本發(fā)明的主題是用于預(yù)測(cè)未患有癌癥的雌性對(duì)象中患上癌癥的風(fēng)險(xiǎn)或者診斷雌性對(duì)象中的癌癥的方法，所述方法包括：·確定神經(jīng)降壓素原或其至少5個(gè)氨基酸的片段在從所述雌性對(duì)象獲得的體液中的水平；和·將神經(jīng)降壓素原或其片段的所述水平與患上癌癥的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)，其中水平升高預(yù)示患上癌癥的風(fēng)險(xiǎn)增加或者用于診斷癌癥，其中水平升高與癌癥的診斷相關(guān)聯(lián)，并且其中所述癌癥選自乳腺癌、肺癌、胰腺癌和結(jié)腸癌。
背景技術(shù)：
：神經(jīng)降壓素是源自于前神經(jīng)降壓素原前體的13個(gè)氨基酸的神經(jīng)肽，并與穩(wěn)定的117個(gè)氨基酸的肽神經(jīng)降壓素原(P-NT)一起按化學(xué)計(jì)量比例釋放，成熟的激素與3種不同的受體結(jié)合，分別是神經(jīng)降壓素受體1和2(Ntsr1和Ntsr2)以及神經(jīng)降壓素受體3(Ntsr3)，其中神經(jīng)降壓素受體1和2是G蛋白偶聯(lián)受體，神經(jīng)降壓素受體3是非G蛋白偶聯(lián)受體并且也被稱為Sortillin-1(SORT1)。神經(jīng)降壓素由小腸在外周釋放，也由下丘腦在中央釋放。神經(jīng)降壓素的外周分泌受到食物攝取、尤其是脂肪的刺激，并且已知其能夠調(diào)節(jié)胃腸蠕動(dòng)以及胰腺和膽汁的分泌。有趣的是，神經(jīng)降壓素作為抑制食欲的激素而參與食欲控制，因?yàn)樗?jīng)中央(腦室內(nèi))和外周(腹腔內(nèi))注入大鼠之后，能夠嚴(yán)重減少食物的攝取，這種效應(yīng)似乎主要是通過(guò)神經(jīng)降壓素-1受體(Ntsr1)介導(dǎo)的。在與正常體重人類對(duì)象相比而言的肥胖者中，在液體脂肪餐后，餐后血漿神經(jīng)降壓素濃度降低(Widen等，1992，RegPeptides；在改良的假飼(MSF)和液體試驗(yàn)餐后肥胖者中調(diào)節(jié)肽的血漿濃度(Plasmaconcentrationsofregulatorypeptidesinobseityfollowingmodifiedshamfeeding(MSF)andaliquidtestmeal))，這說(shuō)明肥胖者中的神經(jīng)降壓素分泌調(diào)節(jié)失常。但是，還沒(méi)有大規(guī)模的研究探討過(guò)神經(jīng)降壓素是否以及如何與肥胖程度相關(guān)。有趣的是，P-NT在胃旁路手術(shù)(Roux-en-Y)后顯著增加，據(jù)顯示，這是在大多數(shù)肥胖的2型糖尿病患者中能導(dǎo)致血糖正常的手術(shù)，但是尚不知道神經(jīng)降壓素總的來(lái)說(shuō)是否參與糖尿病的發(fā)展。此外，神經(jīng)降壓素系統(tǒng)參與冠狀動(dòng)脈疾病和心肌梗死的發(fā)展，因?yàn)镹tsr3(SORT1)基因的變異是人類中已知的最強(qiáng)的冠狀動(dòng)脈疾病常見易感基因之一。肥胖和癌癥之間在機(jī)制上的聯(lián)系基本上是未知的，但是，主流理論之一是過(guò)多的脂肪沉積會(huì)導(dǎo)致外周雄激素的芳構(gòu)化增加，并由此導(dǎo)致循環(huán)的雌激素水平升高。另外，據(jù)顯示，肥胖的特征之一高胰島素血癥會(huì)抑制肝臟產(chǎn)生性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)，進(jìn)而使雌激素和雄激素兩者的可生物利用的水平升高，這揭示了肥胖使常見形式的由性激素引起的癌癥形式例如乳腺癌和前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加的途徑。有趣的是，神經(jīng)降壓素和Nstr1兩者的表達(dá)在惡性乳腺導(dǎo)管癌腫瘤中都很常見，并且實(shí)驗(yàn)性地藥理阻斷或RNA沉默NTSR1能夠使小鼠中的腫瘤生長(zhǎng)降低。乳腺癌細(xì)胞中神經(jīng)降壓素受體1(NTSR1)的表達(dá)水平已被用于確定患有乳腺癌的對(duì)象的預(yù)后(US2011/0305633)。另外，同一作者指出，當(dāng)前尚未描述出循環(huán)的神經(jīng)降壓素與胰腺、前列腺、或髓樣甲狀腺腫瘤的分期之間的明確的關(guān)聯(lián)性，這可能是由于肝臟對(duì)神經(jīng)降壓素的快速清除。有趣的是，已發(fā)現(xiàn)，在一組51名患侵襲性乳腺導(dǎo)管癌的患者中，所有腫瘤中有91％腫瘤的神經(jīng)降壓素受體1(NTSR1)為陽(yáng)性，但所有腫瘤中只有31％腫瘤在所述組織中的神經(jīng)降壓素為陽(yáng)性(Souaze等.CanerResearch(2006)，66：(12)pages6243-6249)。有一些證據(jù)可表明神經(jīng)降壓素和神經(jīng)降壓素受體參與了癌的生長(zhǎng)，尤其是參與肺癌、胰腺癌和結(jié)腸癌的生長(zhǎng)(Carraway等，Peptides(2006)，272445-2460)。據(jù)報(bào)道，胰腺癌患者血清中的NT水平顯著升高(Picheon等，AnticancerResearch(1999)，191445-50)。有趣的是，該組發(fā)現(xiàn)，對(duì)于胰腺癌和前列腺癌兩者而言，NT水平隨著疾病的進(jìn)展而降低。