專利名稱：快速檢測煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明所屬的領域為生物技術領域，尤其是涉及一種攜帶番茄黃化曲葉病毒的煙粉虱的快速檢測方法及應用。
背景技術：
番爺黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)屬于雙生病毒科(feOTifliririt/ae)菜豆金色花葉病毒屬Uiegomovirus、，該屬病毒在自然條件下只能由煙粉IS,(.Bemisia iaAaci)以持久方式傳播,因而又被稱為粉風傳雙生病毒。番爺黃化曲葉病害的大規(guī)模流行往往伴隨著傳毒介體煙粉虱的爆發(fā)。在我國，番茄黃化曲葉病最初僅分布在海南、云南、廣東和廣西等省，自2006年上海和浙江先后在番茄上發(fā)現(xiàn)番茄黃化曲葉病毒以來，該病害在華東地區(qū)迅速蔓延開來，已在我國北京、上海、山東、新疆等18個省份的番茄上流行爆發(fā)。番茄黃化曲葉病導致番茄葉片上卷或下卷、葉片黃化、葉脈外突、植株矮化，嚴重時致番茄絕收。近年來，由于全球氣候變暖和農業(yè)發(fā)展格局的變化，煙粉虱在我國北方地區(qū)也呈爆發(fā)趨勢，使得番茄黃化曲葉病害在我國自南向北迅速擴散和蔓延開來，對番茄生產構成巨大威脅。番茄黃化曲葉病毒不能機械傳播，不經卵傳播，只由煙粉虱成蟲以持久性方式傳播，且煙粉虱一旦獲毒，即終身帶毒。煙粉虱傳毒效率高，每株植株上只要I頭帶毒B型或Q型煙粉虱成蟲取食，則病毒傳毒率達50-55%，因此煙粉虱的爆發(fā)往往導致番茄黃化曲葉病害的大流行，在生產上造成巨大危害，經濟損失嚴重。實際生產中，田間煙粉虱是否攜帶番茄黃化曲葉病毒，帶毒率高低等問題往往難以掌握。近年來我國番茄黃化曲葉病毒病發(fā)生處于上升時期，暴發(fā)態(tài)勢仍將延續(xù)，利用現(xiàn)代科學技術提高我國對于番茄黃化曲葉病毒的早期監(jiān)測和預警能力迫在眉睫。以往對于煙粉虱帶毒率的檢測只能依賴PCR的方法，而該方法受儀器依賴性強、成本高等限制只能檢測多頭煙粉虱的混合樣本，因而PCR方法得到的實驗數(shù)據只是個粗略值，無法明確單頭煙粉虱的帶毒情況。另外，由于植物與昆蟲的本質區(qū)別使得適用于植物的血清學方法無法應用到介體昆蟲的檢測中。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種快速檢測煙粉虱體內攜帶番茄黃化曲葉病毒的方法及其應用。一種快速檢測煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA方法，包括如下步驟 O田間煙粉虱的采集、預處理及研磨；
2)硝酸纖維素(NC)膜準備用鉛筆在NC膜外層紙上劃線，使NC膜印上方格線痕跡，每格規(guī)格1X1 cm,平整放入培養(yǎng)皿中央；
3)點樣吸取研磨的煙粉虱研磨液2μ ,點樣于NC膜的格子中央；4)封閉點樣后，將NC膜靜置晾干10分鐘，使用按5g脫脂奶粉加100 mL PBST緩沖液(含O. 05% Tween-20的O. 01 mol/L PBS)的比例配制得到5%的脫脂奶粉封閉，37°C靜置.O. 5-1小時；
5)加一抗加入中國專利申請?zhí)枮?01210004197.7的番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體，該單克隆抗體用5%的脫脂奶粉1:2000倍稀釋，37°C孵育I小時；
6)洗滌棄液體，NC膜用PBST緩沖液搖動洗脫5次，每次3分鐘；
7)加酶標二抗棄洗脫液，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG二抗(A4416Sigma), 二抗用5%的脫脂奶粉1:1000倍稀釋，37°C孵育I小時；
8)洗滌棄液體，NC膜用PBST緩沖液搖動洗脫5飛次，每次5分鐘；
9)顯色棄洗脫液，將NC膜用濾紙吸干或靜置晾干，加入TMB顯色液(W4121Promega)顯色，避光靜置5 10分鐘；
10)終止反應待NC膜上的樣品呈現(xiàn)藍色而陰性對照未顯色時棄顯色液終止反應；
