鹽酸克倫特羅免疫膠體金快速檢測試劑板背襯結(jié)構(gòu)示意圖，其中I為樣品墊，2為膠體金結(jié)合墊,3為硝酸纖維素膜,4為檢測線,5為控制線,6為吸水墊,7為不干膠，8為PVC底板。圖2為鹽酸克倫特羅免疫膠體金快速檢測試劑板操作示意圖，其中S為加樣孔，C為控制區(qū)，T為檢測區(qū)。圖3為鹽酸克倫特羅免疫膠體金快速檢測試劑板結(jié)果判定示意圖，其中C為控制區(qū)，T為檢測區(qū)。
具體實施方式
本實用新型試劑板的制備包括載體蛋白偶聯(lián)物的制備，抗鹽酸克倫特羅單克隆抗 體的制備，膠體金溶液的制備，膠體金標(biāo)記抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備和鹽酸克倫特羅免疫膠體金快速檢測試劑板的組裝。I.半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)稱取20mg鹽酸克倫特羅，用2mL 0. 5mol/L的硫酸溶液溶解，混勻后加入300 u LlOmg/mL的亞硝酸鈉，持續(xù)反應(yīng)2h。在攪拌下，將溶液逐滴加入到BSA溶液中(IOOmg BSA溶于IOmL 0. Imol/LpHlO. 0的碳酸鈉緩沖溶液)?；靹蚝螅糜?°C下避光反應(yīng)5h (期間可顛倒混勻)，之后用0. 01mol/LpH7. 4的PBS緩沖液透析4天，期間每間隔8h換液一次。再將溶液離心，收集上清液，-20°C下凍存?zhèn)溆?。用卵清蛋?OVA)替代BSA，采用同樣方法制備鹽酸克倫特羅半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物。2.抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備取6 8周齡雌性Balb/c小鼠，將作為免疫原的鹽酸克倫特羅半抗原-BSA偶聯(lián)物與等體積的弗氏完全佐劑乳化，按IOOy g/只劑量皮下注射，之后每隔3周加強免疫I次，用不完全佐劑腹腔注射。融合前3d強化免疫I次，不用佐劑，劑量加倍。細胞融合按常規(guī)方法進行將Sp2/0多發(fā)性骨髓瘤細胞與免疫脾細胞按I : 10的比例混合，在50%聚乙二醇作用下融合，HAT培養(yǎng)基懸浮，分種于96孔培養(yǎng)板中，37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后，待細胞生長到培養(yǎng)孔面積的1/4時，采用分步篩選法篩選雜交瘤細胞。初篩選擇10mG/L鹽酸克倫特羅半抗原-BSA包被酶聯(lián)板，被測孔加培養(yǎng)上清，孵育、清洗后，力口入羊抗鼠IgG-HRP(l 1000)，oro顯色。篩選出的陽性孔再用卵清蛋白偶聯(lián)物包被的酶聯(lián)板進行阻斷間接ELISA。將細胞培養(yǎng)上清與2X 10_3mol/L鹽酸克倫特羅溶液等量混合，37°C感作lh，加入已包被的酶標(biāo)板中。另外用PBS(0.01mol/L、pH7.4)替代鹽酸克倫特羅溶液作對照，其余步驟同上。若鹽酸克倫特羅阻斷后的OD值降至對照孔的50%以下，則判為陽性孔。經(jīng)2 3次檢測都呈陽性的孔，立即用有限稀釋法進行克隆化。體外培養(yǎng)將克隆化的細胞株擴大培養(yǎng)，細胞濃度達5 X 105/mL時停止換液，細胞全部死亡后收集培養(yǎng)液。體內(nèi)誘生腹水給腹腔注射液體石蠟10天后的小鼠腹腔注射克隆化細胞株107個細胞，7天后抽取腹水。3.膠體金溶液的制備膠體金顆粒的平均大小為30nm，其制備方法為在IOOmL去離子水中加入ImL 1%檸檬酸三鈉，煮沸后迅速加入ImL 1%氯金酸，繼續(xù)煮沸l(wèi)Omin，冷卻后，4°C下保存?zhèn)溆谩0038]4.膠體金標(biāo)記抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備取已制備好的IOOmL膠體金溶液，用0. lmol/L碳酸鉀溶液調(diào)pH到8.0。邊攪拌邊加入I. 5mg抗鹽酸克倫特羅單抗，攪拌20min,再逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇20000 (PEG20000)，攪拌 15min。20，OOOrpm 離心 15min,棄上清液，加入 IOmLpH 7. 4PBS 緩沖液(含0. 4mol/L PEG)清洗2次。將沉淀用5mL含2% BSA的PBS緩沖液(pH 7. 4)溶解，用0. 22iim無菌過濾器過濾后，4°C保存?zhèn)溆谩?.