專利名稱：基于靛藍(lán)胭脂紅電化學(xué)聚合膜的dna電化學(xué)傳感器及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本 發(fā)明涉及電化學(xué)傳感器領(lǐng)域，更具體的說涉及一種基于靛藍(lán)胭脂紅電化學(xué)聚合膜的DNA電化學(xué)傳感器及其制備方法。
背景技術(shù)：
DNA生物傳感器在基因序列分析、疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測等方面具有重要的作用，其中電化學(xué)DNA生物傳感器因具有簡單、快速、靈敏、低成本和易于微型化等優(yōu)點，已成為生物分析領(lǐng)域的研究熱點。電化學(xué)DNA生物傳感器大致可分為兩大類電化學(xué)DNA雜交生物傳感器和非基因識別的電化學(xué)DNA傳感器，其中電化學(xué)DNA雜交生物傳感器測定DNA的過程包括DNA探針的固定、雜交過程、雜交的指示和電化學(xué)信號的檢測4個步驟。對于DNA電化學(xué)傳感器，探針的固定量和活性直接影響著傳感器的靈敏度，為了在電極表面有效連接DNA，保持其待測分子的特異性和結(jié)合活性，往往需要借助有效的物理或化學(xué)方法。目前DNA固定方法主要有直接吸附法、自組裝膜法、親和素-生物素反應(yīng)系統(tǒng)固定法、直接共價鍵合法和聚合膜法。聚合物薄膜法固定DNA具有所含電活性中心的濃度大、有三維可利用場勢、性能穩(wěn)定、不溶不熔以及修飾方法簡單等優(yōu)點。靛藍(lán)胭脂紅(1C)，又叫靛藍(lán)二磺酸鈉，具有很好的電活性和光學(xué)性質(zhì)。有文獻(xiàn)報道，采用電化學(xué)聚合制備了聚靛藍(lán)胭脂紅膜，并通過靜電吸附固定辣根過氧化酶，構(gòu)建了一種新型的酶電極；也有文獻(xiàn)曾制備了一種聚吡咯-靛藍(lán)胭脂紅復(fù)合膜并用于多巴胺和抗壞血酸的同時測定，但是，目前還未見有基于靛藍(lán)胭脂紅電化學(xué)聚合膜的DNA電化學(xué)傳感器制備的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的在于提供一種基于靛藍(lán)胭脂紅電化學(xué)聚合膜的DNA電化學(xué)傳感器，其具有響應(yīng)時間短、檢測限低、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好的特點。為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的解決方案是
一種基于靛藍(lán)胭脂紅電化學(xué)聚合膜的DNA電化學(xué)傳感器，為具有工作電極、輔助電極和參比電極的三電極體系傳感器，其中，該工作電極為共價固定了 5’ -末端修飾氨基的單鏈探針DNA后的靛藍(lán)胭脂紅聚合膜修飾玻碳電極。進(jìn)一步，該輔助電極為鉬電極，該參比電極為Ag/AgCl電極。本發(fā)明的第二目的在于提供一種制備上述基于靛藍(lán)胭脂紅電化學(xué)聚合膜的DNA電化學(xué)傳感器的方法，其包括如下步驟
①采用循環(huán)伏安法在玻碳電極修飾上靛藍(lán)胭脂紅聚合膜，得到聚靛藍(lán)胭脂紅修飾電
極；
②將聚靛藍(lán)胭脂紅修飾電極通過五氯化磷活化磺酸根得到磺酰氯基團，與5’-末端修飾氨基的單鏈探針DNA發(fā)生共價縮合作用，得到探針序列修飾電極；
③將探針序列修飾電極與鉬電極和Ag/AgCl電極一起形成三電極體系電化學(xué)DNA傳感器。進(jìn)一步，在步驟①中，該玻碳電極在采用循環(huán)伏安法修飾靛藍(lán)胭脂紅聚合膜之前還經(jīng)過預(yù)處理步驟，該預(yù)處理步驟為采用粒徑為I. 0、0. 3和O. 05 μ m的a -Al2O3拋光粉打磨成鏡面后，再分別在丙酮、乙醇和二次水中超聲清洗3分鐘，重復(fù)2 3次，再將電極置于