相反地，對(duì)此，Meggiato等(Tumori(1996)，82；592～5，)發(fā)現(xiàn)NT的血漿水平在胰腺癌中是正常的，但在診斷為胰腺炎的病例中卻是升高的。Belting等，Cancer，Epidemiology，Biomarkes&Prevention已報(bào)道了血管活性肽用于預(yù)測(cè)男性中的癌癥風(fēng)險(xiǎn)的應(yīng)用。測(cè)定了來(lái)自馬爾默飲食與癌癥研究的參與者(1768名男性和2293名女性)的空腹血漿中的MR-pro-ANP、MR-pro-ADM以及和肽素，所述參與者于1991-1994年接受基線檢查前沒(méi)有癌癥。作者表明，在女性中，生物標(biāo)志物與癌癥發(fā)生率之間沒(méi)有聯(lián)系。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的主題是研究用于預(yù)測(cè)癌癥發(fā)生率和預(yù)測(cè)癌癥復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的NT的預(yù)測(cè)和診斷能力。為了解決這個(gè)問(wèn)題，在所述瑞典前瞻性世代研究(馬爾默飲食與癌癥研究)中測(cè)定了空腹血漿中神經(jīng)降壓素原的穩(wěn)定的片段，并將該生物標(biāo)志物的基線水平與15年隨訪期間的乳腺癌發(fā)生率相關(guān)聯(lián)。令人驚奇的是，據(jù)顯示，對(duì)于女性而言，神經(jīng)降壓素是強(qiáng)有力且高度顯著的生物標(biāo)志物，用于預(yù)測(cè)未患有癌癥的雌性對(duì)象中患上癌癥的風(fēng)險(xiǎn)或者診斷雌性對(duì)象中的癌癥。因此，本發(fā)明的主題是用于預(yù)測(cè)未患有癌癥的雌性對(duì)象中患上癌癥的風(fēng)險(xiǎn)或者診斷雌性對(duì)象中的癌癥的方法，所述方法包括：·確定神經(jīng)降壓素原或其至少5個(gè)氨基酸的片段在從所述雌性對(duì)象獲得的體液中的水平；和·將神經(jīng)降壓素原或其片段的所述水平與患上癌癥的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)，其中水平升高預(yù)示患上癌癥的風(fēng)險(xiǎn)增加或者用于診斷癌癥，其中水平升高與癌癥的診斷相關(guān)聯(lián)，其中所述癌癥選自乳腺癌、肺癌、胰腺癌和結(jié)腸癌。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述癌癥是乳腺癌。因此，本發(fā)明的主題是確定女性對(duì)獲得癌癥例如乳腺癌的易感性。本研究中獲得的數(shù)據(jù)還揭示了雄性對(duì)象中患上癌癥的風(fēng)險(xiǎn)與神經(jīng)降壓素原或其至少5個(gè)氨基酸的片段在從所述雄性對(duì)象獲得的體液中的水平之間的關(guān)聯(lián)性；然而，對(duì)于目前的數(shù)據(jù)集來(lái)說(shuō)，這種關(guān)聯(lián)性不是那么顯著的。因此，本發(fā)明的方法的值也適用于雄性對(duì)象，但是在本研究中，與雌性相比，所觀察到的效果對(duì)于雄性來(lái)說(shuō)不是那么強(qiáng)的。附圖說(shuō)明圖1示出了典型的P-NT劑量/信號(hào)曲線。圖2：KaplanMeier圖，示出了在a)低于和高于P-NT中位數(shù)(109pmol/l)以及b)四分位數(shù)(Q)1與四分位數(shù)4(低于79pmol/l和高于150pmol/l)的女性中診斷的累積的乳腺癌。具體實(shí)施方式此處使用的術(shù)語(yǔ)“對(duì)象”是指有生命的人類或非人類的生物體。在本文中，優(yōu)選地，所述對(duì)象是人類對(duì)象。術(shù)語(yǔ)“水平升高”的意思是在一定的閾值水平之上的水平。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，神經(jīng)降壓素原或其至少5個(gè)氨基酸的片段在體液中的水平是神經(jīng)降壓素原或其至少5個(gè)氨基酸的片段的空腹水平?？崭顾降囊馑际遣扇⊙獦忧?2小時(shí)沒(méi)有攝取食物。體液可以選自血液、血清、血漿、尿液、腦脊液(csf)、和唾液。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在從所述雌性對(duì)象采取體液樣品時(shí)，所述雌性對(duì)象從沒(méi)有診斷的癌癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在從所述雌性對(duì)象采取體液樣品并且確定患上癌癥的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)或者診斷癌癥的復(fù)發(fā)時(shí)，所述雌性對(duì)象已在之前被診斷為患有癌癥并已治愈。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在從所述雌性對(duì)象采取體液樣品時(shí)，所述雌性對(duì)象已被診斷為患有心血管疾病或糖尿病。所述心血管疾病可以選自心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化、和高血壓。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在從所述雌性對(duì)象采取體液樣品時(shí)，所述雌性對(duì)象已被診斷為患有2型糖尿病。