鹽酸克倫特羅免疫膠體金快速檢測試劑板的組裝參照圖1，用點膜機把適當(dāng)濃度的載體蛋白偶聯(lián)物及羊抗鼠IgG噴在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測線和控制線，37°C烘箱干燥8h。以同樣方法，將制備好的金標(biāo)記鹽酸克倫特羅單克隆抗體包被在膠體金結(jié)合墊上。檢測試劑組成為PVC背襯，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。用切割機將貼好的大卡切割成4mm寬的條，裝入塑料模板中制成檢測試劑板，再放入帶干燥劑的鋁箔袋中密閉儲存。6.鹽酸克倫特羅免疫膠體金快速檢測試劑板檢測實施操作方法6. I樣品制備(I)樣品簡單制備方法稱取4g左右剪碎的動物組織樣本裝于5mL刻度冷凍管中，蓋緊管蓋，于90°C以上水浴鍋中水浴10分鐘；冷卻至常溫后，取3滴煮出的溶液(盡量吸取上清)于1.5ml離心管中，再加入3滴SAL專用PBST緩沖液，充分混合，待檢。(2)樣品復(fù)雜制備方法取去脂肪組織樣本于均質(zhì)機中均質(zhì)Imin ;稱取2. 5g均質(zhì)物于15mL離心管中，力口A 5mL 0. IM HCl，振蕩混勻IOmin ;加入100 u L4M NaOH,劇烈振蕩30秒后，室溫下4，OOOr/min,離心15min ;轉(zhuǎn)移全部上清于15mL離心管中，加入50 y L4MNaOH,振蕩混勻，再加入8mL乙酸乙酯，振蕩5min ;取上層有機相6mL于試管中，65°C氮(空)氣吹干；向吹干的試管中依次加入0. 3mL正己烷和0. 3mL SAL專用PBST緩沖液，充分溶解試管壁上殘留物，靜置分層后，吸取下層溶液，待檢。6. 2檢測步驟從包裝袋中取出試劑板，吸取待檢樣品溶液100 U L滴加到加樣孔中，加樣后開始計時；結(jié)果應(yīng)在3 5min讀取，其他時間判讀無效。觀察時，試劑板水平放置于觀察者正面。6. 3結(jié)果判讀讀取結(jié)果時，將試劑板水平置于觀察者正面，如圖2右側(cè)所示。陰性(-):T線顯色比C線深或一樣深，表示樣品中鹽酸克倫特羅殘留含量低于檢測限或不含鹽酸克倫特羅殘留。如圖3. a所示。陽性(+) :T線線顯色比C線淺，或T線無顯色，表示樣品中鹽酸克倫特羅殘留含量高于檢測限。如圖3. b所示。無效未出現(xiàn)C線，可能是操作不當(dāng)或試劑板已失效。應(yīng)再次閱讀說明書，并用新的試劑板重新測試。如圖3. c所示。
權(quán)利要求1.一種檢測畜肉中鹽酸克倫特羅的免疫膠體金試劑板，其特征在于試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，試劑板背襯上依次緊密粘貼的樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊相鄰各部分間有l(wèi)-2mm的重疊以保證層析作用從樣品墊到吸水墊部位的順利進行。
2.如權(quán)利要求I所說的試劑板，其特征在于試劑板的硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和控制線，將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色表征出來。
3.如權(quán)利要求I所說的試劑板，其特征在于膠體金顆粒的平均大小為30nm。
4.如權(quán)利要求I所說的試劑板，其特征在干，樣品墊由玻璃纖維制成，膠體金結(jié)合墊由聚酯膜制成，吸水墊為濾紙。
專利摘要本實用新型涉及一種檢測畜肉中鹽酸克倫特羅的免疫膠體金試劑板，可用于檢測畜肉中是否有鹽酸克倫特羅殘留。本實用新型試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和控制線，可將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色表征出來。該試劑板可進行半定量直觀檢測，整個操作過程最短只需15分鐘左右，且無需任何昂貴實驗設(shè)備輔助，利于大規(guī)模樣本篩選，適合屠宰企業(yè)及政府檢測機構(gòu)檢測需求。
文檔編號G01N33/558GK202614764SQ201220273420
公開日2012年12月19日 申請日期2012年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月4日
發(fā)明者王森, 張少恩, 桑麗雅 申請人:杭州南開日新生物技術(shù)有限公司, 紹興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院