專(zhuān)利名稱(chēng)：一種化學(xué)發(fā)光傳感器及采用該傳感器檢測(cè)葡萄糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種化學(xué)發(fā)光傳感器及采用該傳感器檢測(cè)葡萄糖的方法。可應(yīng)用于臨床中葡萄糖的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
化學(xué)發(fā)光(chemi luminescence, CL)是指某些化學(xué)反應(yīng)發(fā)射光的現(xiàn)象,通常為氧化還原反應(yīng)。化學(xué)發(fā)光分析法因其不需要外來(lái)的激發(fā)光源，因此不存在背景干擾，使其具有很高的靈敏度，檢出限可達(dá)10_21-10_12mol。并且該法線性范圍寬(3-6個(gè)數(shù)量級(jí))，儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、廉價(jià)、易自動(dòng)化，成為分析化學(xué)中一個(gè)十分活躍的研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，由于化學(xué)發(fā)光傳感器在一定程度上能提高催化劑的穩(wěn)定性和催化活性、并且其操作簡(jiǎn)便、儀器簡(jiǎn)單、環(huán)境友好、低耗等優(yōu)點(diǎn)引起了人們的廣泛關(guān)注。 葡萄糖的定量分析在臨床醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)、食品科學(xué)等領(lǐng)域有極其重要的作用。目前的測(cè)定方法主要有分光光度計(jì)、電流測(cè)定法、高效液相色譜法及毛細(xì)管電泳法。但是，這些方法通常需要復(fù)雜的前處理過(guò)程，分析速度慢，并且儀器設(shè)備成本較高，不利于推廣。與之相比，化學(xué)發(fā)光法具有檢測(cè)速度快、選擇性好、體積小、易操作，儀器簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)葡萄糖是利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫在催化劑存在的條件下能夠氧化魯米諾產(chǎn)生發(fā)光，其發(fā)光強(qiáng)度與過(guò)氧化氫的濃度成正比例關(guān)系，基于此反應(yīng)對(duì)葡萄糖濃度進(jìn)行定量檢測(cè)。隨著技術(shù)的發(fā)展，化學(xué)發(fā)光生物傳感器逐漸地應(yīng)用于葡萄糖的測(cè)定。Lan等人[Biosens. Bioelectron. , 2008, 24, 934-938]將金納米及辣根過(guò)氧化物酶固定在二氧化娃凝膠上，通過(guò)流動(dòng)魯米諾測(cè)定人血清中的葡萄糖。Li等人[Anal.Biochem.，2008, 374，64-90]通過(guò)戊二醛將葡萄糖酶和辣根過(guò)氧化物酶固定在蛋殼上，并測(cè)定人血清中的葡萄糖。該方法雖有突出的優(yōu)點(diǎn)，但僅能固定化學(xué)發(fā)光試劑或是催化劑，這樣即浪費(fèi)了資源，也造成了一定的環(huán)境危害[Anal. Chem.，2002，74，1269-1274; Anal.Chem.，2008，374，64-70]。目前，同時(shí)將葡萄糖氧化酶，化學(xué)發(fā)光試劑(魯米諾)和催化劑同時(shí)固定在一起還鮮有報(bào)道。并且存在著檢測(cè)范圍較小，響應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)、抗干擾能力較弱及壽命較短等問(wèn)題。其主要原因是葡萄糖氧化酶的反應(yīng)基質(zhì)是弱酸性或中性條件，而魯米諾的最佳化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的基質(zhì)為堿性溶液[Anal. Chem.，2012，84(5) :2410-2415]。由于二者的反應(yīng)pH值不同，如果保證了葡萄糖氧化酶的活性就確保不了魯米諾的使用，保證了魯米諾的條件，酶的活性就大大地降低，因此無(wú)法將二者固定在同一根柱子上。