糖尿病的定義如下：在基線檢查時(shí)具有物理診斷史、或在服用抗糖尿病藥物、或空腹全血血糖＞/＝6.1mmol/l(注意，這相當(dāng)于血漿中的7.0mmol/l)。血壓正常/高血壓(HBP)的定義如下：HBP：收縮壓＞/＝140mmHg或舒張壓＞/＝90mmHg或在服用抗高血壓藥物。具有正常血壓(BP)的對(duì)象是所有其他對(duì)象，即收縮壓＜140并且舒張壓＜90并且沒(méi)有服用抗高血壓藥物的對(duì)象。目前的數(shù)據(jù)表明，在未患有盛行的糖尿病、盛行的乳腺癌、和盛行的心血管疾病的女性中，神經(jīng)降壓素原或其片段的水平與癌癥、特別是乳腺癌之間存在著強(qiáng)關(guān)聯(lián)性。目前的數(shù)據(jù)還表明，在高血壓女性中，神經(jīng)降壓素原或其片段的水平與癌癥、特別是乳腺癌之間存在著強(qiáng)關(guān)聯(lián)性，所述高血壓女性是心血管疾病的常見高風(fēng)險(xiǎn)組。此外，目前的數(shù)據(jù)還表明，在血壓正常的女性中，神經(jīng)降壓素原或其片段的水平與癌癥、特別是乳腺癌之間存在著強(qiáng)關(guān)聯(lián)性。此外，目前的數(shù)據(jù)表明，在糖尿病女性中，神經(jīng)降壓素原或其片段的水平與癌癥、特別是乳腺癌之間存在著強(qiáng)關(guān)聯(lián)性。在本發(fā)明方法的具體實(shí)施方案中，另外確定至少一種臨床參數(shù)，所述臨床參數(shù)選自：年齡、糖尿病的存在、目前吸煙。體液中可能檢測(cè)到的神經(jīng)降壓素原片段例如可以選自以下片段：SEQIDNO：1(神經(jīng)降壓素原1-147)SESEEEMKALEADFLTNMHTSKISKAHVPSWKMTLLNVCSLVNNLNSPAEETGEVHEEELVARRKLPTALDFGSLEAMLTIYQLHKICHSRAFQHWELIQEDILDTGNDKNGKEEVIKRKIPYILKRQLYENKPRRRYILKRDSYYYSEQIDNO：2(神經(jīng)降壓素原1-125(大的神經(jīng)調(diào)節(jié)肽N))SDSEEEMKALEADFLTNMHTSKISKAHVPSWKMTLLNVCSLVNNLNSPAEETGEVHEEELVARRKLPTALDGFSLEAMLTIYQLHKICHSRAFQHWELIQEDILDTGNDKNGKEEVIKRKIPYILSEQIDNO：3(神經(jīng)調(diào)節(jié)肽N：)KIPYILSEQIDNO：4(神經(jīng)降壓素)pyroQLYENKPRRPYILSEQIDNO：5(神經(jīng)降壓素原1-117)SDSEEEMKALEADFLTNMHTSKISKAHVPSWKMTLLNVCSLVNNLNSPAEETGEVHEEELVARRKLPTALDGFSLEAMLTIYQLHKICHSRAFQHWELIQEDILDTGNDKNGKEEVISEQIDNO：6(神經(jīng)降壓素原1-132)SDSEEEMKALEADFLTNMHTSKISKAHVPSWKMTLLNVCSLVNNLNSPAEETGEVHEEELVARRKLPTALDGFSLEAMLTIYQLHKICHSRAFQHWELIQEDILDTGNDKNGKEEVIKRKIPYILKRQLYENSeqIDNO：7(神經(jīng)降壓素原1-125)SDSEEEMKALEADFLTNMHTSKISKAHVPSWKMTLLNVCSLVNNLNSPAEETGEVHEEELVARRKLPTALDGFSLEAMLTIYQLHKICHSRAFQHWELIQEDILDTGNDKNGKEEVIKRKIPYILSEQIDNO：8(神經(jīng)降壓素原120-140)KIPYILKRQLYENKPRRPYILSEQIDNO：9(神經(jīng)降壓素原120-147)KIPYILKRQLYENKPRRPYILKRDSYYYSEQIDNO：10(神經(jīng)降壓素原128-147)QLYENKPRRPYILKRDSYYY在本發(fā)明方法的更具體的實(shí)施方案中，確定神經(jīng)降壓素原1-117的水平。在具體的實(shí)施方案中，用免疫檢測(cè)法測(cè)定神經(jīng)降壓素原的水平。更具體地，免疫檢測(cè)法是按照Ernst等(Peptides(2006)，(27)1787-1793)中的描述使用的?？捎糜诖_定神經(jīng)降壓素原或其至少5個(gè)氨基酸的片段的水平的免疫檢測(cè)法是基于本發(fā)明的結(jié)合物，所述結(jié)合物用于在雌性對(duì)象的離體體液中，選擇性測(cè)定針對(duì)根據(jù)SEQIDNO：1至SEQIDNO：10所述的任何神經(jīng)降壓素原序列中的至少一種的免疫反應(yīng)性。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可用于確定神經(jīng)降壓素原或其至少5個(gè)氨基酸的片段的水平的免疫檢測(cè)法是基于本發(fā)明的兩種不同的結(jié)合物，所述結(jié)合物用于在雌性對(duì)象的離體體液中，選擇性測(cè)定針對(duì)根據(jù)SEQIDNO：1至SEQIDNO：10所述的任何神經(jīng)降壓素原序列中的兩種不同的部分序列的免疫反應(yīng)性。因此，在根據(jù)SEQIDNO：1至SEQIDNO：10中任一個(gè)所述的神經(jīng)降壓素原的同一部分中，兩種結(jié)合物靶向不同的序列。