專利名稱：一種稻瘟病菌的病原相關(guān)分子模式的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種真菌的病原相關(guān)分子模式，具體涉及一種稻瘟病菌的病原相關(guān)分子模式，屬于植物保護和生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物自身的先天免疫機制能有效抵御致病微生物的入侵。當(dāng)感病植物受到病原菌特異小種侵染時，植物自身的免疫機制不能被激活，最終導(dǎo)致病害發(fā)生。植物通常通過兩套防御機制抵御病原微生物入侵，第一套是通用機制，第二套是抵御病原菌特異小種的機制。植物通用防御機制是病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMPs)激發(fā)的免疫機制，即PTI(PAMP-triggered immunity)。PTI是通過寄主胞外表面受體識別病原相關(guān)分子模式而激活。已報道的植物病原真菌中的病原相關(guān)分子模式主要有木聚糖酶(xylan ase)、轉(zhuǎn)化酶(invertase)、β -葡聚糖(β-glucans)、幾丁質(zhì)(chitin)和麥角固醇(ergosterol)，其中只有水稻識別β-葡聚糖。由此可見，植物病原真菌，特別是寄主為水稻的真菌病原相關(guān)分子模式目前還少有鑒定到。研究真菌病原相關(guān)分子模式有助于了解寄主與病原互作早期的免疫機制，以達到開發(fā)生物制劑進行植物病害生物防治的目的。植物對病原相關(guān)分子模式的識別可引發(fā)寄主一系列的生理反應(yīng)，諸如①H+、K+、Cl+和Ca2+離子流的產(chǎn)生，其中Ca2+離子流增加是植物免疫反應(yīng)關(guān)鍵的一步；②活性氧爆發(fā)；③從絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)到防御相關(guān)基因表達，MAPKs參與了植物防御反應(yīng)。在PTI過程中，MAPK聯(lián)級的激活使得WRKY型的轉(zhuǎn)錄因子表達，而這類轉(zhuǎn)錄因子是植物防御反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子；④胼胝質(zhì)產(chǎn)生，細胞壁與細胞膜間沉積的胼胝質(zhì)是PTI響應(yīng)時的一個典型標志；⑤荷爾蒙，SA、JA和ET是防御反應(yīng)過程中比較典型的植物荷爾蒙。⑥氣孔關(guān)閉；⑦基因沉默。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種全新的稻瘟病菌病原相關(guān)分子模式。
本發(fā)明的技術(shù)方案是:保持現(xiàn)有病原菌病原相關(guān)分子模式鑒定方法不變，包括胼胝質(zhì)沉積、活性氧爆發(fā) 、防御相關(guān)基因表達譜分析等方法均與常規(guī)相同，其特征是通過一系列的實驗證明了該基因具有病原相關(guān)分子模式的特性，即該基因是稻瘟病菌病原相關(guān)分子模式(PAMPs)。
進一步，該基因是稻瘟病菌病原相關(guān)分子模式PAMPs驗證方法為:
(I)根據(jù)MgNIP53的核酸序列設(shè)計PCR特異性引物，PCR分析MgNIP53基因在稻瘟病菌基因組中的保守性，結(jié)果表明，MgNIP53存在于大多數(shù)稻瘟病菌株中，非常保守；
(2)5.0mg/ml的融合蛋白處理水稻根組織24h,苯胺藍染色30min后置于突光顯微鏡下觀察胼胝質(zhì)產(chǎn)生；以磷酸緩沖液PBS處理水稻根組織24h作為對照。結(jié)果表明，融合蛋白處理的水稻根組織產(chǎn)生大量的胼胝質(zhì)，而對照根組織產(chǎn)生少量的胼胝質(zhì)；
(3) 5.0mg/ml的融合蛋白處理水稻根組織24h，DAB染色30min后置于顯微鏡下觀察胼胝質(zhì)產(chǎn)生；以磷酸緩沖液PBS處理水稻根組織24h作為對照；結(jié)果表明，融合蛋白處理的水稻根組織產(chǎn)生大量的活性氧，而對照對照根組織產(chǎn)生少量的胼胝質(zhì)；
(4)利用real-time PCR檢測到了 MgNIP53能誘導(dǎo)水稻根組織SA途徑、JA/Et途徑和WRKY型轉(zhuǎn)錄因子表達；
通過以上實驗，證實了 MgNIP53為稻瘟病菌病原相關(guān)分子模式。
本發(fā)明的有益效果在于:
通過一系列方法鑒定到了一個稻瘟病菌病原相關(guān)分子模式。該病原相關(guān)分子模式可為今后開發(fā)生物制劑進行有效生物防治稻瘟病提供有力參考。
具體實施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