拓寬魯米諾的PH值的使用范圍，提高傳感器的檢測(cè)范圍和靈敏度是亟待解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種化學(xué)發(fā)光傳感器及采用該傳感器檢測(cè)葡萄糖的方法。通過(guò)將葡萄糖氧化酶、化學(xué)發(fā)光試劑(魯米諾)和催化劑(鎂鋁碳酸根水滑石)同時(shí)固定，拓寬魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)條件，使其從傳統(tǒng)的堿性基質(zhì)擴(kuò)充至弱酸性的基質(zhì)中，并保證化學(xué)發(fā)光傳感器的靈敏度及使用壽命。并兼具操作簡(jiǎn)單，成本低，線性范圍寬等特點(diǎn)。本發(fā)明提供的一種化學(xué)發(fā)光傳感器，采用由二氧化硅凝膠和殼聚糖組成的交聯(lián)劑交聯(lián)固定葡萄糖氧化酶、辣根過(guò)氧化物酶和吸附了魯米諾的鎂鋁碳酸根水滑石，將得到的混合物填充于石英管內(nèi)，石英管兩端填充玻璃棉，構(gòu)成化學(xué)發(fā)光傳感器；其中化學(xué)發(fā)光傳感器具體制備方法如下A :將鎂鋁碳酸根水滑石([Mgl_xAlx (OH) 2]x+ (CO3) x/2 · yH20,0. 17 ^ x ^ O. 34, y為結(jié)晶水的數(shù)量)浸入濃度為IX 10_4-1X 10_2mol/L魯米諾水溶液中，混合，充分吸附，經(jīng)過(guò)濾，常溫干燥得到黃綠色的產(chǎn)物，產(chǎn)物中鎂鋁碳酸根水滑石與魯米諾的質(zhì)量比為(100-600):1 ；B :將正硅酸乙酯、純凈水、濃度為O. 1-0. 5mol/L的鹽酸混合，三者的體積比依次為(2-4) : (O. 5-1. 5) : (O. 01-0. 05)，充分?jǐn)嚢?，得到澄清的二氧化硅凝膠溶液；然后 加入質(zhì)量濃度為O. 5-3%的殼聚糖溶液、體積比(1-2) : I的乙醇水溶液，二氧化硅凝膠、殼聚糖溶液及乙醇水溶液的體積比為(1-4) : I: (1-2)，混合，充分?jǐn)嚢?，得到殼聚糖二氧化硅?fù)合凝膠；再加入質(zhì)量比為(1-3):(1-2)的葡萄糖氧化酶與辣根過(guò)氧化物酶的混合酶和步驟A制備的吸附魯米諾的鎂鋁碳酸根水滑石，充分?jǐn)嚢?，混合均勻，其中殼聚? 二氧化硅復(fù)合凝膠、混合酶及吸附魯米諾的水滑石的質(zhì)量比為(3-7) : (O. 05-0. 2) : (O. 05-0. 3)，將得到白色糊狀物填充至石英管中。本發(fā)明還提供了一種采用上述傳感器檢測(cè)葡萄糖的方法，將上述化學(xué)發(fā)光傳感器與流動(dòng)注射分析結(jié)合，實(shí)現(xiàn)葡萄糖的檢測(cè)；化學(xué)發(fā)光流動(dòng)檢測(cè)體系由蠕動(dòng)泵、六通閥、超微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x(BPCL)及管路構(gòu)成，以純凈水為載液，將葡萄糖樣品溶液注入到六通閥中，通過(guò)蠕動(dòng)泵載入至傳感器中，產(chǎn)生發(fā)光，由超微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度并采集數(shù)據(jù)。其中載液的流速優(yōu)選為2. OmL/min。注入傳感器中的葡萄糖樣品溶液在葡萄糖氧化酶的作用下生成過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫與吸附著魯米諾的水滑石反應(yīng)，產(chǎn)生發(fā)光，通過(guò)BPCL檢測(cè)得到的發(fā)光強(qiáng)度，以此推算出樣品中葡萄糖的含量。本發(fā)明適用于測(cè)定葡萄糖濃度大于5Xl(Tm0l/L的樣品，如動(dòng)物和人體的血樣、
尿樣等。本發(fā)明的效果采用本發(fā)明制備的化學(xué)發(fā)光傳感器，可有效拓寬魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)條件，使其從傳統(tǒng)的堿性基質(zhì)擴(kuò)充至弱酸性的基質(zhì)中，同時(shí)保證化學(xué)發(fā)光傳感器的靈敏度及使用壽命。該化學(xué)發(fā)光傳感器操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速，有效降低了發(fā)光試劑和催化劑的浪費(fèi)，使成本得到大大地降低，可廣泛應(yīng)用于環(huán)境、生物及免疫分析中。