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，免疫檢測(cè)法可用于確定神經(jīng)降壓素原或其至少5個(gè)氨基酸的片段的水平，其中兩種不同的結(jié)合物特異性地靶向根據(jù)SEQIDNO：5所述的神經(jīng)降壓素原的N端部分1-117以選擇性測(cè)定針對(duì)該序列的免疫反應(yīng)性，所述免疫檢測(cè)法的特征在于所述免疫反應(yīng)性不是神經(jīng)降壓素(NT)(SEQIDNO：4)或神經(jīng)調(diào)節(jié)肽N(NMN)(SEQIDNO：3)的免疫反應(yīng)性。由此，通過(guò)使用兩種不同的結(jié)合物進(jìn)行的夾心免疫檢測(cè)法，免疫檢測(cè)法僅特異性地識(shí)別神經(jīng)降壓素原的N端肽，所述兩種不同的結(jié)合物與所述N端序列的不同的部分序列發(fā)生特異性結(jié)合，所述不同的部分序列含有完整的前神經(jīng)降壓素原的第67-85位氨基酸和第121-140位氨基酸兩者(如Ernst等(2006)中的圖1所示)。(對(duì)此，參見US2008/0280306——用于測(cè)定釋放進(jìn)入到循環(huán)中的神經(jīng)降壓素的免疫檢測(cè)法(Immunoassayfordeterminingthereleaseofneurotensinintothecirculation)；以及Ernst等，神經(jīng)降壓素原1-117：在人體循環(huán)中鑒定到的穩(wěn)定的神經(jīng)降壓素前體片段(Proneurotensin1-117，astableneurotensinprecursorfragmentidentifiedinhumancirculation)，Peptides(27)，1787-1793(2006))。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，上述免疫檢測(cè)法的特征還可以在于，在結(jié)合物是抗體的情況下，結(jié)合物是特異性的單抗隆抗體和/或親和純化的多克隆抗體。其中的一種抗體可以以與固相結(jié)合的形式使用，該固相優(yōu)選地是各自的試管壁，并且第二抗體是標(biāo)記的或可選擇性標(biāo)記的抗體。可以用放射性同位素或通過(guò)化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、熒光、或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的酶標(biāo)記進(jìn)行所述標(biāo)記。優(yōu)選地，所述第二抗體是通過(guò)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的。由于標(biāo)記了兩種抗體中的至少一種，因此，在將兩種抗體結(jié)合到根據(jù)SEQIDNO：1至SEQIDNO：10中任一個(gè)所述的神經(jīng)降壓素原之后，產(chǎn)生了可測(cè)定的信號(hào)，這使得所產(chǎn)生的夾心復(fù)合物能夠在測(cè)定溶液中被檢測(cè)到。(對(duì)此，參見US2008/0280306——用于測(cè)定釋放進(jìn)入到循環(huán)中的神經(jīng)降壓素的免疫檢測(cè)法(Immunoassayfordeterminingthereleaseofneurotensinintothecirculation)；以及Ernst等，神經(jīng)降壓素原1-117：在人體循環(huán)中鑒定到的穩(wěn)定的神經(jīng)降壓素前體片段(Proneurotensin1-117，astableneurotensinprecursorfragmentidentifiedinhumancirculation)，Peptides(27)，1787-1793(2006))。上述免疫檢測(cè)法在實(shí)施例2中有更詳細(xì)的概述。應(yīng)當(dāng)結(jié)合根據(jù)實(shí)施例2所使用的測(cè)試和校準(zhǔn)來(lái)看待所有的閾值和值。本領(lǐng)域技術(shù)人員可能知道，閾值的絕對(duì)值可能受到所使用的校準(zhǔn)的影響。這意味著，應(yīng)當(dāng)在本文(實(shí)施例2)所使用的校準(zhǔn)的背景下理解本文中給出的所有值和閾值。人P-NT校準(zhǔn)品可得自ICI-Diagnostics，Berlin，Germany?；蛘?，還可以用合成或重組的P-NT1-117或其片段對(duì)該檢測(cè)法進(jìn)行校準(zhǔn)(同樣參見Ernst等，2006)。根據(jù)本發(fā)明的方法，用于確定雌性對(duì)象中患上乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)或診斷雌性對(duì)象中的乳腺癌的閾值為高于78pmol/lPNT，優(yōu)選為100pmol/l，更優(yōu)選為150pmol/l。在具體實(shí)施方案中，所述閾值為約100pmol/l。這些閾值與上面提到的校準(zhǔn)方法相關(guān)。P-NT值超過(guò)所述閾值，意味著該對(duì)象患上癌癥的風(fēng)險(xiǎn)增加或者已患有癌癥。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法被執(zhí)行一次以上，以便監(jiān)測(cè)雌性對(duì)象中患上乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)或者以便監(jiān)測(cè)治療過(guò)程。