11)記錄結果ddH2O浸泡NC I吳，晚干后記錄結果。所述的田間煙粉虱的采集、預處理及研磨包括如下步驟
1)煙粉虱采集從大田中用吸蟲器采集捕獲煙粉虱；
2)煙粉虱存放95%的酒精中室溫存放；
3)煙粉虱預處理移液槍吸掉95%的酒精，ddH20清洗3遍，去掉酒精；
4)煙粉虱研磨用毛筆蘸取單頭煙粉虱，置于干凈的封口膜上，室溫晾干5分鐘；晾干后，每頭煙粉虱滴加2 μ L 0.05 mol/L PBS緩沖液，用O. 5 mL離心管底磨碎至肉眼不能看到明顯組織。一種快速檢測煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒dot-ELISA試劑盒，包括以下步驟
1)試劑盒中主要試劑與材料
O.05 mol/L PBS10 ml
單克隆抗體O. I ml
HRP標記羊抗鼠IgG 二抗O. I ml
TMB顯色底物液10 ml
IOX濃縮封閉液10 ml
IOX濃縮抗體稀釋液20 ml
20 X濃縮洗滌液60 ml
封閉劑15 g
NC膜5張
2)試劑盒操作步驟使用說明
2. I)單頭煙粉虱置于封口膜上，加入2-3 ul O. 05 mol/L PBS，用0.5 ml離心管底磨
碎；
2. 2)取2 ul上清點到硝酸纖維素(NC)膜上，室溫干燥10分鐘；
2. 3) NC膜浸入到含5%封閉劑的I X封閉液中室溫封閉30分鐘；
2. 4) NC膜放入用I X抗體稀釋液1: 2000倍稀釋的單抗中室溫孵育30-60分鐘；
2.5)IX洗滌液洗膜3-4次，每次3分鐘；
2.6)NC膜放入用I X抗體稀釋液1:1000倍稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG 二抗中(A4416Sigma)室溫孵育30-60分鐘；
2.7)IX洗滌液洗膜5-6次，每次3分鐘；
2.8)用濾紙吸干膜后將TMB底物顯色液(W4121 Promega)滴加到膜表面進行顯色反應，肉眼觀察結果，待陽性對照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時記錄檢測結果，顯色時間約5-20分鐘。所述的檢測煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA快速鑒定方法及其試劑盒的應用，利用該方法對田間煙粉虱的帶毒情況進行調查，精確計算煙粉虱帶毒率，預測番茄黃化曲葉病在田間的流行爆發(fā)趨勢以及時采取防治措施。本發(fā)明有益效果 1)本發(fā)明提供了一種專門針對傳毒介體煙粉虱，快速檢測其體內攜帶病毒的血清學方
法;
2)本發(fā)明還提供了一種檢測煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的快速檢測試劑盒；
3)利用本發(fā)明可實現(xiàn)對單頭煙粉虱帶毒情況的檢測，且精確性高；
4)本發(fā)明提供的鑒定方法靈敏度高，特異性強，操作簡便，快速高效，檢測結果可靠；
5)本發(fā)明提供的試劑盒不依賴儀器、成本小、操作簡便；可同時檢測幾百至幾千頭煙粉虱樣品，高通量又省時高效，適于在田間大規(guī)模推廣應用；
6)利用本發(fā)明可對田間煙粉虱的帶毒情況進行大規(guī)模調查，精確計算煙粉虱帶毒率，及時預測番茄黃化曲葉病在田間的流行爆發(fā)趨勢以及時采取防治措施。


圖I田間米集的煙粉風樣品；
圖2煙粉風研磨示意 圖3部分田間煙粉虱樣品帶毒率檢測結果；
圖4檢測煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA試劑盒的外包裝；
圖5檢測煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA試劑盒的材料和試劑；
圖6應用試劑盒檢測田間煙粉虱的帶毒情況。
具體實施例方式以下通過附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。實施例一田間煙粉虱樣品帶毒率檢測