圖I:實(shí)施例2的葡萄糖溶液化學(xué)發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)曲線圖2 :實(shí)施例I的葡萄糖化學(xué)發(fā)光傳感器的緩沖能力測(cè)試結(jié)果圖3 :實(shí)施例I的葡萄糖化學(xué)發(fā)光傳感器的穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。實(shí)施例I化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法A :稱(chēng)取O. 03mol的硝酸鎂與O. 015mol的硝酸鋁，混合，加入60mL純凈水，配制成鹽液；稱(chēng)取O. 0075mol的碳酸鈉與O. 12mol的氫氧化鈉，混合，加入60mL純凈水，配制成堿液。將上述兩溶液逐滴滴入四口瓶中，攪拌，控制混合液pH值在9. 0-10. 5之間。滴加完畢后，將四口瓶置于60°C水浴中，晶化24h。產(chǎn)物離心，洗滌并干燥，得到鎂鋁碳酸根水滑石([Mg4Al2(OH)12JCO3 · yH20)。B :取上述鎂鋁碳酸根水滑石O. Ig加入5mL濃度為O. 0002mol/L 的魯米諾溶液，吸附lOmin，過(guò)濾，常溫干燥，得到黃綠色的產(chǎn)物。產(chǎn)物中鎂鋁碳酸根水滑石與魯米諾的質(zhì)量比為 564:1。C :將2. 2mL正硅酸乙酯，O. 7mL /K，50 μ L濃度為O. lmol/L鹽酸混合，攪拌至澄清溶液；再加入2mL質(zhì)量濃度為2%殼聚糖溶液，2mL體積比為I: I的乙醇水溶液攪拌2小時(shí)。在此混合溶液中加入30 μ L濃度5. 4mg/mL葡萄糖氧化酶及30 μ L濃度為10. 8mg/mL辣根過(guò)氧化物酶，O. 05g吸附魯米諾的鎂鋁碳酸根水滑石，攪拌，直至混合均勻，得到白色糊狀混合物。將此白色混合物填充至石英管中，石英管兩端填充玻璃棉，得到化學(xué)發(fā)光傳感器。葡萄糖的檢測(cè)方法將步驟C的化學(xué)發(fā)光傳感器與流動(dòng)注射分析結(jié)合，實(shí)現(xiàn)葡萄糖的檢測(cè)；檢測(cè)系統(tǒng)由蠕動(dòng)泵、六通閥、超微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x(BPCL)及管路形成完整的化學(xué)發(fā)光流動(dòng)檢測(cè)體系。以純凈水為載液，開(kāi)啟蠕動(dòng)泵及BPCL，用純凈水洗滌管路30min，流速設(shè)置為lmL/min。保證BPCL的穩(wěn)定運(yùn)行。調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵流速為2. OmL/min,將稀釋1000倍的葡萄糖注射液(質(zhì)量濃度為5%的葡萄糖注射液)通過(guò)六通閥注入化學(xué)發(fā)光傳感器，產(chǎn)生發(fā)光，由BPCL中檢測(cè)發(fā)光并采集數(shù)據(jù)。通過(guò)產(chǎn)生的光強(qiáng)度推算出葡萄糖注射液的濃度為O. 292mol/L。實(shí)施例2化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法A :稱(chēng)取O. 045mol的硝酸鎂與O. 015mol的硝酸招，混合，加入60mL純凈水，配制成鹽液；稱(chēng)取O. 0075mol的碳酸鈉與O. 12mol的氫氧化鈉,混合,加入6OmL純凈水,配制成堿液。將上述兩溶液逐滴滴入四口瓶中，攪拌，控制混合液pH值在9. 0-10. 5之間。滴加完畢后，將四口瓶置于60°C水浴中，晶化24h。產(chǎn)物離心，洗滌并干燥，得到鎂鋁碳酸根水滑石([Mg6Al2 (OH)12] CO3 · yH20)0B :取上述鎂鋁碳酸根水滑石O. Ig加入15mL濃度為O. 0002mol/L的魯米諾溶液，吸附lOmin，過(guò)濾，常溫干燥，得到黃綠色的產(chǎn)物。產(chǎn)物中鎂鋁碳酸根水滑石與魯米諾的質(zhì)量比為188:1。C :將2. 2mL正硅酸乙酯，ImL /K，50 μ L濃度為O. lmol/L鹽酸混合，攪拌至澄清溶液；再加入ImL質(zhì)量濃度為2%殼聚糖溶液，2mL體積比為2:1的乙醇水溶液攪拌2小時(shí)。在此混合溶液中加入30 μ L濃度5. 4mg/mL葡萄糖氧化酶及60 μ L濃度為10. 8mg/mL辣根過(guò)氧化物酶，0. Ig吸附魯米諾的鎂鋁碳酸根水滑石，攪拌，直至混合均勻，得到白色糊狀混合物。將此白色混合物填充至石英管中，石英管兩端填充玻璃棉，得到化學(xué)發(fā)光傳感器。
