專利名稱：一種尿液中cema和hema的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定方法
技術領域：

本發(fā)明屬于尿液樣本的理化檢驗技術領域，主要涉及尿液樣本的巰基尿酸測定技術領域，具體說是一種采用液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定尿液中N-乙?；?S-(2-腈基乙基)-L-半胱氨酸(CEMA)和N-乙?；?S- (2-羥基乙基)-L-半胱氨酸(HEMA)含量的方法。
背景技術：
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丙烯腈是含有活性乙烯基和腈基的a，b-不飽和腈類化合物。它可以通過代謝活化后形成活性更強的環(huán)氧型中間體，進一步與體內(nèi)的細胞大分子的親核中心共價結(jié)合，從而造成機體的損傷。體外毒理學實驗和流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，丙烯腈具有一定的致癌性。1999年，IARC將其歸為可能的人類致癌物。丙烯腈存在于卷煙煙氣中(7.8-39.1 yg/支煙)，普通人群可以通過吸入卷煙煙氣接觸丙烯腈，從而增加健康風險。丙烯腈進入體內(nèi)后于可以直接或通過代謝活化后于GSH，形成兩種巰基尿酸代謝物:CEMA和HEMA。尿液中的CEMA和HEMA不僅能提供丙烯腈及其可能的代謝中間物及其與GSH結(jié)合機制的有關信息，而且能在一定程度上反映丙烯腈在體內(nèi)的代謝狀況。2007年，Scherer等研究了 CEMA和HEMA等生物標志物與抽吸卷煙原型物釋放量之間的關系，用于評估接觸風險。LC-MS/MS可以用于測定尿液中的CEMA和HEMA含量，并應用于吸煙人群的生物監(jiān)測。由于尿液中CEMA和HEMA在普通人群中的含量較低、尿液基質(zhì)較為復雜使得一些已經(jīng)建立的LC-MS/MS方法在檢測非吸煙者尿液中的CEMA和HEMA時受到限制。分析柱填料粒徑低于2 μ m的液相色譜的出現(xiàn)為復雜生物混合物提供了更好的分離能力，其與質(zhì)譜的聯(lián)用，降低了分析物的檢出限及質(zhì)譜檢測的離子抑制現(xiàn)象，并提高了分析速度，從而可以實現(xiàn)快速、高通量的分析。本發(fā)明以尿液中的CEMA和HEMA為研究對象，建立了直接稀釋進樣快速高分辨液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(RRLC-MS/MS)測定人體尿液中的CEMA和HEMA方法。發(fā)明內(nèi)容:
本發(fā)明的目的旨在克服現(xiàn)有技術缺陷，提供一種采用LC-MS/MS測定卷煙尿液中CEMA和HEMA含量的方法，該方法能快速、準確檢測尿液中CEMA和HEMA的含量，測定結(jié)果準確、測定干擾少。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的:尿液中CEMA和HEMA含量的測定方法，包括以下工藝步驟:
a、收集志愿者尿液。b、樣品前處理:尿液在室溫下解凍，混合均勻。準確移取1.0 mL的尿液并加入10μ L的甲酸酸化,在10000 rpm的條件下離心`10 min。取上清液過0.22 μ m的聚醚砜水相濾膜。移取100 μ L的濾液于2.0 mL旋蓋色譜瓶,加入100 μ L混合內(nèi)標,加入800 μ L
0.1%甲酸水溶液并混合均勻，取2.0 μ L進LC-MS/MS分析。C、利用甲醇配制不同濃度的標準工作溶液d、LC-MS/MS測定，吸取配制好的不同濃度的CEMA和HEMA標準工作溶液，注入LC-MS/MS系統(tǒng)，CEMA和HEMA的線性回歸方程為y=0.0508+0.00356和y=0.05x+0.00745，其中Y代表分析物與內(nèi)標峰面積的比值，X表示尿液中目標分析物的濃度。相關系數(shù)大于0.999，對樣品待測液進行測定，測得分析物與內(nèi)標峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量。在本發(fā)明中，所述混合內(nèi)標為氘代內(nèi)標，氘代內(nèi)標濃度為I Pg/mL。本發(fā)明中選取了選取了Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 (RRHT 2.1 X 50 mm,1.8 μπι)色譜柱，流動相A:0.1%甲酸水溶液，流動相B:0.1%甲酸乙腈；梯度洗脫條件:0-1 min,95% A -95% A;1_3 min, 95% A - 5% A ;3_4.5 min,5% A；4.5-5 min,5% A - 95%A ；5-6 min, 95% A，分析時間為6 min，進樣量為2 μ L。串聯(lián)質(zhì)譜檢測器的條件:電噴霧離子源，多反應監(jiān)測負離子掃描方式；噴霧電壓
