專利名稱：一種香椿葉中沒食子酸及其甲酯的同時制備及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用高效液相色譜技術(shù)對香椿葉中兩種抗氧化活性物質(zhì)沒食子酸和沒食子酸甲酯進行同時制備以及定量檢測，屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
棟科喬木香椿(7bo/ a sinensis A. Juss. Roemer)廣泛分布于整個亞洲,尤其在中國和印度地區(qū)普遍栽培，春季采收的新鮮嫩葉(Chinese Toon)是當?shù)孛癖娮钕矚g的時令蔬菜之一。此外,香椿葉(Toonea Sinensis Folium)為該植物的干燥樹葉,是一味具有解毒和消炎功效的中藥，臨床中主要被用于治療口臭、嘔吐、痢疾、食欲不振、腸炎和瘙癢等病癥，到目前為止在使用中尚未 觀察到任何副作用。一方面，因為抗氧化劑可有效地減輕氧化應(yīng)激；另一方面，盡管合成抗氧化劑在很長時間內(nèi)已廣泛用于食品、藥品或化妝品，但是其安全性存疑，引起人們的普遍焦慮；因此，近年來植物源性抗氧化劑逐漸成為科學(xué)家研究的重點。目前，對香椿葉中活性物質(zhì)基礎(chǔ)的提取分離主要為某類化合物的總體。例如，中國專利200510069895. 5中，以60%乙醇于60°C下提取2次，每次提取60分鐘，經(jīng)過過濾、濃縮和干燥，最終可分別同時得到90%提取率的總黃酮與總皂甙；中國專利200810073836. 9、201010263595.1中，分別采用雙水相體系、表面活性劑輔助等方法富集香椿葉中的總黃酮；中國專利200710058385. 7中，利用60%乙醇提取、AB-8大孔吸附樹脂獲取具有抗氧化活性的提取物。另外，2007年 Ka1-Jin Wang 等(Food Chemistry, Vol. 101, P365 371)以80%丙酮冷浸提取，粗提物依次用乙醚、乙酸乙酯分別萃取，然后結(jié)合使用Diaion HP20SS、Sephadex LH-20、MC1-gel CHP20P和Chromatorex ODS四種填料經(jīng)過反復(fù)柱層析從乙酸乙酯萃取部位中分離得到了沒食子酸、沒食子酸甲酯，并且用1，1- 二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除實驗證明了兩者均具有突出的抗氧化活性；2009年Ka-Wing Cheng等(Journal of Functional Foods, Vol. 1，P253 259)以 70% 甲醇超聲提取，將氯仿萃取后的萃余物用反相鍵合C18、Sephadex LH_20、Polyamide-6、正相娃膠為填料或采用半制備高效液相色譜進行分離，獲得了沒食子酸、沒食子酸甲酯；但是，該些方法均使用了價格高昂的S^hadex LH-20為填料，且分離中涉及使用多種分離材料進行反復(fù)柱層析，至少經(jīng)過三次柱色譜分離，步驟繁瑣，時間和試劑消耗大；而使用半制備高效液相色譜法時，處理量較小，并且這兩種活性化合物在進行初步分離時分散于不同的流分，導(dǎo)致后續(xù)實驗中不能對兩者進行同時制備。在檢測方面，2002年張仲平等(中國野生植物資源，Vol. 2 (14)，P52 53)、2011年Ying Yang等(Food Chemistry, Vol. 128, P831 838)僅對香椿葉中的沒食子酸進行了定性檢識。