葡萄糖的檢測(cè)方法采用實(shí)施例I的化學(xué)發(fā)光流動(dòng)檢測(cè)體系，調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵流速為2. OmL/min，將稀釋100倍的正常成人的血漿樣品(葡萄糖濃度80-120mg/dL)通過(guò)六通閥注入體系中，與化學(xué)發(fā)光傳感器反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光，由BPCL中檢測(cè)發(fā)光并采集數(shù)據(jù)。通過(guò)產(chǎn)生的光強(qiáng)度推算出血漿樣品中葡萄糖的濃度為6. 5X10_3mol/L。實(shí)施例3化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法A :稱(chēng)取O. 06mol的硝酸鎂與O. 015mol的硝酸招，混合，加入60mL純凈水，配制成鹽液；稱(chēng)取O. 0075mol的碳酸鈉與O. 12mol的氫氧化鈉，混合，加入60mL純凈水，配制成堿液。將上述兩溶液逐滴滴入四口瓶中，攪拌，控制混合液pH值在9. 0-10. 5之間。滴加完畢后，將四口瓶置于60°C水浴中，晶化24h。產(chǎn)物離心，洗滌并干燥，得到鎂鋁碳酸根水滑石([Mg8Al2(OH)12JCO3 · yH20)0B :取上述鎂鋁碳酸根水滑石O. 2g加入25mL濃度為O. 0002mol/L的魯米諾溶液，吸附lOmin，過(guò)濾，常溫干燥，得到黃綠色的產(chǎn)物。產(chǎn)物中鎂鋁碳酸根水滑石與魯米諾的質(zhì)量比為113:1。C :將3mL正硅酸乙酯，I. 2mL水，60 μ L濃度為O. lmol/L鹽酸混合，攪拌至澄清溶液；再加入2mL質(zhì)量濃度為2%的殼聚糖溶液，3mL體積比為I: I的乙醇水溶液攪拌2小時(shí)。在此混合溶液中加入90 μ L濃度5. 4mg/mL葡萄糖氧化酶及60 μ L濃度為10. 8mg/mL辣根過(guò)氧化物酶，O. 2g吸附魯米諾的鎂鋁碳酸根水滑石，攪拌，直至混合均勻，得到白色糊狀混合物。將此白色混合物填充至石英管中，石英管兩端填充玻璃棉，得到化學(xué)發(fā)光傳感器。葡萄糖的檢測(cè)方法采用實(shí)施例I的化學(xué)發(fā)光流動(dòng)檢測(cè)體系，調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵流速為2. OmL/min,將稀釋100倍的正常成人的血清樣品(葡萄糖濃度80-120mg/dL)通過(guò)六通閥注入體系中，與化學(xué) 發(fā)光傳感器反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光，由BPCL中檢測(cè)發(fā)光并采集數(shù)據(jù)。通過(guò)產(chǎn)生的光強(qiáng)度推算出血漿樣品中葡萄糖的濃度為8. lX10_3mol/L。本發(fā)明化學(xué)發(fā)光傳感器的性能檢測(cè)化學(xué)發(fā)光傳感器穩(wěn)定性測(cè)試采用實(shí)施例I的化學(xué)發(fā)光流動(dòng)檢測(cè)體系，連續(xù)注射濃度為5X10_6mol/L葡萄糖溶液至化學(xué)發(fā)光流動(dòng)檢測(cè)體系中，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可以看出，注射5X 10_6mol/L葡萄糖溶液得到的化學(xué)發(fā)光信號(hào)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2. 8%。說(shuō)明本發(fā)明制備的化學(xué)發(fā)光傳感器足以保證實(shí)際樣品的長(zhǎng)時(shí)間檢測(cè)?；瘜W(xué)發(fā)光傳感器緩沖能力測(cè)試采用實(shí)施例I的化學(xué)發(fā)光流動(dòng)檢測(cè)體系，用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)純凈水的PH值，配制不同pH值(2. 0-12. O)的載液，將其注入化學(xué)發(fā)光流動(dòng)檢測(cè)體系中，5min后，測(cè)量流出液的pH值，結(jié)果如圖2所示。在pH值4. 0-10. O之間，流出液的PH值基本保持穩(wěn)定，證明該化學(xué)發(fā)光傳感器在pH值4. 0-10. O之間具有緩沖能力，可應(yīng)用于弱酸或中性樣品的檢測(cè)，拓寬了魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)PH值的范圍。