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，執(zhí)行所述監(jiān)測(cè)以便評(píng)估所述雌性對(duì)象對(duì)所采取的預(yù)防性和/或治療性措施的響應(yīng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用所述方法以便將所述雌性對(duì)象分級(jí)成風(fēng)險(xiǎn)組。根據(jù)任何前述實(shí)施方案，本發(fā)明的主題也是用于預(yù)測(cè)雌性中患上癌癥的風(fēng)險(xiǎn)或鑒定患上癌癥的風(fēng)險(xiǎn)增加的雌性對(duì)象的方法，其中神經(jīng)降壓素原或其至少5個(gè)氨基酸的片段在從所述雌性對(duì)象獲得的體液中的水平被單獨(dú)或與其他有預(yù)測(cè)用途的實(shí)驗(yàn)室或臨床參數(shù)聯(lián)合用于預(yù)測(cè)對(duì)象發(fā)生不良事件的風(fēng)險(xiǎn)，這是通過(guò)選自以下備選方案的方法實(shí)現(xiàn)的：·與“健康”或“明顯健康”對(duì)象人群中全部預(yù)先確定的樣品中的神經(jīng)降壓素原或其至少5個(gè)氨基酸的片段在從所述雌性對(duì)象獲得的體液中的水平的中位數(shù)進(jìn)行比較，·與“健康”或“明顯健康”對(duì)象人群中全部預(yù)先確定的樣品中的神經(jīng)降壓素原或其至少5個(gè)氨基酸的片段在從所述雌性對(duì)象獲得的體液中的水平的四分位數(shù)進(jìn)行比較，·基于Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析進(jìn)行計(jì)算，或通過(guò)使用風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)計(jì)算例如NRI(凈重新分類指數(shù))或IDI(綜合鑒別指數(shù))進(jìn)行計(jì)算。本發(fā)明還包括用于執(zhí)行本發(fā)明的方法的裝置。因此，在該裝置中實(shí)施上文所述的檢測(cè)法。所述裝置是一種自動(dòng)裝置，該裝置使得能夠測(cè)定所施加的生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光，正如上文中為本發(fā)明的檢測(cè)法所描述的。優(yōu)選地，所述裝置使得能夠進(jìn)行報(bào)告基因檢測(cè)、ATP監(jiān)測(cè)、發(fā)光免疫檢測(cè)(LIA)、酶測(cè)定、和細(xì)胞發(fā)光/氧化爆發(fā)。因此，按照本發(fā)明，該裝置可被稱為多模式光度計(jì)。該裝置的特征還在于，優(yōu)選被置于試管中的一種或多種樣品能夠以鏈?zhǔn)綔y(cè)定一次或連續(xù)測(cè)定多次，甚至能夠在很長(zhǎng)的一段測(cè)試時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。此外，本發(fā)明的裝置的特征在于珀?duì)柼鋮s檢測(cè)器、容積可變的注射器、管室中的溫度控制、以及還有控制所述裝置的軟件單元，所述軟件優(yōu)選地是TubeMaster。這樣的裝置的一個(gè)實(shí)例是AutolumatLB953多管光度計(jì)(BertholdTechnologiesGmbH&Co.KG，BadWildbad，Germany)。本發(fā)明的主題也是用于執(zhí)行本發(fā)明的方法的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)測(cè)試(poin-of-care)裝置。在所述現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)測(cè)試裝置中實(shí)施如前所述的檢測(cè)法?，F(xiàn)場(chǎng)即時(shí)測(cè)試是通過(guò)使用可運(yùn)輸、便攜、且手持的儀器來(lái)完成的，所述儀器能夠執(zhí)行本發(fā)明的方法。因此，能夠在非常短的時(shí)間內(nèi)、在待檢查的對(duì)象所在位置處或附近進(jìn)行測(cè)定和各自的分析。本發(fā)明的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)測(cè)試裝置的特征在于免疫層析測(cè)量?jī)x，該測(cè)量?jī)x能夠檢測(cè)檢測(cè)法中所使用的結(jié)合物的至少一種可光學(xué)檢測(cè)的標(biāo)簽(標(biāo)記)。本發(fā)明還包括用于執(zhí)行本發(fā)明的方法的檢測(cè)法和/或試劑盒。檢測(cè)法如前所述，而用于執(zhí)行免疫檢測(cè)法的各自的試劑盒除了檢測(cè)法本身以外，還可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的慣用的輔助試劑例如緩沖液和洗滌液組成。