2006 年 Ming-Mu Hsieh 等(Journal of the Chinese Chemical Society, Vol.53，P1203 1208)利用膠束電動毛細管電泳對沒食子酸、沒食子酸甲酯等多酚類成分進行定量分析，但是兩者與其它成分未實現(xiàn)基線分離(R〈l. 5)，且并未對準確性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性等重要技術(shù)指標進行考察，可靠性差；除此之外，由于可調(diào)節(jié)參數(shù)較少、應(yīng)用范圍較窄等原因，在醫(yī)藥化工行業(yè)的生產(chǎn)實踐中，毛細管電泳的普及程度遠不如高效液相色譜，造成實際應(yīng)用困難?，F(xiàn)代高效液相色譜技術(shù)按照應(yīng)用目的，可分為制備型和分析型兩種，均具有速度快、產(chǎn)物純度與回收率高、分離填料可反復(fù)利用等特點，是目前對中藥及食品中活性化合物進行分離與分析的最為常用的技術(shù)手段。到目前為止，基于該技術(shù)對這兩種抗氧化活性物質(zhì)在香椿葉藥材中的同時制備方法及相應(yīng)的定量分析方法尚未加以研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)不能對沒食子酸及其甲酯進行同時制備、操作繁瑣、代價高昂、分析的可靠性差、應(yīng)用困難等不足，提供一種基于高效液相色譜技術(shù)從香椿葉中同時制備兩種植物源性抗氧化劑沒食子酸和沒食子酸甲酯，并測定香椿葉藥材中這兩種成分含量的方法。本發(fā)明通過以下步驟達到同時制備沒食子酸和沒食子酸甲酯的目的
一種香椿葉中沒食子酸及其甲酯的同時制備方法，按照下述步驟進行
1)新鮮采摘的香椿葉置于通風(fēng)處陰干，粉碎，得細粉，加入5 7倍量(g/mL)85 95%(κ/κ)乙醇，超聲提取，每次I 1. 5小時，提取2 3次，合并提取液，50°C以下減壓回收溶劑，得浸膏；`
2)浸膏中加入6倍量(g/mL)水混懸，以等量水飽和正丁醇萃取3次，合并萃取液，減壓回收溶劑，得正丁醇萃取物；
3)正丁醇萃取物干法上樣載入硅膠柱進行分離，萃取物與硅膠質(zhì)量比例為1:50 70;以二氯甲燒-甲醇-7jC-甲酸體積比例為100:10:1:0. 3 100:15:3:3的混合溶液為洗脫齊U，進行等度洗脫；以硅膠質(zhì)量流分體積為1:1 1. 5 (g/mL)收集一份流出液，收集第5 8份流分，合并，減壓回收溶劑，得初步純化物；
3)將初步純化物甲醇以比例為1:30 50 (g/mL)進行溶解，溶液載入制備型高效液相色譜儀進行分離，分別收集6min 9min和9min 12min兩個流份；將流份分別于50°C以下減壓濃縮至干，得白色固體I和白色固體II，經(jīng)過核磁共振氫譜和碳譜分析，并與文獻數(shù)據(jù)進行對照，確認白色固體I為沒食子酸，白色固體II為沒食子酸甲酯。其中步驟3)中的色譜條件為流動相為甲醇-O. 1% O. 2%三氟乙酸水溶液(IyV)體積比例為5% 15%: 95% 85%等度洗脫；進樣量為4 5mL ;流速為20 30mL/min ;色譜柱填料為5 μ m的C8或C18反相鍵合娃膠；色譜柱尺寸為內(nèi)徑15mm 30mm、長度150mm 250mm ;紫外檢測波長為270nm。一種香椿葉中沒食子酸及其甲酯的同時檢測方法，按照下述步驟進行
(I)對照品溶液制備(內(nèi)標法)
將沒食子酸沒食子酸甲酯甲醇以比例為1:1:2.5 (mg/mg/mL)溶解得對照品母液；以沒食子酸乙酯為內(nèi)標物，按比例為1:2 (mg/mL)溶于甲醇，得內(nèi)標物母液；取適量對照品母液和內(nèi)標物母液混合，加入甲醇將對照品母液稀釋至原濃度的1/2、1/5、1/10、1/20、1/50和1/100，將內(nèi)標物母液稀釋至原濃度的1/20，得不同濃度的6份混合對照品工作溶液 ’另將內(nèi)標物母液用甲醇稀釋到原濃度的1/20，得到含內(nèi)標物的甲醇溶液。所述的沒食子酸、沒食子酸甲酯和沒食子酸乙酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子量如下所示
權(quán)利要求