權(quán)利要求
1.一種化學(xué)發(fā)光傳感器，采用由二氧化硅凝膠和殼聚糖組成的交聯(lián)劑交聯(lián)固定葡萄糖氧化酶、辣根過(guò)氧化物酶和吸附了魯米諾的鎂鋁碳酸根水滑石，將得到的混合物填充于石英管內(nèi)，石英管兩端填充玻璃棉，構(gòu)成化學(xué)發(fā)光傳感器。
2.權(quán)利要求I所述的化學(xué)發(fā)光傳感器，其特征在于具體制備方法如下 A :將鎂鋁碳酸根水滑石浸入魯米諾水溶液中，混合，充分吸附，經(jīng)過(guò)濾，常溫干燥得到黃綠色的產(chǎn)物，水滑石和魯米諾的質(zhì)量比為(100-600) :1 ; B :將正硅酸乙酯、純凈水、濃度為0. 1-0. 5mol/L的鹽酸混合，三者的體積比依次為(2-4) : (0. 5-1. 5) : (0. 01-0. 05)，充分?jǐn)嚢?，得到澄清的二氧化硅凝膠溶液；然后加入殼聚糖溶液、乙醇水溶液，二氧化硅凝膠、殼聚糖溶液及乙醇水溶液的體積比為(1-4) : I: (1-2)，混合，充分?jǐn)嚢?，得到殼聚糖二氧化硅?fù)合凝膠；再加入質(zhì)量比為(1-3):(1-2)的葡萄糖 氧化酶與辣根過(guò)氧化物酶的混合酶和步驟A制備的吸附魯米諾的鎂鋁碳酸根水滑石，充分?jǐn)嚢?，混合均勻，其中殼聚糖二氧化硅?fù)合凝膠、混合酶及吸附魯米諾的水滑石的質(zhì)量比為(3-7) : (0. 05-0. 2) : (0. 05-0. 3)，將得到的白色糊狀物填充至石英管中，兩端填充玻璃棉。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的化學(xué)發(fā)光傳感器，其特征在于步驟A中魯米諾水溶液的濃度為I X 10_，1 X 10_2mol/L，步驟B中的殼聚糖溶液的質(zhì)量濃度為0. 5-3%,乙醇水溶液中乙醇與水的體積比為(1-2): I。
4.采用權(quán)利要求I至3任何一種化學(xué)發(fā)光傳感器用于檢測(cè)葡萄糖的方法，將化學(xué)發(fā)光傳感器與流動(dòng)注射分析結(jié)合，實(shí)現(xiàn)葡萄糖的檢測(cè)；化學(xué)發(fā)光流動(dòng)檢測(cè)體系由蠕動(dòng)泵、六通閥、超微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x及管路構(gòu)成，以純凈水為載液，將葡萄糖樣品溶液注入到六通閥中，通過(guò)蠕動(dòng)泵載入至傳感器中，產(chǎn)生發(fā)光，由超微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度并采集數(shù)據(jù)，測(cè)得葡萄糖的含量。
5.根據(jù)權(quán)利要求4化學(xué)發(fā)光傳感器檢測(cè)葡萄糖的方法，其特征是載液的流速優(yōu)選為2.OmL,/min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種化學(xué)發(fā)光傳感器及采用該傳感器檢測(cè)葡萄糖的方法，可應(yīng)用于臨床葡萄糖的檢測(cè)。通過(guò)將葡萄糖氧化酶、化學(xué)發(fā)光試劑(魯米諾)和催化劑同時(shí)固定，拓寬魯米諾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)條件，使其從傳統(tǒng)的堿性基質(zhì)擴(kuò)充至弱酸性的基質(zhì)中，并保證化學(xué)發(fā)光傳感器的靈敏度及使用壽命。并兼具操作簡(jiǎn)單，成本低，線性范圍寬等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/76GK102967595SQ201210509888
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月3日
發(fā)明者王志華, 劉芳, 呂超 申請(qǐng)人:北京化工大學(xué)