本發(fā)明利用dot-ELISA的方法檢測田間煙粉虱對番茄黃化曲葉病毒的攜帶情況，計算煙粉虱帶毒率，預測當?shù)胤腰S化曲葉病毒的爆發(fā)趨勢，以提早做好防治措施，為農業(yè)生產服務。從杭州農科院蔬菜所大田中用吸蟲器采集煙粉虱110頭(圖I)并短期存放于4°C冰箱。從4°C冰箱中取出煙粉虱后，置于培養(yǎng)皿中，用ddH20浸泡，用槍頭蘸取單頭煙粉虱，置于干凈的封口膜上，室溫晾干。在硝酸纖維素膜外層紙上用鉛筆劃線，使膜印上方格線痕跡，每孔規(guī)格1X1 cm，在膜的一角用鉛筆做標記，平整放入培養(yǎng)皿中央。封口膜上晾干的煙粉虱每頭滴加2 ul O. 05 mol/L PBS，用0.5 ml離心管底磨碎至肉眼不能看到明顯組織(圖2)，用移液槍吸取I μ L上述含有煙粉虱組織的PBS，點樣于劃好的格子中央，并設置陽性、陰性對照，同時吸取O. 3 μ L作為模板進行PCR驗證。點樣后，將膜靜置晾干，加入20ml左右5%的脫脂奶粉，37°C封閉30分鐘；棄脫脂奶粉，加入1: 2000倍稀釋的番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體(中國專利申請?zhí)?01210004197. 7)，37°C靜置孵育I小時；棄液體，用PBST (含O. 05% Tween-20的O. 01 mol/L PBS)搖動洗脫3次，每次3分鐘；棄洗脫液，加入1:1000倍稀釋的辣根過氧化酶(HRP)標記的二抗(A4416 Sigma)，37°C靜置孵育I小時；棄液體，用PBST于水平搖床上搖動洗脫5次，每次5分鐘；棄洗脫液，將膜用濾紙吸干后加入TMB顯色液(W4121 Promega)顯色，避光靜置5 10分鐘，待陽性呈現(xiàn)藍色而陰性未顯色時棄顯色液終止反應；ddH2 O浸泡后晾干，用濾紙夾起保存拍照；計算煙粉虱對TYLCV的帶毒率(帶毒率=陽性數(shù)/樣品總數(shù)X 100%)。檢測結果顯示110頭煙粉虱中有17頭呈陽性反應(圖3)，經計算，煙粉虱對TYLCV的帶毒率為15. 45%，預測該地將有TYLCV流行趨勢，建議防治煙粉虱，番茄大棚鋪60目防蟲網并適時噴灑農藥清除煙粉虱，必須栽培抗番茄黃化曲葉病毒的番爺品種。實施例二 檢測煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒dot-ELISA試劑盒的開發(fā) 1.檢測煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)dot-ELISA試劑盒(圖4)包含以下材料與試劑
1)試劑盒使用說明書I份
2)試劑與材料
O.05 mol/L PBS10 ml
TYLCV單克隆抗體O. I ml
HRP 標記羊抗鼠 IgG 二抗(A4416 Sigma)O. I ml
TMB 顯色底物液(W4121 Promega)10 ml
IOX 濃縮封閉液(O. I mol/L PBST)10 ml
10X濃縮抗體稀釋液(50%的脫脂奶粉、0. lmol/L PBST) 20 ml 20X 濃縮洗滌液(O. 2 mol/L PBST)60 ml
封閉劑(脫脂奶粉)15 g
NC 膜(Amersham)5 張
2.試劑盒使用說明書包括
2.I試劑盒原理
dot-ELISA是以硝酸纖維素膜(NC膜)為固相載體的ELISA檢測方法，具有簡便、快速、特異、敏感、便于推廣、不需特殊儀器等優(yōu)點，應用前景廣。攜帶番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)的煙粉虱樣品的勻漿液點到NC膜上，干燥形成固相抗原；加入抗TYLCV的鼠單抗，則單抗與固相抗原(TYLCV)形成抗原-抗體復合物；再加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗鼠IgG抗抗體(即二抗)，則抗抗體與上述抗原-抗體復合物結合形成抗原-抗體-酶標抗抗體復合物；加入顯色底物，復合物上的酶催化底物生成沉淀型有色產物而顯色。由于每步之間均有洗滌的步驟，若待測煙粉虱樣品中不含TYLCV，則酶標抗體將被洗掉，底物不顯色而呈陰性反應。肉眼觀察斑點顏色有無及深淺來進行樣品中TYLCV的定性和半定量檢測。2. 2主要試劑與材料(圖5)
0.05 mol/L PBS10 ml
TYLCV單克隆抗體0. I mlHRP 標記羊抗鼠 IgG 二抗(A4416 Sigma)O. I ml