病原相關(guān)分子模式的原核表達產(chǎn)物處理水稻根組織24h，苯胺藍染色后直接觀察胼胝質(zhì)形成情況以及通過DAB染色后進行活性氧觀察，同時提取根組織總RNA，利用real-time PCR分析SA途徑基因、JA/Et途徑基因和WRKY型轉(zhuǎn)錄因子的表達。結(jié)果表明，原核表達產(chǎn)物處理水稻根組織后形成了胼胝質(zhì)以及產(chǎn)生了活性氧，real-time PCR檢測到SA途徑基因、JA/Et途徑基因和WRKY型轉(zhuǎn)錄因子表達。因此，該稻瘟病菌基因是病原相關(guān)分子模式。
該基因是稻瘟病菌病原相關(guān)分子模式PAMPs驗證方法為:
(I)根據(jù)MgNIP53的核酸序列設(shè)計PCR特異性引物，PCR分析MgNIP53基因在稻瘟病菌基因組中的保守性，結(jié)果表明，MgNIP53存在于大多數(shù)稻瘟病菌株中，非常保守；
(2)5.0mg/ml的融合蛋白處理水稻根組織24h,苯胺藍染色30min后置于突光顯微鏡下觀察胼胝質(zhì)產(chǎn)生；以磷酸緩沖液PBS處理水稻根組織24h作為對照。結(jié)果表明，融合蛋白處理的水稻根組織產(chǎn)生大量的胼胝質(zhì)，而對照根組織產(chǎn)生少量的胼胝質(zhì)；
(3) 5.0mg/ml的融合蛋白處理水稻根組織24h，DAB染色30min后置于顯微鏡下觀察胼胝質(zhì)產(chǎn)生；以磷酸緩沖液PBS處理水稻根組織24h作為對照；結(jié)果表明，融合蛋白處理的水稻根組織產(chǎn)生大量的活性氧，而對照對照根組織產(chǎn)生少量的胼胝質(zhì)；
(4)利用real-tim e PCR檢測到了 MgNIP53能誘導(dǎo)水稻根組織SA途徑、JA/Et途徑和WRKY型轉(zhuǎn)錄因子表達；
通過以上實驗，證實了 MgNIP53為稻瘟病菌病原相關(guān)分子模式。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種稻瘟病菌的病原基因，其特征在于，該基因為MgNIP53，是稻瘟病菌病原相關(guān)分子模式PAMPs，能誘導(dǎo)植物活性氧產(chǎn)生，胼胝質(zhì)產(chǎn)生、SA途徑相關(guān)基因、JA/Et途徑相關(guān)基因和WRKY型轉(zhuǎn)錄因子有有表達。
2.如權(quán)利要求1所述的稻瘟病菌的病原基因，其特征在于，該基因是稻瘟病菌病原相關(guān)分子模式PAMPs驗證方法為: (1)根據(jù)MgNIP53的核酸序列設(shè)計PCR特異性引物，PCR分析MgNIP53基因在稻瘟病菌基因組中的保守性，結(jié)果表明，MgNIP53存在于大多數(shù)稻瘟病菌株中，非常保守； (2)5.0mg/ml的融合蛋白處理水稻根組織24h,苯胺藍染色30min后置于突光顯微鏡下觀察胼胝質(zhì)產(chǎn)生；以磷酸緩沖液PBS處理水稻根組織24h作為對照。結(jié)果表明，融合蛋白處理的水稻根組織產(chǎn)生大量的胼胝質(zhì)，而對照根組織產(chǎn)生少量的胼胝質(zhì)； (3)5.0mg/ml的融合蛋白處理水稻根組織24h，DAB染色30min后置于顯微鏡下觀察胼胝質(zhì)產(chǎn)生；以磷酸緩沖液PBS處理水稻根組織24h作為對照；結(jié)果表明，融合蛋白處理的水稻根組織產(chǎn)生大量的活性氧，而對照對照根組織產(chǎn)生少量的胼胝質(zhì)； (4)利用real-timePCR檢測到了 MgNIP53能誘導(dǎo)水稻根組織SA途徑、JA/Et途徑和WRKY型轉(zhuǎn)錄因子表達； 通過以上實驗，證實了 MgNIP5 3為稻瘟病菌病原相關(guān)分子模式。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種稻瘟病菌的病原基因，保持現(xiàn)有病原菌病原相關(guān)分子模式鑒定方法不變，包括胼胝質(zhì)沉積、活性氧爆發(fā)、防御相關(guān)基因表達譜分析等方法均與常規(guī)相同，其特征是通過一系列的實驗證明了該基因具有病原相關(guān)分子模式的特性，即該基因是稻瘟病菌病原相關(guān)分子模式(PAMPs)。通過一系列方法鑒定到了一個稻瘟病菌病原相關(guān)分子模式。該病原相關(guān)分子模式可為今后開發(fā)生物制劑進行有效生物防治稻瘟病提供有力參考。
文檔編號G01N1/30GK103160518SQ20121056793
公開日2013年6月19日 申請日期2012年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月16日
發(fā)明者楊靜, 李成云, 劉林, 朱有勇, 徐暢, 施竹鳳 申請人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)