在具體的實(shí)施方案中，除了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的慣用的輔助試劑例如緩沖液和洗滌液以外，用于執(zhí)行本發(fā)明的檢測(cè)法的試劑盒還可以由以下成分組成，特別是i)第一免疫試劑，其包括被固定在固相(優(yōu)選為試管壁)上的針對(duì)人神經(jīng)降壓素原的部分序列的第一種特異性的結(jié)合物，在特定的實(shí)施方案中，所述第一種結(jié)合物是針對(duì)序列SEQIDNO：1至SEQIDNO：10中的任一個(gè)，ii)第二免疫試劑，其包括溶解和標(biāo)記形式(優(yōu)選地，第二抗體是通過(guò)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的)的針對(duì)人神經(jīng)降壓素原的部分序列的第二種特異性的結(jié)合物，在特定的實(shí)施方案中，所述第二種結(jié)合物是針對(duì)SEQIDNO：1至SEQIDNO：10中的任一個(gè)，條件是第二種結(jié)合物靶向與第一種結(jié)合物的靶向序列不同的序列，和iii)標(biāo)準(zhǔn)和校準(zhǔn)溶液，其含有確定的量的肽制品，所述肽制品具有所述第一和第二特異性抗體的結(jié)合位點(diǎn)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，用于執(zhí)行前述檢測(cè)法的裝置或試劑盒可以提供基于所述檢測(cè)法的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)測(cè)試，以預(yù)測(cè)未患有癌癥的雌性對(duì)象中患上癌癥的風(fēng)險(xiǎn)或者診斷雌性對(duì)象中的癌癥。本發(fā)明的主題也是神經(jīng)降壓素或神經(jīng)降壓素受體的結(jié)合物，所述結(jié)合物可用于預(yù)防或治療雌性對(duì)象中的癌癥。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了神經(jīng)降壓素或神經(jīng)降壓素受體的結(jié)合物，所述結(jié)合物可用于制備用于預(yù)防或治療雌性對(duì)象中的癌癥的藥物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合物使神經(jīng)降壓素的生物活性降低至70％或更低。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥選自乳腺癌、肺癌、胰腺癌和結(jié)腸癌。根據(jù)本發(fā)明，神經(jīng)降壓素的結(jié)合物選自：抗體例如典型的全長(zhǎng)免疫球蛋白IgG、或包含至少重鏈和/或輕鏈的F可變結(jié)構(gòu)域的抗體片段例如化學(xué)偶聯(lián)的抗體(抗原結(jié)合片段)，包括但不限于Fab片段，包括Fab小型抗體、單鏈Fab抗體、帶有表位標(biāo)簽的單價(jià)Fab抗體例如Fab-V5Sx2；用CH3結(jié)構(gòu)域二聚化的雙價(jià)Fab(小型抗體)；雙價(jià)Fab或多價(jià)Fab，例如通過(guò)借助于異源結(jié)構(gòu)域多聚化而形成的，例如通過(guò)dHLX結(jié)構(gòu)域的二聚化而形成的，例如Fab-dHLX-FSx2；F(ab′)2片段，scFv片段，多聚化的多價(jià)或/和多特異性scFv片段，雙價(jià)和/或雙特異性雙抗體，(雙特異性T細(xì)胞橋聯(lián)抗體)，三官能抗體，多價(jià)抗體，例如來(lái)自與G不同的類型；單結(jié)構(gòu)域抗體，例如源自于駱駝或魚的免疫球蛋白的納米抗體。根據(jù)本發(fā)明，神經(jīng)降壓素受體的結(jié)合物選自：抗體例如典型的全長(zhǎng)免疫球蛋白IgG、或包含至少重鏈和/或輕鏈的F可變結(jié)構(gòu)域的抗體片段例如化學(xué)偶聯(lián)的抗體(抗原結(jié)合片段)，包括但不限于Fab片段，包括Fab小型抗體、單鏈Fab抗體、帶有表位標(biāo)簽的單價(jià)Fab抗體例如Fab-V5Sx2；用CH3結(jié)構(gòu)域二聚化的雙價(jià)Fab(小型抗體)；雙價(jià)Fab或多價(jià)Fab，例如通過(guò)借助于異源結(jié)構(gòu)域多聚化而形成的，例如通過(guò)dHLX結(jié)構(gòu)域的二聚化而形成的，例如Fab-dHLX-FSx2；F(ab′)2片段，scFv片段，多聚化的多價(jià)或/和多特異性scFv片段，雙價(jià)和/或雙特異性雙抗體，(雙特異性T細(xì)胞橋聯(lián)抗體)，三官能抗體，多價(jià)抗體，例如來(lái)自與G不同的類型；單結(jié)構(gòu)域抗體，例如源自于駱駝或魚的免疫球蛋白的納米抗體，或肽類拮抗劑例如[D-Trp11]-神經(jīng)降壓素、[Tyr(Me)11]-神經(jīng)降壓素(例如由Quiron等描述的)，或非肽類拮抗劑，例如左卡巴斯汀、SR-48692(NTS1選擇性)、SR-142948(非選擇性)、SR-142948A、CP96345、[3H]SR-48692、SR48692、SR-48527和SR-49711，或結(jié)合物骨架(scaffold)例如基于四連接素的非Ig骨架(例如US2010/0028995中所描述的)、纖連蛋白骨架(例如EP1266025中所描述的)、基于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的骨架(例如WO2011/154420中所描述的)、泛素骨架(例如WO2011/073214中所描述的)、轉(zhuǎn)移骨架(transferringscaffold)(例如US2004/0023334中所描述的)、蛋白A骨架(例如EP2231860中所描述的)、基于錨蛋白重復(fù)域的骨架(例如WO2010/060748中所描述的)、微量蛋白(microprotein)(優(yōu)選為形成半胱氨酸結(jié)的微量蛋白)骨架(例如EP2314308中所描述的)、基于FynSH3結(jié)構(gòu)域的骨架(例如WO2011/023685中所描述的)、基于EGFR-A結(jié)構(gòu)域的骨架(例如WO2005/040229中所描述的)和基于Kunitz結(jié)構(gòu)域的骨架(例如EP1941867中所描述的)。