0.5 mol/L的H2SO4溶液中用循環(huán)伏安法連續(xù)掃描至穩(wěn)定，掃描范圍-I. (Γ+1. O V。進(jìn)一步，該步驟①為將經(jīng)過預(yù)處理過的玻碳電極置于含5 mmol/L靛藍(lán)胭脂紅的PH7. O混合磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安法掃描電聚合，聚合電位-O. Γ+1. 8 V，掃速20mV/s，掃描段數(shù)為10段；聚合完后在混合磷酸鹽緩沖液中浸泡5分鐘并用二次蒸餾水洗滌，得到聚靛藍(lán)胭脂紅修飾電極。 進(jìn)一步，該步驟②為將聚靛藍(lán)胭脂紅修飾電極在40 mmol/L五氯化磷丙酮溶液中浸泡30分鐘活化磺酸根得到酰氯化磺酸基團后，取10 μ LU X IO-6 mol/L的5’-末端修飾氨基的單鏈探針DNA滴于電極表面自然晾干，用TE緩沖液洗去未固定的5’-末端修飾氨基的單鏈探針DNA得到探針序列修飾電極。采用上述結(jié)構(gòu)后，本發(fā)明涉及的一種基于靛藍(lán)胭脂紅電化學(xué)聚合膜的DNA電化學(xué)傳感器及其制造方法，其采用循環(huán)伏安法將靛藍(lán)胭脂紅電聚合在玻碳電極表面，通過五氯化磷活化磺酸根得到磺酰氯基團，與5’ -末端修飾氨基的單鏈探針DNA的氨基共價縮合作用實現(xiàn)探針的固定，最后再結(jié)合鉬電極和Ag/AgCl電極，從而形成具有響應(yīng)時間短、檢測限低、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好的DNA電化學(xué)傳感器。


圖I為玻碳電極在含有5mmol/L靛藍(lán)胭脂紅的混合磷酸鹽緩沖液(pH7. O)中的連續(xù)循環(huán)伏安圖(掃速20 mV/s)；
圖 2A 和圖 2B 為 5. Ommol/L、K3 [Fe (CN)6]/K4 [Fe (CN)6]和 0. I mol/L 氯化鉀混合液在裸GCE (a)、PIC/GCE (b)和Sl/PIC/GCE (c)上的循環(huán)伏安圖和交流阻抗 圖3為1X10_4 mol/L亞甲基藍(lán)在Sl/PIC/GCE上富集不同時間的差分脈沖伏安圖(a到 I 分別為:4，8，12，16，20，24，28，32，36，40，44，48 分鐘)；
圖4為亞甲基藍(lán)在Sl/PIC/GCE上的不同掃速循環(huán)伏安圖(a到k依次是20，40，60，80，100，150，200，300，400，500 mV/s)，插圖為氧化還原峰電流值(Jp)與掃描速率(O的線性關(guān)系 圖5為SI與不同濃度S2雜交亞甲基藍(lán)的差分脈沖伏安圖(a到h分別為0，1X10_9，I X 10_1Q, I X 10_n, I X 10_12,1 X 10_13,1 X 10_14,1 X 10_15 mol/L)；
圖6為Sl/PIC/GCE與不同序列DNA雜交差分脈沖伏安曲線氧化峰電流值柱狀圖。
具體實施例方式為了進(jìn)一步解釋本發(fā)明的技術(shù)方案，下面通過具體實施例來對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述。需要說明的是，本發(fā)明中的電化學(xué)試驗在CHI650C型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)上進(jìn)行的。
本發(fā)明涉及一種基于靛藍(lán)胭脂紅電化學(xué)聚合膜的DNA電化學(xué)傳感器，為三電極體系傳感器，即具有工作電極、輔助電極和參比電極，其中，該輔助電極為鉬電極，該參比電極為Ag/AgCl電極，該工作電極為以玻碳電極為基底的為S1/PIC/GCE，即共價固定了 5’ -末端修飾氨基的單鏈探針DNA后的靛藍(lán)胭脂紅聚合膜修飾玻碳電極。本發(fā)明還提供一種制備上述的基于靛藍(lán)胭脂紅電化學(xué)聚合膜的DNA電化學(xué)傳感器的方法，該方法包括如下步驟
①采用循環(huán)伏安法在玻碳電極修飾上靛藍(lán)胭脂紅聚合膜，得到聚靛藍(lán)胭脂紅修飾電極；具體地，該玻碳電極在采用循環(huán)伏安法修飾靛藍(lán)胭脂紅聚合膜之前還經(jīng)過預(yù)處理步驟，該預(yù)處理步驟為采用粒徑為I. 0,0. 3和O. 05 μ m的a -Al2O3拋光粉打磨成鏡面后，再分 別在丙酮、乙醇和二次水中超聲清洗3分鐘，重復(fù)2 3次，再將電極置于O. 5 mol/L的H2SO4溶液中用循環(huán)伏安法連續(xù)掃描至穩(wěn)定，掃描范圍-I. (Γ+1. O V，如此即得到了干凈的裸玻碳電極，記為GCE ；