1.一種香椿葉中沒食子酸及其甲酯的同時制備方法，其特征在于按照下述步驟進行 1)新鮮采摘的香椿葉置于通風(fēng)處陰干，粉碎，得細粉，加入5 7倍量(g/mL)85 95%(κ/κ)乙醇，超聲提取，每次I 1. 5小時，提取2 3次，合并提取液，50°C以下減壓回收溶劑，得浸膏； 2)浸膏中加入6倍量(g/mL)水混懸，以等量水飽和正丁醇萃取3次，合并萃取液，減壓回收溶劑，得正丁醇萃取物； 3)正丁醇萃取物干法上樣載入硅膠柱進行分離，萃取物與硅膠質(zhì)量比例為1:50 70;以二氯甲燒-甲醇-7jC-甲酸體積比例為100:10:1:0. 3 100:15:3:3的混合溶液為洗脫齊U，進行等度洗脫；以硅膠質(zhì)量流分體積為1:1 1. 5 (g/mL)收集一份流出液，收集第5 8份流分，合并，減壓回收溶劑，得初步純化物； 3)將初步純化物甲醇以比例為1:30 50 (g/mL)進行溶解，溶液載入制備型高效液相色譜儀進行分離，分別收集6min 9min和9min 12min兩個流份；將流份分別于50°C以下減壓濃縮至干，得白色固體I和白色固體II，經(jīng)過核磁共振氫譜和碳譜分析，并與文獻數(shù)據(jù)進行對照，確認白色固體I為沒食子酸，白色固體II為沒食子酸甲酯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種香椿葉中沒食子酸及其甲酯的同時制備方法，其特征在于其中步驟3)中的色譜條件為流動相為甲醇-O. 1% O. 2%三氟乙酸水溶液(IyV)體積比例為5% 15%: 95% 85%等度洗脫；進樣量為4 5mL ;流速為20 30mL/min ;色譜柱填料為5 μ m的C8或C18反相鍵合娃膠；色譜柱尺寸為內(nèi)徑15mm 30mm、長度150mm 250mm ；紫外檢測波長為270nm。
3.一種香椿葉中沒食子酸及其甲酯的同時檢測方法，其特征在于按照下述步驟進行 (1)對照品溶液制備 將沒食子酸沒食子酸甲酯甲醇以比例為1:1:2.5 (mg/mg/mL)溶解得對照品母液；以沒食子酸乙酯為內(nèi)標物，按比例為1:2 (mg/mL)溶于甲醇，得內(nèi)標物母液；取適量對照品母液和內(nèi)標物母液混合，加入甲醇將對照品母液稀釋至原濃度的1/2、1/5、1/10、1/20、1/50和1/100，將內(nèi)標物母液稀釋至原濃度的1/20，得不同濃度的6份混合對照品工作溶液；另將內(nèi)標物母液用甲醇稀釋到原濃度的1/20，得到含內(nèi)標物的甲醇溶液；所述的沒食子酸、沒食子酸甲酯和沒食子酸乙酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子量如下所示
全文摘要
本發(fā)明一種香椿葉中沒食子酸及其甲酯的同時制備及檢測方法，屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域。采用的制備方法通過提取、萃取和兩次柱色譜即可從中藥香椿葉中同時獲得沒食子酸和沒食子酸甲酯，避免使用多種柱色譜填料和反復(fù)柱層析，操作簡便，時間和試劑消耗低；采用的檢測方法利用實驗室常備的高效液相色譜儀，分離度、準確性、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性等各種方法學(xué)指標均符合含量測定的要求，可靠性高，可用于分析不同來源、批次的香椿葉藥材中沒食子酸和沒食子酸甲酯的含量，能滿足藥理活性測試以及對該中藥進行常規(guī)質(zhì)量控制的需要。
文檔編號G01N30/06GK103058859SQ201210513809
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月4日
發(fā)明者楊歡, 劉丹, 沈玉萍, 余筱潔, 周存山, 夏國華, 江曉萍 申請人:江蘇大學(xué)