實(shí)施例實(shí)施例1抗體的制備用于免疫的肽/偶合物合成了用于免疫的肽(JPTTechnologies，Berlin，Germany)，所述肽具有額外的N端半胱氨酸殘基以將所述肽與牛血清白蛋白(BSA)偶合。通過(guò)使用Sulfo-SMCC(Perbio-science，Bonn，Germany)將所述肽與BSA共價(jià)偶聯(lián)。根據(jù)Perbio的手冊(cè)執(zhí)行偶聯(lián)步驟。標(biāo)記的抗體(LA)肽(P-NT1-19)：H-CSDSEEEMKALEADFLTNMH-NH2固相抗體(SPA)肽(P-NT44-62)：H-CNLNSPAEETGEVHEEELVA-NH2按照如下方法生成抗體：將BALB/c小鼠用100μg肽-BSA偶合物于第0天和第14天進(jìn)行免疫(被乳化在100μl完全弗氏佐劑中)，并用50μg于第21天和第28天進(jìn)行免疫(在100μl不完全弗氏佐劑中)。在執(zhí)行融合實(shí)驗(yàn)前3天，通過(guò)一次腹腔內(nèi)注射和一次靜脈內(nèi)注射給予，動(dòng)物接受50μg溶解在100μl鹽水中的偶合物。用1mL50％聚乙二醇將來(lái)自免疫后小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0的細(xì)胞在37℃下融合30秒。在洗滌后，將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。通過(guò)在HAT培養(yǎng)基(補(bǔ)充有20％胎牛血清和HAT補(bǔ)充物的RPMI1640培養(yǎng)基)中生長(zhǎng)來(lái)選擇出雜交克隆。在兩周之后，HAT培養(yǎng)基被替換成HT培養(yǎng)基用于傳代3次，然后返回到正常的細(xì)胞培養(yǎng)基中。在融合后3周時(shí)，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的抗原特異性IgG抗體進(jìn)行初次篩選。測(cè)試為陽(yáng)性的微量培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)移到24孔板中進(jìn)行增殖。在再次測(cè)試之后，用有限稀釋技術(shù)將所選擇的培養(yǎng)物克隆化和再克隆化，并確定亞型。(Lane，R.D.“用于提高分泌單克隆體的雜交瘤的生產(chǎn)的短時(shí)間聚乙二醇融合技術(shù)(Ashort-durationpolyethyleneglycolfusiontechniqueforincreasingproductionofmonoclonalantibody-secretinghybridomas)”，J.Immuμnol.Meth.81：223-228；(1985)；Ziegler，B.等“通過(guò)細(xì)胞熒光計(jì)和單克隆GAD抗體的補(bǔ)體依賴性抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)，不能在大鼠胰島細(xì)胞的表面上檢測(cè)到谷氨酸脫羧酶(GAD)(Glutamatedecarboxylse(GAD)isnotdetectableonthesurfaceofratisletcellsexaminedbycytofluorometryandcomplement-dependentantibody-mediatedcytotoxicityofmonoclonalGADantibodies)”，Horm.Metab.Res.28：11-15，(1996))。單克隆抗體的產(chǎn)生通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)抗體生產(chǎn)方法(Marx等，MonoclonalAntibodyProduction(1997)，ATLA25，121)產(chǎn)生抗體，并通過(guò)蛋白質(zhì)A-層析法進(jìn)行純化。根據(jù)SDS凝膠電泳分析，抗體的純度為＞95％。實(shí)施例2用于定量人神經(jīng)降壓素原的免疫檢測(cè)法使用的技術(shù)是基于吖啶酯標(biāo)記的夾心包被管發(fā)光免疫檢測(cè)法。標(biāo)記的復(fù)合物(示蹤劑)：將100μg(100μl)LA(1mg/ml溶于PBS，pH7.4)與10μl吖啶NHS酯(1mg/ml溶于乙腈，InVentGmbH，Germany)(EP0353971)混合并在室溫下孵育20分鐘。將標(biāo)記的LA在Bio-SilSEC400-5(Bio-RadLaboratories，Inc.，USA)上通過(guò)凝膠過(guò)濾HPLC進(jìn)行純化。純化的LA被稀釋在(300mmol/l磷酸鉀、100mmol/lNaCl、10mmol/lNa-EDTA、5g/l牛血清白蛋白，pH7.0)中。終濃度約為每200μl含800.000相對(duì)光單位(RLU)的標(biāo)記的復(fù)合物(約20ng標(biāo)記的抗體)。用AutoLumatLB953(BertholdTechnologiesGmbH&Co.KG)測(cè)定吖啶酯化學(xué)發(fā)光。固相：用SPA(1.5μgSPA/0.3ml100mmol/lNaCl、50mmol/lTris-HCl，pH7.8)包被聚苯乙烯管(GreinerBio-OneInternationalAG，Austria)(室溫下18小時(shí))。在用5％牛血清白蛋白封閉之后，將所述管用pH7.4的PBS洗滌并真空干燥。校準(zhǔn)：用含P-NT的人血清稀釋液對(duì)檢測(cè)法進(jìn)行校準(zhǔn)。