具體地，該步驟①為將經(jīng)過預(yù)處理過的玻碳電極置于含5 mmol/L靛藍(lán)胭脂紅的pH7.0混合磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安法掃描電聚合，聚合電位-O. Γ+1.8 V，掃速20 mV/s，掃描段數(shù)為10段；聚合完后在混合磷酸鹽緩沖液中浸泡5分鐘并用二次蒸餾水洗滌，得到聚靛藍(lán)胭脂紅修飾電極，記為PIC/GCE。具體請查閱圖I所示，第一次掃描在+0. OV和+0. 7V處出現(xiàn)2個氧化峰，而沒有看到對應(yīng)的還原峰出現(xiàn)，表明靛藍(lán)胭脂紅在玻碳電極上為一不可逆過程。而隨著掃描圈數(shù)的增加，這2個氧化峰電流顯著下降，并趨于穩(wěn)定，表明聚合膜在電極表面覆蓋飽和。掃描結(jié)束，將電極用混合磷酸鹽緩沖液淋洗除去物理吸附的靛藍(lán)胭脂紅分子，發(fā)現(xiàn)電極表面呈墨藍(lán)色，進(jìn)一步證明靛藍(lán)胭脂紅分子已在玻碳電極上形成了一層聚合膜。②將聚靛藍(lán)胭脂紅修飾電極通過五氯化磷活化磺酸根得到磺酰氯基團，與5’ -末端修飾氨基的單鏈探針DNA發(fā)生共價縮合作用，得到探針序列修飾電極；具體地，該步驟②為將聚靛藍(lán)胭脂紅修飾電極在40 mmol/L五氯化磷丙酮溶液中浸泡30分鐘活化磺酸根得到酰氯化磺酸基團后，取10 μ LU X IO^6 mol/L單鏈探針序列(SI :5’-NH2-(CH2)6-TCT TTGGGA CCA CTG TCG-3’)滴于電極表面自然晾干，用 TE 緩沖液(10mmol/L Tris-HCl+1 mmol/L EDTA, pH8. 0)洗去未固定的單鏈探針序列SI得到探針序列修飾電極。③將探針序列修飾電極與鉬電極和Ag/AgCl電極一起形成三電極體系電化學(xué)DNA傳感器。這樣，本發(fā)明涉及的一種基于靛藍(lán)胭脂紅電化學(xué)聚合膜的DNA電化學(xué)傳感器及其制造方法，其采用循環(huán)伏安法將靛藍(lán)胭脂紅電聚合在玻碳電極表面，通過五氯化磷活化磺酸根得到磺酰氯基團，與5’ -末端修飾氨基的單鏈探針DNA的氨基共價縮合作用實現(xiàn)探針的固定，最后再結(jié)合鉬電極和Ag/AgCl電極,從而形成具有響應(yīng)時間短、檢測限低、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好的DNA電化學(xué)傳感器。將各修飾電極在CHI650C電化學(xué)工作站上分別測定它們在含有I mmol/L、K3 [Fe (CN) 6] /K4 [Fe (CN) 6]的0. lmol/L氯化鉀溶液中循環(huán)伏安信號的大小(電位區(qū)間為-0. 2^+0. 6 V)和交流阻抗曲線，結(jié)果見圖2A和圖2B。從循環(huán)伏安圖可發(fā)現(xiàn)，K3 [Fe (CN)6]/K4 [Fe (CN) 6]在裸玻碳電極有一對可逆的氧化還原峰(曲線a)，而在PIC/GCE上K3 [Fe (CN) 6] /K4[Fe (CN)6]氧化還原電對的峰電流明顯減小。當(dāng)PIC/GCE上進(jìn)一步固定上SI后(曲線C)，K3[Fe (CN)6]/ K4 [Fe (CN)6]氧化還原峰的電流明顯大于曲線b。該結(jié)果也說明通過_S03_?；盎前房s合反應(yīng)能成功實現(xiàn)探針DNA的固定。本發(fā)明進(jìn)一步采用交流阻抗法對電極的修飾過程進(jìn)行表征，結(jié)果與循環(huán)伏安法相一致。靛藍(lán)胭脂紅在GCE表面的覆蓋度可以通過以
下公式進(jìn)行計算j =，公式中#&,和PiC分別表示裸玻碳電極和PIC/GCE上的電