TMB 顯色底物液(W4121 Promega)10 ml
IOX 濃縮封閉液(O. I mol/L PBST)10 ml
IOX濃縮抗體稀釋液(50%的脫脂奶粉、O. lmol/L PBST) 20 ml 20X 濃縮洗滌液(O. 2 mol/L PBST)60 ml
封閉劑(脫脂奶粉)15 g
NC 膜(Amersham)5 張
以上試劑均保存于4°C下
2.3操作步驟
1)單頭煙粉虱置于封口膜上，加入2-3ul O. 05 mol/L PBS，用0. 5 ml離心管底磨碎；
2)取2ul上清點到硝酸纖維素(NC)膜上，室溫干燥10 min;
3)NC膜浸入到含5%封閉劑的封閉液中室溫封閉30 min;
4)NC膜放入用抗體稀釋液1: 2000倍稀釋的單抗中室溫孵育30-60 min;
5)用洗滌液洗膜3-4次，每次3min;
6)NC膜放入用抗體稀釋液1:1000倍稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG二抗中室溫孵育30-60
min;
7)用洗滌液洗膜5-6次，每次3min;
8)用濾紙吸干膜后將TMB底物顯色液滴加到膜表面進行顯色反應，肉眼觀察結果，待陽性對照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時記錄檢測結果，顯色時間約5-20 min。2. 4緩沖液配方
I)磷酸鹽緩沖液(PBS，0. 05 mol/L, ρΗ7· 4)。2)含5%封閉劑的封閉液用去離子水將10Χ濃縮封閉液按I :9體積比進行稀釋(I份10Χ濃縮封閉液+9份去離子水)，稀釋后按每20 ml稀釋封閉液加入Ig封閉劑配制成含5%封閉劑的封閉液，配制好的封閉液在4°C冰箱可保存一個月。3)洗滌液用去離子水將20X濃縮洗滌液按I :19體積比進行稀釋(或按需量稀釋)(I份20X濃縮洗滌液+19份去離子水)，稀釋后的洗滌液在4°C環(huán)境可保存一個月。4)抗體稀釋液用去離子水將10X抗體稀釋液按I :9體積比進行稀釋(I份10X抗體稀釋液+9份去離子水)，稀釋后按每20 ml稀釋液加入Ig封閉劑配制成抗體稀釋液。配制好的抗體稀釋液在4°C冰箱可保存一個月。2. 5注意事項
1)硝酸纖維素膜位于2張保護紙中間，不要用手直接觸摸膜，用鑷子或戴一次性PE手套取膜；
2)NC膜上滴加檢測樣品的一面為正面，整個實驗過程中應朝上；
3)抗體在使用前10min之內稀釋；
4)NC膜CK+處為陽性對照；NC膜CK-處為陰性對照(點健康的煙粉虱勻漿液)；
5)試劑盒反應溫度為4-38°C，最佳反應溫度為37°C；
6)試劑盒能檢測200頭粉虱。2. 6貯藏條件及保存期
試劑盒于2-8°C避光保存，抗體_20°C冷凍保存更佳。該產品有效期為6個月。
實施例二 利用試劑盒檢測田間煙粉風
用該試劑盒檢測田間煙粉虱樣品的帶毒率，可同時檢測幾千頭煙粉虱，結果快速、可靠、高通量又操作簡便。用于大規(guī)模調查田間煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的情況，及時預測該病害的流行爆發(fā)。圖6是利用該試劑盒檢測杭州田間蔬菜地煙粉虱的部分結果。
權利要求
1.一種快速檢測煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA方法，其特征在于包括如下步驟 O田間煙粉虱的采集、預處理及研磨； 2)硝酸纖維素(NC)膜準備用鉛筆在NC膜外層紙上劃線，使NC膜印上方格線痕跡，每格規(guī)格1X1 cm,平整放入培養(yǎng)皿中央； 3)點樣吸取研磨的煙粉虱研磨液2μ ,點樣于NC膜的格子中央； 4)封閉點樣后，將NC膜靜置晾干10分鐘，使用按5g脫脂奶粉加100 mL PBST緩沖液的比例配制得到5%的脫脂奶粉封閉，37°C靜置O. 5-1小時；所述的PBST緩沖液為含O. 