將所集中的具有高P-NT免疫反應(yīng)性的人血清(InVentDiagostika，Henningsdorf，Germany)用馬血清(BiochromAG，Deutschland)進(jìn)行稀釋(檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品)。用人神經(jīng)降壓素原校準(zhǔn)品(ICI-Diagnostics，Berlin，Germany)對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校準(zhǔn)?；蛘撸梢杂煤铣苫蛑亟M的p-NT1-117或其片段對(duì)該檢測(cè)法進(jìn)行校準(zhǔn)(同樣參見Ernst等，2006)。神經(jīng)降壓素原的免疫檢測(cè)法：用移液器將50μl樣品(或校準(zhǔn)品)吸到SPA包被的管中，在加入標(biāo)記的LA(200μl)之后，將所述管在18-25℃下孵育16-22小時(shí)。通過(guò)用洗滌液(20mmol/lPBS，pH7.4，0.1％TritonX-100)洗滌5次(每次1ml)以去除未結(jié)合的示蹤劑。用LB953測(cè)定管結(jié)合的LA。圖1示出了典型的P-NT劑量/信號(hào)曲線。實(shí)施例3群體研究方法我們測(cè)定了來(lái)自2559名女性參與者的空腹血漿中的P-NT，這些參與者屬于于1991-1994年接受馬爾默飲食與癌癥研究的基線檢查的人群(平均年齡58±6歲，女性占59％)。我們用多變量調(diào)整(所有傳統(tǒng)的心血管危險(xiǎn)因素，糖尿病危險(xiǎn)因素，并且在癌癥分析中還有癌癥的遺傳性)后的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型來(lái)將基線P-NT(與log轉(zhuǎn)換后的P-NT每增加一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)比率)與發(fā)生每個(gè)研究終點(diǎn)的第一次事件的時(shí)間相關(guān)聯(lián)，中位隨訪時(shí)間超過(guò)12年。終點(diǎn)是通過(guò)瑞典國(guó)家醫(yī)院出院登記處、瑞典心肌梗死登記處、馬爾默卒中登記處和瑞典癌癥登記處檢索到的。通過(guò)這些登記處檢索到的終點(diǎn)是經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的并發(fā)現(xiàn)是準(zhǔn)確的(同樣參見Belting等，CancerEpidemiolBiomarkersPrev；1-10._2012AACR))。研究中女性的臨床特征描述性統(tǒng)計(jì)表1表2問(wèn)卷+日記記錄：根據(jù)問(wèn)卷或日記記錄本得到的基線時(shí)的抗高血壓治療(C02、C03、C07、C08、C09)表3糖尿病(空腹血糖＞6.0或者問(wèn)卷調(diào)查后為糖尿病)表4目前為吸煙者表5女性中PNT的四分位數(shù)：PNT(pmol/1)在示出的所有亞組分析中，四分位數(shù)濃度幾乎相同。P-NT與乳腺癌的預(yù)測(cè)我們?cè)u(píng)估了P-NT與乳腺癌之間的關(guān)系(表6)。在女性中，P-NT與乳腺癌之間存在著強(qiáng)的聯(lián)系。在全面調(diào)整后的模型中，P-NT每增加一個(gè)SD就伴隨著未來(lái)乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加35％，并且P-NT的頂部與底部四分位數(shù)鑒定到了在乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)方面超過(guò)2倍的差異(參見表6和表7)。表6用于基線P-NT與乳腺癌的發(fā)生率的多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型表7乳腺癌-女性(排除了具有任何癌癥史的女性，2140名女性/135次事件)圖2：KaplanMeier圖，示出了在a)低于和高于P-NT中位數(shù)(109pmol/l)以及b)四分位數(shù)(Q)1與四分位數(shù)4(低于79pmol/l和高于150pmol/l)的女性中診斷的累積的乳腺癌。圖2a和2b的說(shuō)明：P-NT增加表示乳腺癌發(fā)展的長(zhǎng)期風(fēng)險(xiǎn)增加。由于排除了任何在基線當(dāng)天(采血)具有癌癥史的女性，因此，PNT高度預(yù)示著未來(lái)乳腺癌的發(fā)展?？傮w而言，來(lái)自Q4的女性發(fā)展乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)比來(lái)自Q1的女性高2倍。在基線時(shí)有和沒(méi)有糖尿病/高血壓的女性中的亞組分析糖尿病的定義：在基線檢查時(shí)具有物理診斷史、或在服用抗糖尿病藥物、或空腹全血血糖＞/＝6.1mmol/l(注意，這相當(dāng)于血漿中的7.0mmol/l)。血壓正常/高血壓(HBP)的定義：HBP：收縮壓＞/＝140mmHg或舒張壓＞/＝90mmHg或在服用抗高血壓藥物。正常血壓：所有其他對(duì)象。在方程中使用相同的變量，我們研究了用于預(yù)測(cè)癌癥的不同的女性亞組(排除了具有任何癌癥史的女性)：表8。表8在所有亞組中，P-NT顯著地預(yù)示著乳腺癌的發(fā)展。在更健康的女性中，P-NT的預(yù)測(cè)能力略強(qiáng)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3