子傳遞電阻值。因此，由玻碳電極聚合前后的阻抗值計算得覆蓋度為92. 3%，表明玻碳電極表面的絕大部分已被靛藍(lán)胭脂紅聚合膜覆蓋。本發(fā)明以亞甲基藍(lán)為電化學(xué)雜交指示劑考察了傳感器對目標(biāo)DNA的檢測能力。將Sl/PIC/GCE浸入含IX 10_4 mol/L亞甲基藍(lán)指示劑中，每富集4分鐘用pH 7.0混合磷酸鹽緩沖液淋洗后在混合磷酸鹽緩沖液空白液中進(jìn)行差分脈沖伏安掃描，直到富集達(dá)到飽和，得到最佳的富集時間。由圖3可知，隨著富集時間的增加，氧化峰電流越來越大，表明亞甲基藍(lán)在電極表面富集的量越來越多。當(dāng)富集時間達(dá)48分鐘時，氧化峰電流基本穩(wěn)定，說明亞甲基藍(lán)在Sl/PIC/GCE上已經(jīng)富集飽和。
淋洗亞甲基藍(lán)富集飽和的電極后，將其置于空白混合磷酸鹽中改變掃速進(jìn)行循環(huán)伏安測定，結(jié)果如圖4所示。由圖可知，隨著掃描速率的增大，氧化還原峰電流均越來越大。將氧化還原峰電流Tp與掃速^作圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)掃描速率為2(T500 mV/s范圍內(nèi)，亞甲基藍(lán)在Sl/PIC/GCE的氧化峰電流(Jpa)和還原峰電流值(/ρε)與掃描速率(幻均呈良好的線性關(guān)系;
其線性方程分別為
Ipc (I(T6A) =5. 165+0. 0629k(mV/s),r=0. 9975 ；
Ipa (IO^6A) =0. 2232-0. 0411 r (mV/s)，r=0. 9974。由此，說明亞甲基藍(lán)在電極表面的電化學(xué)行為受吸附控制，進(jìn)一步說明亞甲基藍(lán)在電極表面與Si發(fā)生了特異性吸附作用。對傳感器分析性能的檢測
將制備的Sl/PIC/GCE與一系列不同濃度(I. O ΧΙΟ—15 I. ΟΧΙΟ—9 mol/L)互補序列(S2 5’-CGA CAG TGG TCC CAA AGA-3’)雜交后，經(jīng)亞甲基藍(lán)富集，混合磷酸鹽緩沖液淋洗，在混合磷酸鹽緩沖液中測得的差分脈沖曲線。從圖5可以看出，隨著互補鏈DNA濃度的升高，氧化峰電流強度逐漸減小，說明由于隨著目標(biāo)互補序列濃度的增大，電極表面雙螺旋DNA量逐漸增大，減弱了探針DNA中鳥嘌呤堿基對亞甲基藍(lán)的吸附。將峰電流Ip對S2濃度對數(shù)IgQ2作圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4與IgQ2在1.0 X 10_15 I. O X 10_9 mol/L的濃度范圍，Jp與IgCs2呈良好的線性關(guān)系(插圖)，線性回歸方程為Tp (10_5 A)=-l. 164-0. 285 Ig (CS2/mol/L)，相關(guān)系數(shù)r=0. 9941，表明該傳感器能在此濃度范圍內(nèi)對互補序列進(jìn)行定量分析。根據(jù)3 σ ( σ為空白溶液相對標(biāo)準(zhǔn)偏差)，得到該傳感器的檢測限為2. OX 10_16 mol/L。進(jìn)一步通過改變雜交序列的堿基組成，考察了傳感器的雜交選擇性。實驗中，將S1/PIC/GCE分別放入濃度均為I. O X 10_9 mol/L的互補序列(S2)、單堿基錯配序列(S3 :5，-CGA CAG TGG ACC CAA AGA-3’)、三堿基錯配序列(S4 :5，-CGA CAA TGG CCC CAACGA-3’ )和非互補序列(S5 :5’ -GCATCGAGCGAGCTCGTA-3’ )進(jìn)行雜交，然后于亞甲基藍(lán)中富集后在混合磷酸鹽緩沖液進(jìn)行差分脈沖檢測。由圖6可知，亞甲基藍(lán)在S5-S1/PIC/GCE電極上的峰電流與Sl/PIC/GCE接近，這是因為非互不序列并未與探針發(fā)生雜交，故亞甲基藍(lán)在此電極上的峰電流值與Sl/PIC/GCE接近；隨著序列中錯配堿基數(shù)的減少(S4和S3)，序列與探針的雜交率隨著增大，亞甲基藍(lán)在相應(yīng)電極上的峰電流相應(yīng)減小；當(dāng)Sl/PIC/GCE與完全互補序列S2雜交后，亞甲基藍(lán)的峰電流最小。由此說明，該傳感器對不同序列DNA具有良好的選擇特異性，能有效區(qū)分互補序列、堿基錯配序列和非互補序列。上述實施例和圖式并非限定本發(fā)明的產(chǎn)品形態(tài)和式樣，任何所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通 技術(shù)人員對其所做的適當(dāng)變化或修飾，皆應(yīng)視為不脫離本發(fā)明的專利范疇。