(IS):-4400V，霧化氣(Gasl):55 psi，氣簾氣壓力(CUR):35 psi，輔助霧化氣(Gas2):50psi，離子源溫度(TEM):530。C，進口電壓(EP):-10 V，出口電壓(CXP):-10 V，駐留時間:100 ms ο監(jiān)測離子對及其相應的碰撞能量(CE)見表1:
表I CEMA和HEMA及其氣代標準品的保留時間以及部分質(zhì)譜參數(shù)
權(quán)利要求
1.一種尿液中CEMA和HEMA的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，其特征在于:包括以下工藝步驟: a、收集志愿者尿液； b、樣品前處理:尿液在室溫下解凍，混合均勻，準確移取1.0 mL的尿液并加入10 μ L的甲酸酸化，在10000 rpm的條件下離心10 min,取上清液過0.22 μπι的聚醚砜水相濾膜，移取100 μ L的濾液于2.0 mL旋蓋色譜瓶，加入100 μ L混合內(nèi)標，加入800 μ L 0.1%甲酸水溶液并混合均勻，取2.0 μ L進LC-MS/MS分析； C、標準工作液的配制:用甲醇配制不同濃度的CEMA和HEMA標準工作溶液； d、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測定，吸取配制好的不同濃度的CEMA和HEMA標準工作溶液，注入LC-MS/MS系統(tǒng)，CEMA的線性回歸方程為y=0.0508+0.00356，HEMA的線性回歸方程為y=0.05x+0.00745，其中Y代表分析物與內(nèi)標峰面積的比值，X表示尿液中目標分析物的濃度，相關系數(shù)大于0.999，對樣品待測液進行測定，測得分析物與內(nèi)標峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于:混合內(nèi)標為氘代內(nèi)標，氘代內(nèi)標濃度為 I Pg/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于:在LC-MS/MS測定中，選取了AgilentZorbax Eclipse Plus C18 (RRHT 2.1 X 50 mm, 1.8 Mm)色譜柱，流動相 A:0.1% 甲酸水溶液，流動相B:0.1%甲酸乙腈；采用梯度洗脫，分析時間為6 min，進樣量為2 μ L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的測定方法，其特征在于:梯度洗脫條件:0-1min, 95% A - 95%A ；1-3 min, 95% A -5% A ;3_4.5 min,5% A ；4.5-5 min,5% A -95% A ；5~6 min,95% A，流動相流速為400 μ L/min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于:串聯(lián)質(zhì)譜檢測器的條件:電噴霧離子源，多反應監(jiān)測負離子掃描方式；噴霧電壓(is):-4400V，霧化氣(Gasl):55 psi，氣簾氣壓力(CUR):35 psi，輔助霧化氣(Gas2):50 psi，離子源溫度(TEM):530 ° C，進口電壓(EP):-10 V，出 口電壓(CXP):-10 V，駐留時間:100 ms。
全文摘要
一種尿液中CEMA和HEMA的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，其特征在于該方法包括以下步驟a.收集志愿者尿液，b.樣品前處理，c.標準工作溶液的配制，d.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。本發(fā)明的特點是樣品經(jīng)稀釋后直接引入液相色譜-電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜儀進行測定，可快速、準確檢測出尿液中CEMA和HEMA的含量水平。本發(fā)明為全新的尿液中CEMA和HEMA含量的測定方法，采用氘代標準品作為內(nèi)標定量分析物，可以減少樣品前處理過程中引起的誤差；串聯(lián)質(zhì)譜法更好的提高了方法的選擇性與準確性。通過色譜柱以及洗脫條件的選擇與優(yōu)化，較好的提高了色譜分離過程，縮短了色譜分析的時間。
文檔編號G01N30/72GK103115993SQ20121058831
公開日2013年5月22日 申請日期2012年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月29日
發(fā)明者侯宏衛(wèi), 張小濤, 田永峰, 劉彤, 陳歡, 韓書磊, 胡清源 申請人:國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心