05%Tween-20 的 O. 01 mol/L PBS ； 5)加一抗加入中國專利申請?zhí)枮?01210004197.7的番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體，該單克隆抗體用5%的脫脂奶粉1:2000倍稀釋，37°C孵育I小時； 6)洗滌棄液體，NC膜用PBST緩沖液搖動洗脫5次，每次3分鐘； 7)加酶標二抗棄洗脫液，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG二抗，二抗用5%的脫脂奶粉1:1000倍稀釋，37°C孵育I小時； 8)洗滌棄液體，NC膜用PBST緩沖液搖動洗脫5飛次，每次5分鐘； 9)顯色棄洗脫液，將NC膜用濾紙吸干或靜置晾干，加入TMB顯色液顯色，避光靜置5 IO分鐘； 10)終止反應待NC膜上的樣品呈現(xiàn)藍色而陰性對照未顯色時棄顯色液終止反應； 11)記錄結果ddH2O浸泡NC I吳，晚干后記錄結果。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述的田間煙粉虱的采集、預處理及研磨包括如下步驟 1)煙粉虱采集從大田中用吸蟲器采集捕獲煙粉虱； 2)煙粉虱存放95%的酒精中室溫存放； 3)煙粉虱預處理移液槍吸掉95%的酒精，ddH20清洗3遍，去掉酒精； 4)煙粉虱研磨用毛筆蘸取單頭煙粉虱，置于干凈的封口膜上，室溫晾干5分鐘；晾干后，每頭煙粉虱滴加2 μ L 0.05 mol/L PBS緩沖液，用O. 5 mL離心管底磨碎至肉眼不能看到明顯組織。
3.—種如權利要求I所述的方法的試劑盒，其特征在于包括以下步驟 1)試劑盒試劑與材料 .O.05 mol/L PBS10 ml單克隆抗體O. I ml HRP標記羊抗鼠IgG 二抗O. I ml TMB顯色底物液10 ml IOX濃縮封閉液10 ml IOX濃縮抗體稀釋液20 ml .20 X濃縮洗滌液60 ml封閉劑15 gNC膜5張 2)試劑盒操作步驟.2. I)單頭煙粉虱置于封口膜上，加入2-3 ul O. 05 mol/L PBS，用0.5 ml離心管底磨碎； . 2. 2)取2 ul上清點到硝酸纖維素(NC)膜上，室溫干燥10分鐘； .2. 3) NC膜浸入到含5%封閉劑的I X封閉液中室溫封閉30分鐘； .2. 4) NC膜放入用I X抗體稀釋液1: 2000倍稀釋的單抗中室溫孵育30-60分鐘； . 2.5)IX洗滌液洗膜3-4次，每次3分鐘； .2. 6)NC膜放入用I X抗體稀釋液1:1000倍稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG 二抗中室溫孵育30-60分鐘; . 2.7)IX洗滌液洗膜5-6次，每次3分鐘； .2. 8)用濾紙吸干膜后將TMB底物顯色液滴加到膜表面進行顯色反應，肉眼觀察結果，待陽性對照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時記錄檢測結果，顯色時間5-20分鐘。
4.一種如權利要求1-3任一項所述的快速檢測煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA方法及其試劑盒的應用，其特征在于利用該方法對田間煙粉虱的帶毒情況進行調查，精確計算煙粉虱帶毒率，預測番茄黃化曲葉病在田間的流行爆發(fā)趨勢以及時采取防治措施。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA方法及其應用。田間煙粉虱的采集、預處理及研磨后，利用番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體，建立檢測傳毒介體煙粉虱的dot-ELISA方法，并研發(fā)快速檢測試劑盒，對田間煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的情況進行檢測。利用該發(fā)明可對田間煙粉虱的帶毒率進行大規(guī)模調查，預測田間番茄黃化曲葉病的流行爆發(fā)趨勢。該檢測方法快速高效、靈敏特異、高通量又操作簡便，為番茄黃化曲葉病毒病的快速診斷、預測預報及科學防控提供技術支撐。
文檔編號G01N33/577GK102937652SQ20121042323
公開日2013年2月20日 申請日期2012年10月30日 優(yōu)先權日2012年10月30日
發(fā)明者謝艷, 周雪平, 吳建祥, 矯曉陽, 劉歡 申請人:浙江大學