權(quán)利要求
1.一種基于靛藍(lán)胭脂紅電化學(xué)聚合膜的DNA電化學(xué)傳感器，為具有工作電極、輔助電極和參比電極的三電極體系傳感器，其特征在于，該工作電極為共價固定了 5’ -末端修飾氨基的單鏈探針DNA后的靛藍(lán)胭脂紅聚合膜修飾玻碳電極。
2.如權(quán)利要求I所述的基于靛藍(lán)胭脂紅電化學(xué)聚合膜的DNA電化學(xué)傳感器，其特征在于，該輔助電極為鉬電極，該參比電極為Ag/AgCl電極。
3.一種制備如權(quán)利要求I或2中基于靛藍(lán)胭脂紅電化學(xué)聚合膜的DNA電化學(xué)傳感器的方法，其包括如下步驟①采用循環(huán)伏安法在玻碳電極修飾上靛藍(lán)胭脂紅聚合膜，得到聚靛藍(lán)胭脂紅修飾電極；②將聚靛藍(lán)胭脂紅修飾電極通過五氯化磷活化磺酸根得到磺酰氯基團，與5’-末端修飾氨基的單鏈探針DNA發(fā)生共價縮合作用，得到探針序列修飾電極；③將探針序列修飾電極與鉬電極和Ag/AgCl電極一起形成三電極體系電化學(xué)DNA傳感器。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在步驟①中，該玻碳電極在采用循環(huán)伏安法修飾靛藍(lán)胭脂紅聚合膜之前還經(jīng)過預(yù)處理步驟，該預(yù)處理步驟為采用粒徑為I. 0,0. 3和O. 05 μ m的a -Al2O3拋光粉打磨成鏡面后，再分別在丙酮、乙醇和二次水中超聲清洗3分鐘，重復(fù)2 3次，再將電極置于O. 5 mol/L的H2SO4溶液中用循環(huán)伏安法連續(xù)掃描至穩(wěn)定，掃描范圍-I. (Γ+1. O V。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，該步驟①為將經(jīng)過預(yù)處理過的玻碳電極置于含5 mmol/L靛藍(lán)胭脂紅的pH7. O混合磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安法掃描電聚合，聚合電位-O. Γ+1. 8 V，掃速20 mV/s，掃描段數(shù)為10段；聚合完后在混合磷酸鹽緩沖液中浸泡5分鐘并用二次蒸餾水洗滌，得到聚靛藍(lán)胭脂紅修飾電極。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，該步驟②為將聚靛藍(lán)胭脂紅修飾電極在40mmol/L五氯化磷丙酮溶液中浸泡30分鐘活化磺酸根得到酰氯化磺酸基團后，取10 μ L、I X 10_6 mol/L的5’ -末端修飾氨基的單鏈探針DNA滴于電極表面自然晾干，用TE緩沖液洗去未固定的5’ -末端修飾氨基的單鏈探針DNA得到探針序列修飾電極。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于靛藍(lán)胭脂紅電化學(xué)聚合膜的DNA電化學(xué)傳感器及其制備方法，該DNA電化學(xué)傳感器為具有工作電極、輔助電極和參比電極的三電極體系傳感器，該工作電極為共價固定了5’-末端修飾氨基的單鏈探針DNA后的靛藍(lán)胭脂紅聚合膜修飾玻碳電極。本發(fā)明具有響應(yīng)時間短、檢測限低、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好的特點。
文檔編號G01N27/26GK102914572SQ20121039456
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月17日
發(fā)明者汪慶祥, 張旋, 高鳳 申請人:漳州師范學(xué)院